基因工程第四章课时

基因工程第四章课时第1页，共65页，2023年，2月20日，星期一切接转增检基因工程内容和步骤第2页，共65页，2023年，2月20日，星期一基因克隆和DNA分析（第5版）

第一部分基因克隆和DNA分析的基本原理第1章为什么说基因克隆与DNA分析非常重要第2章基因克隆的载体——质粒和噬菌体第3章从活细胞中纯化DNA

第4章DNA纯化后的利用第5章将DNA引入活细胞第6章大肠杆菌的克隆载体第7章真核生物的克隆载体第8章怎样获得特定基因的克隆第9章聚合酶链反应（PCR）

第二部分基因克隆和DNA分析在研究中的应用第10章基因的位置和结构的研究第11章基因表达和功能的研究第12章基因组研究

第三部分基因克隆和DNA分析在生物技术中的应用第13章克隆基因的表达第14章基因克隆和DNA分析在医学中的应用第15章基因克隆和DNA分析在农业中的应用第16章基因克隆和DNA分析在法医学和考古学中的应用第3页，共65页，2023年，2月20日，星期一第4章DNA纯化后的利用DNA操作酶DNA连接酶DNA限制性内切酶第4页，共65页，2023年，2月20日，星期一4.1DNA操作酶的范围核酸酶（nuclease）连接酶（ligase）聚合酶（polymerase）修饰酶（modifyingenzyme）拓扑异构酶（topoisomerase）其它第5页，共65页，2023年，2月20日，星期一4.1DNA操作酶的范围4.1.1核酸酶：切开、切除或降解核酸分子的酶定义：打断DNA链中连接相邻核苷酸的磷酸二酯键第6页，共65页，2023年，2月20日，星期一4.1DNA操作酶的范围4.1.1核酸酶：切开、切除或降解核酸分子的酶分类：外切核酸酶和内切核酸酶从DNA分子的末端一个一个地切除核苷酸链在一个DNA分子内部打开磷酸二酯键第7页，共65页，2023年，2月20日，星期一4.1DNA操作酶的范围4.1.1核酸酶：切开、切除或降解核酸分子的酶外切核酸酶（单链或双链切割）-Bal31Bal31：同时对DNA分子的双链末端一个一个地切除核苷酸链越来越短单核苷酸第8页，共65页，2023年，2月20日，星期一4.1DNA操作酶的范围4.1.1核酸酶：切开、切除或降解核酸分子的酶外切核酸酶（单链或双链切割）-核酸外切酶Ⅲ核酸外切酶Ⅲ：可以从DNA双链中一条链的3′末端一个一个地切除核苷酸链产物：单链DNA分子（不能作用于单链分子）第9页，共65页，2023年，2月20日，星期一4.1DNA操作酶的范围4.1.1核酸酶：切开、切除或降解核酸分子的酶内切核酸酶（单链或双链切割）-S1核酸酶S1核酸酶：催化单链DNA分子降解成为5′单核苷酸作用于双链核酸分子的单链区，并从此处切断核酸分子第10页，共65页，2023年，2月20日，星期一4.1DNA操作酶的范围4.1.1核酸酶：切开、切除或降解核酸分子的酶内切核酸酶（单链或双链切割）-DNaseⅠDNaseⅠ（脱氧核糖核酸酶Ⅰ）

：打开DNA分子内部任意的磷酸二酯键（包括单链和双链）产物为单核苷酸与寡核苷酸或单核苷酸（可以用在RNA提取中去除DNA）第11页，共65页，2023年，2月20日，星期一4.1DNA操作酶的范围4.1.1核酸酶：切开、切除或降解核酸分子的酶内切核酸酶（单链或双链切割）-限制性内切酶限制性内切酶：能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶基因工程中主要工具酶-一把特殊的剪刀第12页，共65页，2023年，2月20日，星期一4.1DNA操作酶的范围4.1.2连接酶：将两个核酸分子连接起来的酶DNA连接酶DNA连接酶（ligase）：在一条DNA链的3′末端具有一个游离的羟基（-OH），和在另一条DNA链的5′-末端具有一个磷酸基团（-P）的情况下，能够催化在2条DNA链之间形成的磷酸二酯键第13页，共65页，2023年，2月20日，星期一4.1DNA操作酶的范围缺口（nick）裂口（gap）第14页，共65页，2023年，2月20日，星期一4.1DNA操作酶的范围4.1.3聚合酶：复制核酸分子的酶DNA聚合酶DNA聚合酶：能够合成一条与一直模板DNA或者RNA互补的新DNA双链要素：模版和引物第15页，共65页，2023年，2月20日，星期一4.1DNA操作酶的范围4.1.3聚合酶：复制核酸分子的酶种类很多，基因工程中常用到四种（1）DNA聚合酶Ⅰ（大肠杆菌）DNA聚合酶Ⅰ：当DNA双链分子中存在一个单链缺口时，DNA聚合酶与单链区域结合，合成一条新链，替换并降解原来存在的那段DNA具备DNA合成和水解双重酶活性第16页，共65页，2023年，2月20日，星期一4.1DNA操作酶的范围4.1.3聚合酶：复制核酸分子的酶（2）Klenow片段（DNA聚合酶Ⅰ一部分）DNA聚合酶Ⅰ的合成酶活性和水解酶活性是由酶分子的不同部分控制，其中酶分子前段325个氨基酸具有水解酶活性，切掉这一部分后，剩下的部分则只具有聚合酶活性，剩下的DNA聚合酶Ⅰ片段称为Klenow片段，在基因工程中可以用来补缺口第17页，共65页，2023年，2月20日，星期一4.1DNA操作酶的范围4.1.3聚合酶：复制核酸分子的酶（3）TaqDNA聚合酶（PCR）TaqDNA聚合酶是一种来源于嗜热菌Thermusaquaticus的高度热稳定的DNA聚合酶，95℃孵育时的半衰期大于40分钟第18页，共65页，2023年，2月20日，星期一4.1DNA操作酶的范围4.1.3聚合酶：复制核酸分子的酶（4）反转录酶（病毒，依赖于RNA的DNA聚合酶）反转录酶是以RNA为模版合成互补的DNA链（cDNA）第19页，共65页，2023年，2月20日，星期一4.1DNA操作酶的范围4.1.4修饰酶：去除或添加化学基团的酶（1）碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）碱性磷酸酶：去除DNA分子5‘末端的磷酸基团第20页，共65页，2023年，2月20日，星期一4.1DNA操作酶的范围第21页，共65页，2023年，2月20日，星期一4.1DNA操作酶的范围4.1.4修饰酶：去除或添加化学基团的酶（2）多核苷酸激酶（polynucleotidekinase）多核苷酸激酶：在DNA分子5‘游离末端添加磷酸基团（活性正好和碱性磷酸酶相反）第22页，共65页，2023年，2月20日，星期一4.1DNA操作酶的范围4.1.4修饰酶：去除或添加化学基团的酶（3）末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶：在DNA分子3‘末端添加一个或多个脱氧核苷酸构建人工粘性末端，不需要模板第23页，共65页，2023年，2月20日，星期一4.1DNA操作酶的范围4.1.5拓扑异构酶：向共价闭合环状DNA中引入或消除双螺旋的酶第24页，共65页，2023年，2月20日，星期一第25页，共65页，2023年，2月20日，星期一限制性内切酶的发现和功能限制性内切酶II在特定的核苷酸序列处切割DNADNA分子中识别序列的出现频率在实验室条件下进行限制性酶切对限制性内切酶的酶切结果进行分析DNA分子大小的估计4.2切割DNA的酶-限制性内切酶通过作图标出一个DNA分子上的不同限制性位点平末端和黏末端第26页，共65页，2023年，2月20日，星期一4.2切割DNA的酶-限制性内切酶准确可重复第27页，共65页，2023年，2月20日，星期一4.2.1限制性内切酶的发现和功能4.2切割DNA的酶-限制性内切酶20世纪50年代宿主调控性限制第28页，共65页，2023年，2月20日，星期一4.2.1限制性内切酶的发现和功能4.2切割DNA的酶-限制性内切酶第29页，共65页，2023年，2月20日，星期一1970年H.O.

Smith等分离出第一种限制性核酸内切酶。WernerArber理论预见限制酶DanielNathans用限制酶切得SV40DNA片断HamiltonO.Smith得到第一个限制酶1978年Nobel生理或医学奖4.2.1限制性内切酶的发现和功能4.2切割DNA的酶-限制性内切酶第30页，共65页，2023年，2月20日，星期一目前为止，在细菌中已经发现了1200多种限制性内切酶，分为三类：

其识别位点与切割位点相距1000-5000bp，切割位点不表现严格的特异性；2条链上的断裂位点相距70-75个核苷酸；

识别序列具有特异性，且序列为旋转对称性，切割位点位于限制性内切酶识别序列之内，限制性内切酶的功能核甲基化酶的功能分开；是基因工程中常用的内切酶；

由R、MS亚基共同组成，其中MS亚基具有位点识别和甲基化修饰的双重功能；R亚基具有内切酶活性。切割位点位于识别位点的一侧若干碱基对处，无序列特异性，而只与识别位点的距离有关，从7-26bp不等。在与识别位点结合之后，修饰作用和限制作用取决于两个亚基之间的竞争。限制性内切酶的分类4.2.1限制性内切酶的发现和功能4.2切割DNA的酶-限制性内切酶第31页，共65页，2023年，2月20日，星期一I和III型酶识别序列特点：

一般具有内切酶和甲基化酶的活性，

识别或切割位点不恒定，

不具备用来做工具酶，II型酶识别序列特点：

均有严格的识别特定核苷酸的序列，

识别的核苷酸序列一般在4－8个碱基对大多数识别位点具有180度旋转对称的结构形式4.2.1限制性内切酶的发现和功能4.2切割DNA的酶-限制性内切酶第32页，共65页，2023年，2月20日，星期一4.2切割DNA的酶-限制性内切酶4.2.2限制性内切酶II在特定核苷酸序列处切割DNA第33页，共65页，2023年，2月20日，星期一4.2切割DNA的酶-限制性内切酶4.2.2限制性内切酶II在特定核苷酸序列处切割DNA命名：400余种II类酶，鉴定的识别和切割位点有300多种，商品化100多种，DNA重组技术中常用的有20多种。其命名书写规则：以生物体属名的第一个大写字母和种名的前2个小写字母构成酶的基本名称；若酶在一个特殊菌株上发现，则将株名的第一个字母加在基本名称之后；若酶的编码基因位于噬菌体（病毒）或质粒上，则还用一个大写字母表示这些非染色体的遗传因子；酶最后的部分为罗马字母，表明该生物发现此酶的先后顺序。如HindIII表明在Heamophilusinfluenzaed菌株种发现的第3种酶；EcoRI表明在Escherichiacoli的抗药性R质粒上发现的第一个酶第34页，共65页，2023年，2月20日，星期一4.2切割DNA的酶-限制性内切酶4.2.2限制性内切酶II在特定核苷酸序列处切割DNA第35页，共65页，2023年，2月20日，星期一4.2切割DNA的酶-限制性内切酶4.2.2限制性内切酶II在特定核苷酸序列处切割DNAII型限制性核酸内切酶的基本特性识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的1800旋转对称型回文结构5‘…GCTGAATTCGAG…3’3‘…CGACTTAAGCTC…5’EcoRI的识别序列第36页，共65页，2023年，2月20日，星期一4.2切割DNA的酶-限制性内切酶4.2.2限制性内切酶II在特定核苷酸序列处切割DNA回文结构

如HindIII—AAGCTT—

—TTCGAA—HapII—CCGG—

—GGCC—Cfr13I—GGNCC—

—CCNGG—Eco81I—CCTNAGG—

—GGANTCC—NotI—GCGGCCGC—

—CGCCGGCG—第37页，共65页，2023年，2月20日，星期一4.2切割DNA的酶-限制性内切酶4.2.3平末端和黏末端第38页，共65页，2023年，2月20日，星期一4.2切割DNA的酶-限制性内切酶4.2.3平末端和黏末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’5‘…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPPstI等产生的3‘粘性末端第39页，共65页，2023年，2月20日，星期一4.2切割DNA的酶-限制性内切酶4.2.3平末端和黏末端同尾酶：有些来源不同的酶尽管其识别的序列不同，但是其切割出的DNA片段是有相同的粘性末端。第40页，共65页，2023年，2月20日，星期一4.2切割DNA的酶-限制性内切酶4.2.4DNA分子中识别序列的出现频率理论上：GATC每44=256个碱基

出现一次GGATCC每46=4096个碱基

出现一次实际上识别位点发生的频率从要小一点（如识别6个碱基的BamHI，BglII，SalI）第41页，共65页，2023年，2月20日，星期一4.2切割DNA的酶-限制性内切酶4.2.4DNA分子中识别序列的出现频率限制性酶切位点通常称不会均匀分布于DNA分子中第42页，共65页，2023年，2月20日，星期一4.2切割DNA的酶-限制性内切酶4.2.5在实验室条件下进行限制性酶切如何做一个酶切反应：（1）2ugDNA浓缩到125ug/ml（不高不低，纯）16ul（2）

限制性内切酶BglII（4U/ul）

一个酶单位（U）定义为一定温度（通常为37度）下1小时内切割1ugDNA所需要的酶量2ugDNA需要2U即4U/ulX0.5ul（3）

缓冲液（buffer）10X第43页，共65页，2023年，2月20日，星期一4.2切割DNA的酶-限制性内切酶第44页，共65页，2023年，2月20日，星期一4.2切割DNA的酶-限制性内切酶4.2.5在实验室条件下进行限制性酶切设计一个最普通的酶切体系总体系20ul10×bufferH2ul切割的DNA分子16ul限制性内切酶BglII

(4u/ul)0.5ulH2O其余用H2O补齐体系37℃2小时第45页，共65页，2023年，2月20日，星期一4.2切割DNA的酶-限制性内切酶4.2.5在实验室条件下进行限制性酶切影响限制性内切酶活性的因素：酶活定义：指在最适反应条件下（因酶而异，包括最适反应温度，最适缓冲条件），经过1小时反应将1ugDNA完全分解所需要的酶量，称为酶活单位；影响酶活的因素：DNA的纯度：限制性内切酶消化DNA底物的反应效率，很大程度上取决于所使用DNA本身的纯度，而DNA制剂中的某些物质，如蛋白质、酚、氯仿、酒精、EDTA以及SDS等都可以抑制酶的活性。如果DNA纯度不够，可以采用扩大反应体系来稀释杂质含量；酶切消化的反应温度：大多数限制性内切酶的标准反应温度是37℃，也存在许多例外条件，如BamHI30℃,AccIII60℃，TaqI65℃;在实际试验中,甲基化和星号活性是很少的.大多数切不开都与自己的体系或者DNA质量有关.第46页，共65页，2023年，2月20日，星期一4.2切割DNA的酶-限制性内切酶4.2.6对限制性内切酶的酶切结果进行分析标准电泳不能区分大小凝胶电泳可区分大小第47页，共65页，2023年，2月20日，星期一4.2切割DNA的酶-限制性内切酶4.2.6对限制性内切酶的酶切结果进行分析表3-1琼脂糖凝胶浓度与分辨DNA大小范围的关系琼脂糖凝胶浓度/（%） 可分辨的线性DNA大小范围/（kb）0.3 60~50.6 20~10.7 10~0.80.9 7~0.51.2 6~0.41.5 4~0.22.0 3~0.1更小的DNA片段区分可以使用聚丙烯酰胺凝胶电泳，40%聚丙烯酰胺凝胶电泳区分1-300bp的片段实验室通常操作的DNA片段在0.5-10kb左右，所以一般使用0.8-1%的琼脂糖凝胶基因组则一般使用0.5-0.7的的琼脂糖凝胶第48页，共65页，2023年，2月20日，星期一4.2切割DNA的酶-限制性内切酶4.2.6对限制性内切酶的酶切结果进行分析上样缓冲液：6×上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，30%甘油。（40%蔗糖）第49页，共65页，2023年，2月20日，星期一4.2切割DNA的酶-限制性内切酶4.2.6对限制性内切酶的酶切结果进行分析第50页，共65页，2023年，2月20日，星期一4.2切割DNA的酶-限制性内切酶4.2.6对限制性内切酶的酶切结果进行分析凝胶中DNA分子的可视化EB在紫外照射下能把DNA分子显示出来Gelred，SYBRGreen，Goldview等放射自显影（检测极微量的DNA）第51页，共65页，2023年，2月20日，星期一4.2切割DNA的酶-限制性内切酶4.2.7DNA分子大小的估计第52页，共65页，2023年，2月20日，星期一4.2切割DNA的酶-限制性内切酶4.2.8通过作图标出一个DNA分子上的限制性酶切位点第53页，共65页，2023年，2月20日，星期一4.2切割DNA的酶-限制性内切酶4.2.8通过作图标出一个DNA分子上的限制性酶切位点第54页，共65页，2023年，2月20日，星期一4.3连接-将DNA连接在一起第55页，共65页，2023年，2月20日，星期一4.3连接-将DNA连接在一起4.3.1DNA连接酶的作用模式第56页，共65页，2023年，2月20日，星期一5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5'GCTTAAAATTCG5'

5'

GCTTAA

5'5'

AATTCG5'

退火GCTTAAAATTCG5'

GCTTAA

5'

AATTCGGCTTAAAATTCG5'

GCTTAA

5'

AATTCGT4-DNAligaseGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAG第57页，共65页，2023年，2月20日，星期一4.3连接-将DNA连接在一