核酸扩增技术(下)V

主要内容第一节聚合酶链反应第二节其他PCR相关技术第三节实时/荧光定量PCR技术第四节PCR产物分析目前一页\总数八十五页\编于十四点4/28/20231LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce标准的PCR反应体系总体积XA0.1～1ugB各0.1～0.2umol/LC2.5uD各200umol/LE含

缓冲液

1.5mmol/LPCR扩增反应体系配制目前二页\总数八十五页\编于十四点4/28/20232LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForcePCR的程序编排与解读1234522557294时间（min）温度（℃）D3B1C2重复X步Y轮目的DNA片段扩增Z

倍以上A目前三页\总数八十五页\编于十四点4/28/20233LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce第三节实时/荧光定量PCR在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法Real-time/FluorescenceQuantitivePolymeraseChainReaction

目前四页\总数八十五页\编于十四点4/28/20234LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析。无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测（开盖检测“气溶胶”污染问题）。

实时/荧光定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析实时/荧光定量PCR的优势目前五页\总数八十五页\编于十四点4/28/20235LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce由于各反应管内PCR扩增效率的差异使得相同的样品扩增结果存在很大差异同时扩增96份相同样品的Ct值一样，最终产物量却差异巨大终点检测法定量的缺点目前六页\总数八十五页\编于十四点4/28/20236LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce荧光定量PCR实时检测的优点终产物量一样起始量不同目前七页\总数八十五页\编于十四点4/28/20237LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce普通和实时定量PCR的综合比较表项目普通PCR实时定量PCR检测方法终点检测实时检测准确性差好重复性差好安全性低高通量低高价格便宜昂贵目前八页\总数八十五页\编于十四点4/28/20238LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce荧光染料法

SYBRgreen:特异性结合双链，释放荧光信号荧光探针法

1.Taqman技术2.molecularBeacon技术3.复合探针法一、荧光定量PCR荧光标记物

目前九页\总数八十五页\编于十四点4/28/20239LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce（一）荧光染料法

SYBR荧光染料

SYBR荧光染料能特异性地掺入DNA双链，发出荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发出任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。此方法未使用目的特异性探针，其特异性完全由引物决定。在有非特异双链DNA产生时，其荧光也同样增强，此法与常规PCR的特异性差别不大。目前十页\总数八十五页\编于十四点4/28/202310LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForceSYBRGreen能结合到双链DNA的小沟部位SYBRGreen只有和双链DNA结合后才发荧光变性时，DNA双链分开，无荧光复性和延伸时，形成双链DNA，SYBRGreen发荧光，在此阶段采集荧光信号。SYBRGreen目前十一页\总数八十五页\编于十四点4/28/202311LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce

原理：未结合DNA的SYBR染料不发荧光，但只要掺入DNA双链，SYBR荧光染料能发射荧光，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加同步。SYBR荧光染料法

目前十二页\总数八十五页\编于十四点4/28/202312LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForceSYBRGreen法优缺点

对DNA模板没有选择性适用于任何DNA使用方便不必设计复杂探针非常灵敏便宜优点容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性,但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件对引物特异性要求较高缺点目前十三页\总数八十五页\编于十四点4/28/202313LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce（二）荧光探针法与目标序列互补5′端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，“不发”荧光，R与Q分开，发荧光Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，延伸时水解探针1．水解探针技术（Taqman技术）

目前十四页\总数八十五页\编于十四点4/28/202314LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForceTaqMan技术原理示意图3’端的荧光Q分子吸收5’端荧光R分子的荧光信号

探针5’端连接的荧光R分子被Taq酶切割下来

荧光R分子发出荧光,切割的荧光分子数与PCR数量成比例5’3’5’3’QRQ5’3’R5’3’激发5’3’5’3’激发RQ引物Taq酶目前十五页\总数八十五页\编于十四点4/28/202315LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce目前十六页\总数八十五页\编于十四点4/28/202316LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce

Taqman探针+UNG酶技术动画目前十七页\总数八十五页\编于十四点4/28/202317LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForceTaqMan法优缺点对目标序列的高特异性阴性结果确定设计相对简单与目标序列某一区域互补重复性比较好优点只适合一个特定的目标委托公司标记，价格较高不易找到本底低的探针缺点目前十八页\总数八十五页\编于十四点4/28/202318LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce

Taqman技术的延伸：TaqMan-MGB探针

针对Taqman探针荧光淬灭不彻底的问题，MGB探针，3‘端采用了非荧光性的淬灭基因——淬灭基团吸收报告基团的能量后并不发光，大大降低了本底信号的干扰。目前十九页\总数八十五页\编于十四点4/28/202319LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForceTaqMan-MGB探针示意图MGB:MinorGrooveBinder(Tmenhancer)MGBNFQR此外，MGB探针的3‘端还连接了一个三肽，可以大大稳定探针与模板的杂交,升高探针Tm值,使较短的探针同样能达到较高的Tm值——而短探针的荧光报告基团和淬灭基团的距离更近,淬灭效果更好，荧光背景更低，信噪比更高。目前二十页\总数八十五页\编于十四点4/28/202320LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce

将荧光供体分子和受体分子分别标记在两个不同的探针上，产生荧光供体探针和受体探针。与靶序列退火时，两探针的荧光供体和受体分子紧密相邻，发生FRET产生荧光。荧光强度与起始模板的量成正比，以此可进行PCR定量分析。2.杂交探针技术荧光的程度与起始模板数的量成正比ABB荧光受体A荧光供体目前二十一页\总数八十五页\编于十四点4/28/202321LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce3．Molecularbeacon技术(分子信标法)RQ激发RQQR激发发射分子灯塔形成茎环发夹结构,使荧光剂和淬灭剂紧密接触,导致荧光淬灭单链寡核苷酸探针由于与靶基因碱基序列互补而与之杂交探针5’和3’端分离,淬灭剂对荧光剂的淬灭作用消失,产生荧光工作原理发夹形的寡聚核苷酸探针

内部淬灭荧光团目前二十二页\总数八十五页\编于十四点4/28/202322LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce4．复合探针法（complexprobes）该法的基本原理是首先合成两个探针，一是荧光探针（25bp），5′端接一荧光分子，另一为淬灭探针（15bp），3′端接一淬灭分子，淬灭探针能与荧光探针5′端杂交。Q淬灭

Q淬灭探针R发光探针RR目前二十三页\总数八十五页\编于十四点4/28/202323LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce几种荧光定量PCR标记法的应用比较方法优点缺点适用范围SYBRGreenI染料法适用性广灵敏方便便宜引物要求高易出现非特异性带适合科研中对各种目的基因定量分析，基因表达量的研究，转基因重组动植物的研究TaqMan探针特异性高重复性好价格高只适合特定目标病原体检测，疾病耐药基因研究,药物疗效考核遗传疾病的诊断分子信标高特异性荧光背景低只适合特定目标设计困难价格高特定基因分析SNP分析目前二十四页\总数八十五页\编于十四点4/28/202324LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce我校配备的实时荧光PCR仪

ABI-Stepone

罗氏LightCycler

二、荧光定量PCR设备原理目前二十五页\总数八十五页\编于十四点4/28/202325LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForceABI7500荧光定量PCR仪

MJ公司Chromo4荧光定量PCR仪

Bio-rad公司iCycler荧光定量PCR仪普通实时荧光PCR仪目前二十六页\总数八十五页\编于十四点4/28/202326LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce普通实时荧光PCR仪信号采集示意目前二十七页\总数八十五页\编于十四点4/28/202327LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce离心式实时荧光PCR仪Rotor-Gene3000荧光定量PCR仪

RocheLightCycleTM荧光定量PCR仪

目前二十八页\总数八十五页\编于十四点4/28/202328LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce

离心式荧光定量PCR仪结构示意目前二十九页\总数八十五页\编于十四点4/28/202329LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce温度均一性较好；使用同一个激发光源和检测器，随时检测旋转到跟前的样品，有效减少系统误差；可容纳样品量少，需用特殊毛细管，增加使用成本，不带梯度功能。

Roche离心式实时定量PCR仪特点

目前三十页\总数八十五页\编于十四点4/28/202330LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce三、实时荧光PCR结果分析

31目前三十一页\总数八十五页\编于十四点4/28/202331LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce实时荧光PCR结果分析示例目前三十二页\总数八十五页\编于十四点4/28/202332LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce定量原理介绍三个概念：

扩增曲线、荧光阈值、Ct值如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析目前三十三页\总数八十五页\编于十四点4/28/202333LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce实时荧光PCR结果分析－－扩增曲线Cycle（循环数）Rn（荧光强度）BaselineLg－linerphase平台期荧光基团荧光检测元件扩增曲线图：横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度每个循环进行一次荧光信号的收集目前三十四页\总数八十五页\编于十四点4/28/202334LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce目前三十五页\总数八十五页\编于十四点4/28/202335LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce荧光信号阈值（threshold）：

前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍真正的信号:荧光信号超过域值荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是基线（背景）荧光信号的标准偏差的10倍。实时荧光PCR结果分析－－荧光阈值目前三十六页\总数八十五页\编于十四点4/28/202336LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForceCt值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。C(t)value实时荧光PCR结果分析－－Ct值目前三十七页\总数八十五页\编于十四点4/28/202337LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce实时荧光PCR结果分析－－Ct值的重现性38横轴：PCR反映循环数纵轴：荧光信号量Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值极具重现性。目前三十八页\总数八十五页\编于十四点4/28/202338LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce在反应体系中加入荧光分子，通过荧光信号的按比例增加来反应DNA量的增加，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。设定一个荧光阈值，得到样品的Ct值。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。

实时荧光PCR结果分析—小结目前三十九页\总数八十五页\编于十四点4/28/202339LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce临床检验中实时定量PCR两种目标目前四十页\总数八十五页\编于十四点4/28/202340LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce实时荧光定量PCR原理标准曲线模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线目前四十一页\总数八十五页\编于十四点4/28/202341LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce确定未知样品的C(t)值通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量Sample实时荧光定量PCR原理--绝对定量25目前四十二页\总数八十五页\编于十四点4/28/202342LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce阴性对照标准品待测样品绝对定量实验设置目前四十三页\总数八十五页\编于十四点4/28/202343LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce标准品(standard):例如质粒，做系列梯度稀释绘制标准曲线标准曲线：Y=a*log(X)+b目前四十四页\总数八十五页\编于十四点4/28/202344LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce用于测定样品间某个基因表达水平变化的差异倍数相对定量

两组样品：对照组和实验组两个基因：内参基因和目的基因不使用标准曲线，用△△Ct法计算目前四十五页\总数八十五页\编于十四点4/28/202345LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce对照组实验组目的基因内参基因相对定量实验设置目前四十六页\总数八十五页\编于十四点4/28/202346LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce对照组实验组目的基因Ct内参基因Ct34321819相对变化倍数=2-△△Ct△Ct(实验组)=Ct(目的基因)-Ct(内参基因)△Ct(对照组)=Ct(目的基因)-Ct(内参基因)△△Ct=△Ct(实验组)-△Ct(对照组)△△Ct法计算相对变化倍数目前四十七页\总数八十五页\编于十四点4/28/202347LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce荧光定量PCR技术的主要医学应用定性分析研究：杂合或纯合子鉴定，（SNPs）分析等绝对定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷贝数定量，GMO定量检测等相对定量研究：mRNA表达量分析，siRNA效果确认，差异显示结果验证等目前四十八页\总数八十五页\编于十四点4/28/202348LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce第四节

PCR产物分析目前四十九页\总数八十五页\编于十四点4/28/202349LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce

PCR扩增产物的检测与分析凝胶电泳1．琼脂糖凝胶电泳法琼脂糖凝胶电泳法的操作方法简单，能对PCR产物的长度进行粗略的鉴定，是应用最广泛的检测PCR产物的方法。不同浓度的凝胶分辨DNA的有效范围不同，如表所示：（一）PCR有效性和正确性

（二）PCR产物的定量和序列分析目前五十页\总数八十五页\编于十四点4/28/202350LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce琼脂糖浓度与分离线状DNA的有效范围琼脂糖含量(%)分离线状DNA的有效范围(kb)

0.51-300.70.8-121.00.5-101.20.4-71.50.2-32.00.1-2目前五十一页\总数八十五页\编于十四点4/28/202351LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce电泳分析目前五十二页\总数八十五页\编于十四点4/28/202352LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForcePCR产物的检测电泳分析目前五十三页\总数八十五页\编于十四点4/28/202353LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce2.聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）

特点：分辨力高，长度仅相差1bp的DNA分子即可分开；上样量远大于琼脂糖凝胶；回收的DNA纯度高(引物纯化)；采用银染色DNA或RNA，灵敏度高，比琼脂糖凝胶电泳中EB染色法高2-5倍，而且避免EB易退色弱点。用途：PCR扩增指纹图、多重PCR、PCR产物限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）分析。注意：相关试剂具有神经毒性。凝胶电泳目前五十四页\总数八十五页\编于十四点4/28/202354LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce丙烯酰胺浓度与分离DNA分子的有效范围丙烯酰胺(%)

有效分离范围(bp)溴酚蓝位置(bp)二甲苯蓝位置(bp)3.51000-20001004605.080-500652608.060-4004510012.040-200207015.025-150156020.05-1001245目前五十五页\总数八十五页\编于十四点4/28/202355LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce一、PCR-限制性片段长度多态性分析法（polymerasechainreactionbasedonrestrictionfragmentlengthpolymorphism，PCR-RFLP）不同的限制性核酸内切酶有具识别的特异DNA序列，所以用特定的限制性核酸内切酶对目的DNA分子进行消化，得到的酶切片段其大小和数量可以在一定程度上反应出目的DNA分子的序列信息用途：传染病病原体基因分型、人类基因的变异研究，是诊断遗传病和传染病病原体基因分型的常用方法PCR产物中点突变的分析目前五十六页\总数八十五页\编于十四点4/28/202356LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForcePCR-RFLP法

限制性内切酶恶性肿瘤癌基因或抑癌基因的突变检测Ras基因突变限制性内切酶目前五十七页\总数八十五页\编于十四点4/28/202357LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce二、等位基因特异性寡核苷酸分子杂交（ASO）

分别合成野生型和突变型探针，在等位基因DNAPCR扩增产物电泳分离后转移固定在膜上，分别与寡核苷酸探针杂交，可明确诊断是否有突变及突变是纯合子还是杂合子。其中，PCR产物不电泳分离，直接点膜杂交的叫斑点杂交。PCR产物中点突变的分析目前五十八页\总数八十五页\编于十四点4/28/202358LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce等位基因特异性寡核苷酸探针杂交原理

（AlleleSpecificOligonucleotide,ASO）突变探针正常探针

正常基因突变基因正常探针＋－突变探针－＋突变基因正常基因突变探针突变探针正常患者携带正常携带患者目前五十九页\总数八十五页\编于十四点4/28/202359LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce三、单链构型多态性分析法（PCR-SingleStrandConformationPolymorphism，简称PCR-SSCP）将PCR产物双链DNA（dsDNA）变性为单链DNA（ssDNA），加样于变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，由于DNA分子在凝胶中的电泳迁移率与其分子量和空间结构有关，而空间结构又与ssDNA序列有关。因此，电泳结束后，ssDNA带位置的差异即可反映出PCR产物序列的差异。PCR产物中点突变的分析目前六十页\总数八十五页\编于十四点4/28/202360LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForcePCR-SSCP过程示意

primer

↓32P-dNTP掺入PCR扩增产物

↓

变性↓

单链DNA↓中性聚丙烯酰胺凝胶电泳

↓12345自显影↓1.为正常结果分析2、4、5纯合患者3.为杂合子

.

解链构像DAN原理过程目前六十一页\总数八十五页\编于十四点4/28/202361LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForceDGGE原理：当温度达到熔点温度(Tm)时，DNA双链的部分区段解链。梯度增加凝胶内变性剂的浓度会促使双链DNA解链，在凝胶中形成迁移率下降的分支分子。四、变性梯度凝胶电泳DGGE

PCR产物中点突变的分析通常在均一的运行温度（50-65°C）和尿素与甲酰胺线性变性梯度条件下即形成变性环境，梯度以垂直或平行于电泳方向形成。DGGE是灵敏的突变检测方法，其效率可达99%。目前六十二页\总数八十五页\编于十四点4/28/202362LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce垂直变性梯度凝胶电泳DGGE（一）凝胶的变性梯度方向与电泳方向垂直：

从乳腺癌扩增p53基因6号外显子的野生型和突变型等位基因，通过垂直DGGE分离。目前六十三页\总数八十五页\编于十四点4/28/202363LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce平行变性梯度凝胶电泳DGGE

p53基因8号外显子的野生型和突变型等位基因在平行梯度（40–65%变性剂）DGGE凝胶上。左道，突变型等位基因；中，野生型等位基因；右，突变型与野生型等位基因。（二）凝胶的变性梯度方向与电泳方向平行：

目前六十四页\总数八十五页\编于十四点4/28/202364LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce五、熔点曲线－SYBRGreenI染料法将温度与荧光强度的变化求导(-dI/dT)原始图谱对数图谱PCR产物中点突变的分析目前六十五页\总数八十五页\编于十四点4/28/202365LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce熔点曲线－－

SYBRGreenI染料法熔点曲线分析，单一峰无非特异性荧光：单一特异产物熔点曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光：多个不同产物目前六十六页\总数八十五页\编于十四点4/28/202366LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce“双脱氧－ddNTP”

六、PCR产物测序分析（直接或克隆后测序）

正常PCR产物中点突变的分析目前六十七页\总数八十五页\编于十四点4/28/202367LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce小结：PCR产物的检测与分析（一）PCR有效性和正确性

琼脂糖凝胶电泳法（二）PCR产物的定量和序列分析

琼脂糖凝胶电泳法、聚丙烯酰胺凝胶电泳PCR产物中点突变的分析：

PCR-RFLP,ASO,SSCP,DGGE,熔点曲线分析，测序分析目前六十八页\总数八十五页\编于十四点4/28/202368LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce第五节

临床基因扩增检验的质量管理目前六十九页\总数八十五页\编于十四点4/28/202369LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForcePCR的特点及应用灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达3个RFU细菌检测的最小检出率为3个细菌简便、快速一次性加好反应液，2～4小时完成扩增扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA目前七十页\总数八十五页\编于十四点4/28/202370LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce一、临床PCR实验诊断的基本要求1．应该建立实验制度，其中包括《标本采集、接收、存放及处理制度》、《临床基因诊断实验室作制度》、《消毒及防止污染制度》。2．每个基因检测项目均建立操作及质量控制手册。3．建立各级人员的工作职责；设立专业技术主管。4．PCR实验室必备的条件不得缺少，否则不能开展临床基因实验诊断工作。5．临床基因诊断实验室禁止无关人员出人，实验室主要通道出入口及各功能区域门口，应有“禁止入内”和“生物污染”等字样及标志。目前七十一页\总数八十五页\编于十四点4/28/202371LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce二.PCR操作程序标准化

（一）上岗人员培训制度（二）标准化PCR诊断实验室（三）PCR标准化操作程序1．试剂配制、分装及保存2．标本的采集与处理3．基因扩增及其实验条件的选择4．扩增产物检测5．PCR结果的判读

（四）污染的预防及污染源的标准化处理目前七十二页\总数八十五页\编于十四点4/28/202372LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForcePCR实验中污染的预防

①严格执行各项规章制度，按规程进行实验操作；②实验时，必须戴一次性手套（处理标本时需戴乳胶手套），并随时更换；③工作衣、手套及实验用器材应分区固定使用；④不在PCR实验室从事分子克隆实验，不得在室内从事与实验无关的事宜；⑤保持地面及桌面整洁，保持室内温度恒定，室内禁止使用电风扇。目前七十三页\总数八十五页\编于十四点4/28/202373LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce①所有用于标本采集的容器及基因扩增管等模板或扩增产物污染的物品，应置于1mol／L盐酸中临时存放，以减少室内气溶胶形成；标本扩增后产物及一次性使用物品等实验材料，实验完毕密封包装（包装袋应有明显的生物污染标记），进行高压消毒并焚烧；对于不能进行高压消毒等方法处理的重复使用物品或器具，如塑料试管架等，可以用一般或专门消毒液浸泡消毒，如2％~10％的84′消毒液；超净工作台使用前，紫外线灯消毒不少于20分钟，使用后先消毒液洗擦，再75％乙醇擦一次。PCR实验中污染源的标准化处理目前七十四页\总数八十五页\编于十四点4/28/202374LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce临床PCR实验诊断的其他注意事项--以实时荧光定量PCR检测为例目前七十五页\总数八十五页\编于十四点4/28/202375LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForce特异性一定要高，避免引物的错配和二聚体（同样发光）；引物设计的时候要尽可能设计在同一退火温度；

扩增子要跨内含子，避免微量基因组干扰；扩增子长度在80-250bp左右。注意事项一：引物设计特殊要求--因为qPCR检测太敏感目前七十六页\总数八十五页\编于十四点4/28