第五章基因工程载体

载体类型

基因工程所用的载体都经过人工重新构建细菌质粒载体噬菌体衍生载体Cosmid载体（粘粒）噬菌体M13衍生载体Phagemid载体酵母质粒载体真核病毒载体1目前一页\总数七十页\编于十六点克隆载体与表达载体克隆载体：携带外源DNA进入受体细胞并使外源DNA大量扩增。表达载体：表达外源基因编码的蛋白质，载体克隆位点的上游应含有启动子，下游含有转录终止序列。2目前二页\总数七十页\编于十六点第一节.质粒Plasmid质粒是存在于细菌细胞染色体外、能自主复制的小分子环状双链DNA分子。又称为cccDNA（CovalentlyClosedCircularDNA）。3目前三页\总数七十页\编于十六点野生型质粒的大小一般在2-200Kb

基因工程常用质粒在2-4Kb之间质粒并不是细菌生长所必须的，但可为宿主执行一定的遗传功能，如抗生素的抗性、重金属离子的抗性、细菌毒素的分泌等。4目前四页\总数七十页\编于十六点质粒

(plasmid)5目前五页\总数七十页\编于十六点1.质粒类型:

严紧型质粒(stringentplasmid) 1-5个拷贝/细胞

松弛型质粒(relaxedplasmid):

数十个/细胞 质粒在细胞中的拷贝数有时与寄主的种类有关。6目前六页\总数七十页\编于十六点2.质粒载体必须具备的条件（1）分子量相对较小，能在细菌内稳定存在，有较高的拷贝数。（2）具有一个以上的遗传标志，便于对宿主细胞进行选择，如抗生素的抗性基因，β-半乳糖苷酶基因（LacZ）等。7目前七页\总数七十页\编于十六点（3）具有多个限制性内切酶的单一切点，便于外源基因的插入。如果在这些位点有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。8目前八页\总数七十页\编于十六点质粒性质不相容性（不亲和性）具有相同或相似复制子结构及特征的两种不同质粒，不能稳定的存在于同一受体细胞内，这种现象称作质粒的不相容性。

9目前九页\总数七十页\编于十六点3.质粒载体的选择性标记抗菌素抗性新陈代谢特性10目前十页\总数七十页\编于十六点

抗菌素名称抗菌素作用方式宿主菌抗性机理氨苄青霉素（Amp）干扰细菌细胞壁合成

编码-内酰胺酶,切割Amp

-内酰胺环氯霉素（Cml）抑菌剂,与50S结合,干扰编码乙酰转移酶,使氯霉素蛋白质合成乙酰化失活卡那霉素（Kan）杀菌剂,与70S结合,mRNA编码氨基糖苷磷酸转移酶,

发生错读修饰Kan失活链霉素（Sm）杀菌剂,与30S结合,mRNA编码特异修饰酶

发生错读四环素（Tet）抑菌剂,与30S结合，阻止编码特异蛋白,修饰细菌膜蛋白合成结构,阻止Tet通过细胞膜11目前十一页\总数七十页\编于十六点复制起点氨苄青霉素抗性基因12目前十二页\总数七十页\编于十六点常用的质粒载体

1.

pBR322

2.ｐＢＶ220载体是我国预防医学科学院病毒研究所自行构建的大肠杆菌温控表达载体。

3.

pUC系列:如pUC118、pUC119，两者之间的差别在于多克隆位点不同。13目前十三页\总数七十页\编于十六点14目前十四页\总数七十页\编于十六点15目前十五页\总数七十页\编于十六点16目前十六页\总数七十页\编于十六点4.融合表达载体如GST融合表达系统。载体中含有细菌的谷胱甘肽巯基转移酶（GST）基因，外源基因克隆在GST基因的下游。当基因表达时，表达产物为GST与目的蛋白的融合体。17目前十七页\总数七十页\编于十六点融合表达载体的优点表达效率高融合蛋白易纯化：抗GST的蛋白质作为特异性抗体，用亲和层析法从细胞裂解液中纯化出融合蛋白；可从融合蛋白中分离出单一的外源蛋白质GST与外源蛋白之间克隆上蛋白酶的切割位点，可用适当的酶切割。

18目前十八页\总数七十页\编于十六点例如加装一段编码Ile-Glu-Gly-Arg寡肽序列的人工接头片断，该片断可被具有蛋白酶活性的凝血因子Ⅹa切割，从Arg后切开。目的蛋白中出现此种序列的可能性极小，因此该方法用途广泛。19目前十九页\总数七十页\编于十六点QIAexpress6His表达系统重组蛋白质的末端带有6个组氨酸残基，对带有Ni离子的层析介质有高度的亲和力，易于纯化。6个组氨酸残基质量小，不影响蛋白质的结构和功能，无需切除。6个组氨酸残基免疫原性差，重组蛋白可以直接用做抗原。20目前二十页\总数七十页\编于十六点

第二节噬菌体类

噬菌体是一类细菌病毒的总称，英文名为Bacteriophage,简称phage。噬菌体可以在脱离寄主细胞的状态下保持自己的生命，但必须依赖寄主细胞才能复制生长。21目前二十一页\总数七十页\编于十六点噬菌体（bacteriophage,phage）噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒。病毒的特性：个体微小，可以通过细菌滤器没有完整的细胞结构，由蛋白质和核酸组成专性细胞内寄生的微生物可分为12个科22目前二十二页\总数七十页\编于十六点噬菌体的生物学性状23目前二十三页\总数七十页\编于十六点噬菌体的生物学性状形态个体小，需用电子显微镜观察蝌蚪形、微球形和丝形Theblackbarsaresizebarsrepresenting100nm.24目前二十四页\总数七十页\编于十六点25目前二十五页\总数七十页\编于十六点26目前二十六页\总数七十页\编于十六点

用作克隆载体的噬菌体有两类：一类是λ噬菌体，另一类是M13噬菌体。野生型λ噬菌体经过改造，已衍生出100多种克隆载体。λ噬菌体载体分为插入型和替换型(置换型)两类。目前应用较广的是EMBL系列、λgt系列和Charon系列等。

27目前二十七页\总数七十页\编于十六点λ噬菌体（lambdaphage)

λ噬菌体是可以感染细菌的病毒，是大肠杆菌的温和型噬菌体。由外壳蛋白与一个48.5kb的双链线状DNA分子组成。经过改造形成的λ噬菌体载体有较高的转化效率。28目前二十八页\总数七十页\编于十六点

在λ噬菌体DNA分子双链的5’端，各有一段由12个核苷酸组成的互补的单链凸出序列，即通常所说的黏性末端。在寄主细胞内，会通过黏性末端的互补作用，形成环型双链DNA分子。这种由黏性末端结合形成的双链区段称为cos位点。（cos:cohensiveendsite)29目前二十九页\总数七十页\编于十六点3‘CCCGCCGCTGGAGGGCGGCGACCT3’

在黏性末端的12个碱基中，有10个是GC。通过碱基配对线性分子环化起来，由此形成的双链区，叫做cos位点。30目前三十页\总数七十页\编于十六点

λ噬菌体基因组含50余个基因，功能相近的基因聚集成簇。有些基因对λ噬菌体的生长不是必须的，可以被外源DNA片段取代。

λ噬菌体上有56种限制性内切酶的识别位点，约300余切点。比如BamHI分别在第5505、22346、27972、34499和41732处有识别位点。

31目前三十一页\总数七十页\编于十六点λ噬菌体的生长途径

λ噬菌体有溶原和溶菌两种生长途径。溶原生长途径是指λ噬菌体的DNA整合在宿主染色体上，随宿主染色体的复制而复制。以原噬菌体的形式潜伏起来。一旦宿主细胞处于某种条件下时，λ噬菌体的DNA脱离染色体，重新进入溶菌生长途径。32目前三十二页\总数七十页\编于十六点溶菌生长是指λ噬菌体在宿主细胞中黏性末端连接，成为环形DNA分子，借用宿主细胞的体系，合成病毒包装所需的外壳蛋白，新复制的λDNA与外壳蛋白包装成新的病毒颗粒。宿主细胞膜在R蛋白和S蛋白的作用下破裂，释放出大量子代λ噬菌体颗粒，感染新的细胞。33目前三十三页\总数七十页\编于十六点λ噬菌体的生活史溶菌生长途径(lysispathway)溶源菌生长途径(lysogenicpathway)34目前三十四页\总数七十页\编于十六点M13噬菌体单链DNA,基因组含6407个碱基.经过基因改造后，形成M13mp系列。可容纳远大于自身基因组的外源DNA,(7倍).M13噬菌体感染细胞后,不裂解宿主细胞,但妨碍宿主细胞的生长,因此可见培养平板上的混浊噬菌斑.35目前三十五页\总数七十页\编于十六点噬斑36目前三十六页\总数七十页\编于十六点单链的M13噬菌体（＋）进入受体菌后，以自身为模板，复制出互补链（－），成为双链的结构，称为复制型DNA。复制型DNA在细胞内可达200个拷贝。此时，（＋）链被特异的蛋白质阻断，不再生成新的（－）链。只能生成新的（＋）链。（＋）链DNA被壳蛋白包装组成病毒颗粒，挤出宿主细胞。37目前三十七页\总数七十页\编于十六点科斯质粒载体（cosmid）

又称粘粒载体，简称粘粒。环形双链DNA分子，一般为4～6Kb。 该载体含有λDNA的cos序列（不少于280个bp）和pBR322质粒的序列。该载体转化效率高。可容纳高达45kb的外源DNA。以感染方式进入宿主细胞,在宿主体内象质粒那样复制.38目前三十八页\总数七十页\编于十六点粘粒载体可像质粒一样在细菌中繁殖，有的（pWE15/16）可以在哺乳动物中繁殖。又能像λDNA一样体外包装，并高效导入受体细胞。属松弛型质粒，拷贝数较多。39目前三十九页\总数七十页\编于十六点40目前四十页\总数七十页\编于十六点农杆菌Ti质粒根癌农杆菌含有一种内源质粒，当农杆菌与植物接触时，这种质粒会引发植物产生肿瘤，故名Ti质粒（tumorinducingplasmid）。Ti质粒为双链环状DNA分子，200～250Kb之间。Ti质粒进入植物细胞的只是一小部分，约25kb，称为T-DNA（transferDNA）。41目前四十一页\总数七十页\编于十六点T-DNA两端各有一个25bp的正向重复序列，在不同的Ti质粒中是高度保守的，该序列对于T-DNA的转移和整合是不可缺少的。利用大肠杆菌质粒与T-DNA的部分序列重组，构建Ti质粒克隆载体，可用于植物细胞的基因转移。42目前四十二页\总数七十页\编于十六点

第三节酵母细胞基因工程载体酵母是最简单的单细胞真核生物。酵母可对表达的多肽链进行加工和修饰，如二硫键的正确形成、糖基化、除去N－端的甲硫氨酸等。43目前四十三页\总数七十页\编于十六点酵母菌的克隆载体YIP酵母整合型质粒YRP酵母复制型质粒YEP酵母附加子型载体CIP酵母菌着丝粒型质粒44目前四十四页\总数七十页\编于十六点上述质粒均可在大肠杆菌和酵母菌中稳定存在，即所谓的穿梭质粒。这些质粒含有两种可供筛选的选择性标记。45目前四十五页\总数七十页\编于十六点YIp载体URA3乳清苷酸脱羧酶46目前四十六页\总数七十页\编于十六点

酵母菌表达载体

1.选择性标志

当使用大肠杆菌做为宿主细胞时，多使用抗生素抗性作为筛选标志。由于酵母菌对许多抗生素不敏感，故需要其他的筛选标志。

野生型基因：URA3（尿嘧啶）、LEU2、HIS3、TRP1（色氨酸）

这些基因可补偿酵母菌细胞中某一种特定的代谢缺陷（营养缺陷）

47目前四十七页\总数七十页\编于十六点2.启动子含有可被RNA聚合酶II识别的酵母启动子

GAL、GAL10（半乳糖激酶）

PHO5（碱性磷酸酶）

ADH（醇脱氢酶）

TP1（丙糖磷酸异构酶）

PGK（磷酸甘油酸激酶）

GAP（磷酸甘油醛脱氢酶）

SUC（蔗糖酶）48目前四十八页\总数七十页\编于十六点注释：细胞内某些蛋白质丰度较高，如PGK（磷酸甘油酸激酶）、GAP（磷酸甘油醛脱氢酶），各占细胞总蛋白的5%，属于高含量的蛋白质，它们的启动子为强启动子。49目前四十九页\总数七十页\编于十六点酵母分泌型表达载体这类载体可以使目的蛋白分泌到细胞外。载体内除含有一般表达质粒的必要成分外，还需有一个控制蛋白质分泌的信号序列。其编码的多肽链叫做信号肽。信号肽内多含疏水性氨基酸。50目前五十页\总数七十页\编于十六点第四节哺乳动物细胞表达载体51目前五十一页\总数七十页\编于十六点病毒侵入动物细胞后，有两种生长状态

①溶细胞感染病毒在宿主细胞内合成自身的核酸和结构蛋白，装配成完整的子代病毒颗粒，释放到细胞外，扩大感染，宿主细胞因为代谢障碍而死亡。②整合性感染病毒核酸整合到宿主细胞的染色体中，随细胞DNA的复制而扩增。52目前五十二页\总数七十页\编于十六点病毒载体：（1）含有能够被真核细胞识别的有效启动子（2）在感染周期中能够持续复制，达到很高的拷贝数。（3）控制自己复制的元件（4）有些载体可高效稳定地整合到寄主基 因组上（5）外壳蛋白识别细胞受体，可将外源基 因高效导入受体细胞。53目前五十三页\总数七十页\编于十六点1.SV40病毒载体SV40：猿猴空泡病毒（Simianvacuolating virus40)

环型双链DNA分子，含5243bp。优点：1.感染率高；2.拷贝数高；3.转录产物 高；缺点：1.宿主范围窄；2.最终导致感染细胞死 亡； 3.制备耗时，成本较高。54目前五十四页\总数七十页\编于十六点SV40病毒载体的改建病毒的部分序列＋质粒的部分序列如PSV2包括病毒的复制起始区、早期启动子、 增强子序列、部分t抗原基因

pBR322的复制起始区、氨苄青霉素 抗性基因55目前五十五页\总数七十页\编于十六点

病毒-质粒载体病毒的早期区段和复制起点+大肠杆菌的质粒分子重组而成。例如：pC10＝早期区段和复制起点（多瘤病毒）＋质粒pBR322的部分区段这种载体既可在大肠杆菌中复制，也可在哺乳动物细胞中复制，称之为穿梭载体。56目前五十六页\总数七十页\编于十六点改造后的病毒优缺点

优点：1.不需病毒颗粒的包装过程，故可插入较大长度的DNA片段。2.不引起宿主细胞的裂解，可建立稳定传代的细胞株。3.整合到宿主细胞的染色体中，重组基因不会丢失。缺点：转染效率低于万分之一。57目前五十七页\总数七十页\编于十六点受纳细胞：SV40感染CV-1或AGMK猿猴细胞后，产生感染性病毒颗粒，并使宿主细胞裂解，这种感染称为裂解感染，而猿猴细胞则称为受纳细胞。58目前五十八页\总数七十页\编于十六点非受纳细胞：SV40感染仓鼠细胞后，不产生感染颗粒，病毒基因组整合到宿主细胞染色体上，细胞被转化（癌变），这种啮齿类动物细胞为SV40病毒的非受纳细胞。59目前五十九页\总数七十页\编于十六点逆转录病毒载体逆转录病毒是一类单链RNA病毒。宿主范围广，感染动物或人的细胞。感染效率高，理论上可达100％。具有强启动子。不引起宿主细胞的死亡，可以维持许多代存在问题：1.容量小，低于10kb。

2.可能引起细胞癌变。60目前六十页\总数七十页\编于十六点腺病毒载体（AV）

线性双链DNA病毒，经过改造的腺病毒载体，缺失了大部分的病毒基因，更加安全。

61目前六十一页\总数七十页\编于十六点优点：①基因组大，可插入大片段的外源基因，最多可达35kb；②可高效的感染不同类型的人体组织细胞；③进入细胞内不整合进宿主的基因组，仅瞬间表达。缺点①免疫原性强，可刺激机体产生免疫反应；

②几乎可感染所有的细胞，缺乏特异性。62目前六十二页\总数七十页\编于十六点腺相关病毒载体（AAV）：属于非致病的微小病毒科家族的成员，只有依赖于辅助病毒才能繁殖。特点：基因组小，只有几个kb；无致病性；免疫原性弱；装载外源基因容量小，不超过5kb；制备过程复杂；63目前六十三页\总数七十页\编于十六点痘苗病毒载体：痘苗病毒是动物病毒中最大的一种，与天花病毒有密切的亲缘关系。长期被用作预防天花的疫苗。病毒基因组中有很大的非必需区（28kb），可以切除，代之以较大的外源基因，或者同时插入几个外源基因，构成多价疫苗。64目前六十四页\总数七十页\编于十六点哺