蛋白质药物的PEG化学修饰

蛋白质药物(yàowù)的PEG化学修饰

胡涛中国科学院过程工程研究所生化工程国家(guójiā)重点实验室第一页，共44页。1 1.迅速被体内酶降解 2.肾小球过滤去除 3.抗原－抗体反响 4.溶解度差导致(dǎozhì)沉淀蛋白质药物(yàowù)在使用中出现的问题TC实际浓度理想浓度第二页，共44页。2体外聚乙二醇修饰(xiūshì)〔PEG化〕(1)增大药物分子量，防止被肾小球过滤(2)阻碍蛋白酶的降解作用(3)屏蔽药物的免疫位点(4)增加(zēngjiā)药物在体液中的溶解度(5)与药物间的化学键在体内随时间水解，缓慢释放药物+蛋白(dànbái)或多肽偶联物聚乙二醇CH3(-O-CH-CH)n-OH第三页，共44页。3分离工程反应工程剂型工程生物医药生物能源(néngyuán)生物材料生物化学品其它产品生化工程(gōngchéng)

〔生物化学工程(gōngchéng)，BiochemicalEngineering〕第四页，共44页。4目录PEG修饰(xiūshì)的国内外研究进展PEG修饰(xiūshì)剂的研发PEG修饰(xiūshì)方法PEG修饰(xiūshì)工艺的优化PEG修饰(xiūshì)产物的质量控制第五页，共44页。5一、PEG修饰(xiūshì)的国内外研究进展第六页，共44页。6国际(guójì)上PEG修饰技术的研究进展美国Rutgers大学Davis教授70年代的工作甲氧基PEG的应用美国Enzon公司美国最早从事PEG修饰蛋白质药物的公司美国Shearwaters公司各种(ɡèzhǒnɡ)PEG修饰剂的生产商美国罗氏、先灵宝雅、安进PEG药物：PEG-INF，PEG-G-CSF其它：辉瑞、默克、葛兰素史克、施贵宝。。。第七页，共44页。7国内PEG修饰(xiūshì)技术的研究进展国家863重大机密工程：人工血液代用品的研制，1997-2000中国科学院重点工程：血液代用品和血液净化，2001-2005国家重大科技专项课题?创新(chuàngxīn)药物和中药现代化?：长效基因工程蛋白质和多肽制剂关键技术，2002-2005国家863重点工程课题：核酸和多肽的修饰和剂型化技术，2007-2010PEG修饰血红蛋白：I期临床〔中科院过程所、凯正公司〕PEG修饰G-CSF：III期临床〔格兰百克〕第八页，共44页。8修饰(xiūshì)粒细胞集落刺激因子〔rhG-CSF〕 延长半衰期修饰(xiūshì)人肿瘤坏死因子 消除副作用修饰(xiūshì)白介素I受体拮抗剂〔rhIL-1Ra〕 延长半衰期修饰(xiūshì)牛胰核糖核酸酶〔RNase〕 提高抗肿瘤活性修饰(xiūshì)超氧化物歧化酶〔SOD〕 提高半衰期修饰(xiūshì)天冬酰氨酶〔Aspartase〕 克服免疫原性 提高半衰期修饰(xiūshì)人干扰素〔IFN〕 提高半衰期修饰(xiūshì)血红蛋白〔Hb〕 血液代用品修饰(xiūshì)胰岛素 提高半衰期我国在PEG修饰蛋白质方面的一些(yīxiē)工作第九页，共44页。9二、PEG修饰(xiūshì)剂的研发第十页，共44页。10Sc-PEG专利(zhuānlì)分析以PEG-OH为原料的必然(bìrán)途径CH3OCH2CH2(OCH2CH2)nOH+光气(ɡuānɡqì)+NHSCH3OCH2CH2(OCH2CH2)nO-C-O-N

+NH2——G-CSFOOOCH3OCH2CH2(OCH2CH2)nO-C-NH——G-CSF

O单链修饰：(SC-PEG)第十一页，共44页。11Roche公司(ɡōnɡsī)的长效干扰素产品专利分析同样是以PEG-OH为原料(yuánliào)的必然途径双链修饰(xiūshì)：第十二页，共44页。12新的修饰(xiūshì)策略采用新方法制备(zhìbèi)新的修饰剂以PEG-COOH〔CM-PEG)为原料(yuánliào)的必然途径，已获专利CH3(OCH2CH2)nOCH2CH2OHCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-O-N+NH2——G-CSFOOO单链修饰：CH3(OCH2CH2)nOCH2COOHCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NH——G-CSFO(CM-PEG)第十三页，共44页。13我们(wǒmen)的策略以PEG-COOH为原料的必然(bìrán)途径CH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NHOOO双链修饰(xiūshì)：CH3(OCH2CH2)nOCH2COOH+LysineOCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NH-O(CH2)3CH2CH-C-O-N+NH2——IFNCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NHOOCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NH-O(CH2)3CH2CH-C-NH——IFN第十四页，共44页。141、PEG修饰剂的批量(pīliànɡ)制备取得了成功取得的主要进展分枝型ZL01141745.5分叉(长尾)型ZL03100736.8可逆型ZL03105003.4不可逆型200410029577.1ZL02120740.2异端基双官能团200410029577.1第十五页，共44页。15聚乙二醇修饰(xiūshì)剂产品产品号末端基团分子量包装（g）价格（￥）mPEG-OH5-OH5K100103500700mPEG-OH10-OH10K1001070001400mPEG-OH20-OH20K1001070001400mPEG-COOH5-COOH5K10010100002000mPEG-COOH10-COOH10K10010150003000mPEG-COOH20-COOH20K10010200004000MPEG-NHS5-N-羟基琥珀酰亚胺5K1001052000040002000MPEG-NHS10-N-羟基琥珀酰亚胺10K1001053000060003000MPEG-NHS20-N-羟基琥珀酰亚胺20K1001053500070003500第十六页，共44页。16三、药用蛋白(dànbái)的PEG修饰方法第十七页，共44页。17创新技术〔反响(fǎnxiǎng)器技术和产物移走技术〕①振荡(zhèndàng)反响器②流加反响(fǎnxiǎng)器③缓释反响器④固相反响方式⑥膜耦合反响方式⑤双水相反响方式Q.Yun,R.Yang,T.Chen,J.Bi,G.Ma,ZSu.J.Biotechnology,2005,118:67-74中国创造专利，申请号200510114930.0中国创造专利，申请号04100295771.修饰反响器设计—PEG-pellet反响器第十八页，共44页。18吸附蛋白加入PEGPEG修饰洗脱2.固相吸附(xīfù)法制备PEG修饰蛋白第十九页，共44页。19固相吸附(xīfù)法与液相吸附(xīfù)法的比较1峰：原蛋白(dànbái)；2峰：单修饰蛋白(dànbái)；3峰：多修饰蛋白(dànbái)第二十页，共44页。20PEG-INF的制备(zhìbèi)过程G-CSFPEG-G-CSFCH3(-O-CH-CH)n-OH甲氧基PEG（mPEG-OH）活化的mPEG-O-醛醛制备单修饰(xiūshì)的药用蛋白第二十一页，共44页。21粒细胞集落刺激(cìjī)因子(G-CSF)MW:18.8kd(174aminoacids)pI:6.1,1thiol,1N-terminal,4lysines,Halflife:5h,Weeklyinjection:7times第二十二页，共44页。22三批PEG30-rhG-CSF产品(chǎnpǐn)的制备取得的主要进展序号产品批号试制日期试制量12007080012007-8-5~2007-8-15共3750mg：6mg/支，302支；3mg/支，210支；1.5mg/支，520支；6.6mg/ml，80ml22007090012007-9-8~2007-9-18共1263mg：3mg/支，400支；3.15mg/ml，20ml32007100012007-10-9~2007-10-21共1422mg：3mg/支，400支；3.4mg/ml，65ml。PEG化重组(zhònɡzǔ)人生长激素，批产量1-10g；PEG化降纤酶，批产量6000支；环孢素A眼用微乳制剂，批产量5000支PEG化G-CSF2L修饰反响(fǎnxiǎng)器计算机程序控制批产量>3g生产周期10天第二十三页，共44页。23修饰和剂型化产品质量到达国际(guójì)先进水平生产规模产品质量批次稳定性123123123(A)(B)(C)以分子量为30kDa的PEG修饰rhG-CSF为例：(A)三批产品的SDS检测(jiǎncè)图谱(B)三批产品的高效凝胶过滤检测(jiǎncè)图谱(C)三批产品的园二色检测(jiǎncè)图谱第二十四页，共44页。244.引入巯基的方法制备(zhìbèi)PEG修饰蛋白(2)PEGylationSNH+(1)ThiolationHS-(CH2)3-C-NH-HbNH+NOOPEG-S-(CH2)3-C-NH-HbNH+OPEGNO2-iminothiolaneNH2-Hb第二十五页，共44页。25Sangart公司是一家(yījiā)私营的生物制药公司，主要从事氧载体的研发和产业化Hemospan

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MP4

PhaseI–Sweden

Status:CompletePhaseIb/II–Sweden

Status:CompletePhaseII–Sweden

Status:CompletePhaseII–USA

Status:Enrollment

CompletePhaseIII–Europe

Status:Enrollment

Complete第二十六页，共44页。26该PEG修饰产物的凝胶过滤(guòlǜ)分析第二十七页，共44页。27四、PEG修饰(xiūshì)工艺的优化第二十八页，共44页。28PEG修饰(xiūshì)反响参数的优化建立反响(fǎnxiǎng)动力学，包括位点反响(fǎnxiǎng)动力学和蛋白分子反响(fǎnxiǎng)动力学，优化反响(fǎnxiǎng)时间优化反响(fǎnxiǎng)的pH值优化PEG与蛋白的摩尔比优化反响(fǎnxiǎng)体系第二十九页，共44页。29pTimeppppp…………蛋白分子的修饰(xiūshì)反响动力学WeijunLi,ZhiguoSu.Quantitativelyinvestigatingmonomethoxypolyethyleneglycolmodificationofproteinbycapillaryelectrophoresis,J.Biochem.Biophys.Methods.2004，59:65-74第三十页，共44页。30PEG修饰(xiūshì)的位点反响动力学第三十一页，共44页。31PEG醛修饰(xiūshì)药用蛋白的优化反响第三十二页，共44页。32单修饰(xiūshì)产物的别离纯化

P1P2第三十三页，共44页。33别离(biélí)产物分析6.514.3

29.0

66.420.1116

200KDa44.3

P1P2P1凝胶过滤(guòlǜ)分析第三十四页，共44页。34膜耦合修饰工艺(gōngyì)制备PEG化药用蛋白第三十五页，共44页。35五、PEG修饰产物(chǎnwù)的质量控制第三十六页，共44页。36IEF和SDS鉴定(jiàndìng)PEG修饰蛋白1234+-IodinestainComassiebluestainSDSIEF1:Marker,2:HbA,3:-Hb4:(Propyl-PEG5K)6-Hb5:(Propyl-PEG5K)6--Hb1:HbA,2:-Hb3:(Propyl-PEG5K)6-Hb4:(Propyl-PEG5K)6--Hb

1

2

3

4

4

5

5

94.0

66.2

43.0

31.0

20.1

14.4

第三十七页，共44页。37RP-HPLC分析(fēnxī)胰蛋白酶切片段第三十八页，共44页。38质谱分析胰蛋白酶(yídànbáiméi)切片段MALDI-TOF/TOF分析(fēnxī)PEG修饰位点在Val-1()第三十九页，共44页。39PEG修饰蛋白(dànbái)的结构鉴定圆二色光谱(guāngpǔ)鉴定荧光光谱(guāngpǔ)鉴定第四十页，共44页。40RP-HPLC分析(fēnxī)PEG修饰蛋白第四十一页，共44页。41蛋白质修饰(xiūshì)剂及其制备方法和用途,中国创造专利，制备分枝型聚乙二醇的新方法,中国创造专利，带PEG长尾的蛋白质修饰(xiūshì)剂的制法和用途,中国创造专利，聚乙二醇羧酸的制备方法和其用途,中国创造专利，ZL重组人复合干扰素-聚乙二醇偶联物的制备及其偶联产物,中国创造专利，ZL2一种蛋白质交联剂及其交联方法,中国创造专利，一种分级别离制备血红蛋白偶联物的方法,中国创造专利，一种二醇聚合物—动物血红蛋白偶联物的制备方法,中国创造专利，一种二醇聚合物—动物血清白蛋白偶联物的制备方法,中国创造专利分子量均一的聚合物血红蛋白的制备方法,中国创造专利ZL01136190.5.血红蛋白--人血清白蛋白偶联物制备血液代用品及其制备方法,中国创造专利，Z蛋白质修饰(xiūshì)国家创造专利11项〔已授权〕第四十二页，共44页。42PEG修饰(xiūshì)的SCI论文QYun,TChen,GZhang,JBi,GMa,ZSu.Anovelpolyethyleneglycolderivativesuitableforthepreparationofmono-PEGylatedprotein.BiotechLett,27,213-217,2005QYun,RYang,TChen,JBi,GMa,ZSu.ReproduciblepreparationandeffectiveseparationofPEGylatedrecombinanthumangranulocytecolony-stimulatingfactorwithnovel“PEG-pellet〞PEGylationmodeandion-exchangechromatography.JBiotech.2005,118:67-74QYun,MHe,WXing,JBi,GMa,ZSu,Anoveltetrafunctionalreagentforsimultaneousintramolecularandintermolecularcross-linkingofbovinehemoglobin,BiotechLett26:1359-1363,2004.XLi,FMeng,GMa,ZSu,Asimpleandefficientmethodforsynthesisofcarboxymethylatedpolyet