蛋白质免疫印迹技术及常见问题演示文稿

蛋白质免疫印迹技术及常见问题演示文稿目前一页\总数二十七页\编于十八点优选蛋白质免疫印迹技术及常见问题目前二页\总数二十七页\编于十八点

WesternBlot原理简介

WesternBlot一般流程

WesternBlot常见问题分析内容概要目前三页\总数二十七页\编于十八点

在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。WesternBlot原理目前四页\总数二十七页\编于十八点

目的蛋白的表达特性分析目的蛋白与其它蛋白的互作目的蛋白的组织定位目的蛋白的表达量分析WesternBlot的应用目前五页\总数二十七页\编于十八点

WesternBlot原理简介

WesternBlot一般流程

WesternBlot常见问题分析内容概要目前六页\总数二十七页\编于十八点WesternBlot流程蛋白样品的制备SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳转膜封闭一抗杂交二抗杂交底物显色目前七页\总数二十七页\编于十八点通过水溶法或有机溶剂制备总蛋白水溶液提取法针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂。有机溶剂提取法对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。通过层析或电洗脱法制备目的蛋白

蛋白样品的制备目前八页\总数二十七页\编于十八点蛋白样品的定量Bradford法考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，与蛋白结合后形成蓝色化合物，该化合物在595nm处有最大吸收值，化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比。TIANGEN产品

Bradford蛋白质定量试剂盒目前九页\总数二十七页\编于十八点不连续的电泳缓冲体系。SDS—蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳目前十页\总数二十七页\编于十八点凝胶成分N,N’-亚甲双丙烯酰胺和丙烯酰胺SDS配胶的Tris缓冲液TEMED过硫酸铵Tris-甘氨酸电泳缓冲液目前十一页\总数二十七页\编于十八点凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度（％）线性分离范围（KD)1512-431016-687.536-945.057-212目前十二页\总数二十七页\编于十八点转膜膜的选择尼龙膜硝酸纤维素膜封闭非特异性抗体结合麻烦简单快速封闭非特异性抗体结合价格昂贵价格便宜特殊要求下的选择需要更高的蛋白结合率（尼龙膜：480µg/cm2

；硝酸纤维素膜：80µg/cm2

）目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱需要更大的机械强度目前十三页\总数二十七页\编于十八点湿法将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中，电转45min或过夜。半干法将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间，电转10－30min。

转膜方法目前十四页\总数二十七页\编于十八点丽春红S染色蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，换水几次。印度墨汁染色

只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探针的Western印迹过程。转膜后检测目前十五页\总数二十七页\编于十八点转膜后的封闭脱脂奶粉BSAWesternBlot膜封闭液（生物试剂公司提供）

把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤膜面积以0.1ml/cm2的量加入封闭剂，摇床上平缓摇动，于室温温育1-2小时。倒掉缓冲液，立即加入一抗溶液与滤膜温育。目前十六页\总数二十七页\编于十八点

一抗用量也根据0.1ml/cm2来计算，室温1-2小时。倒掉一抗溶液，用250mlPBS漂洗液滤膜3次，每次

10min。加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，室温温育

1-2小时。一抗、二抗孵育目前十七页\总数二十七页\编于十八点二抗与底物反应显色辣根过氧化物酶法碱性磷酸酶法化学发光显色法Anti－His目前十八页\总数二十七页\编于十八点应用举例：用Westernblot检测患者血清中的HIV病毒抗体Step1：经电泳将HIV混合抗原按分子量大小分离Step2：印迹转移已分离的抗原至硝酸纤维膜上，封闭Step3：加入待检病人血清，漂洗Step4：加入合适的、标记的二抗（HRP或AP），漂洗Step5：加入显色底物（或放射自显影），显色检测目前十九页\总数二十七页\编于十八点

WesternBlot原理简介

WesternBlot一般流程

WesternBlot常见问题分析内容概要目前二十页\总数二十七页\编于十八点Westernblot常见问题—SDS电泳胶不平？凝胶漏液？胶板洗刷干净加入AP和TEMED的量要合适加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀两块玻璃板底部要对齐QA目前二十一页\总数二十七页\编于十八点条带比正常的窄？“微笑”或“倒微笑”条带？凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适Westernblot常见问题—SDS电泳QA目前二十二页\总数二十七页\编于十八点凝胶肿胀或卷曲？条带歪斜或漂移？单个或多个白点？转膜缓冲液过热？

可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的纸片确保膜和胶块之间没有气泡缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温Westernblot常见问题—转膜及抗体检测QA目前二十三页\总数二十七页\编于十八点蛋白分子量<10KD蛋白的等电点=8SDS浓度不合适凝胶太厚蛋白分子量<10KD时，减少转膜时间；使用小孔径的膜更换高pH值Buffer在阴极buffer中加入0.005-0.01%SDS可提高转膜效率延长转膜时间Westernblot常见问题—蛋白转膜效率低AR目前二十四页\总数二十七页\编于十八点膜没有均匀浸湿膜或者缓冲液污染封闭不充分抗体与封闭剂出现交叉反应抗体浓度过高转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应杂交前检测一抗、二抗的工作浓度ARWesternblot常见问题—显色背景高目前二十五页\总数二十七页\编于十八点抗体保存不当抗原不充足膜的漂洗过度抗体长期保存应在－70℃，使用前做效价检测增加蛋白上样量，做已知标准量蛋白的对照减少漂洗的时间和次数Western