毕赤酵母实验操作手册

毕赤酵母表达试验手册大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简洁、产量高、生产本钱低。然而，很多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达构造简单的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依靠于形成正确的二硫键并折叠成高级包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进展变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了本钱。大肠杆菌是用得最多、争论最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是本钱低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，主更是由于酵母是单细胞真核生物，不但具有大肠杆菌易操作、生殖快、易于工业化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避开了产物活性低，包涵体变性、复性等等间题［1］。与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制〔Saccharomyces.Cerevisiae〕分培育基中维特质粒高拷贝数的选择压力消逝，质粒变同时，试验室用培育基简单而昂贵，承受工业规模能够承受的培育为抑制酿酒酵母的局限，人们进展了以甲基养分型酵母〔methylotrophicyeast〕为代表的其次代酵母表达系统［2］。〕为宿主的外源基因表达系统近年来进展最为快速，应用也最为广泛，已利用在于该系统除了具有一般酵母所具有的特点外，还有以下几个优点［1、2、3］；一。⑵表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合。〔即同源重组〕⑶菌株易于进展高密度发酵，外源蛋白表达量高。而且削减对细胞的毒害作用。Pichia.pastoris基因表达系统经过近十年进展，已根本成为较完善的外源基有效分泌并适当糖基化，培育便利经济等特点。利用强效可调控启动子AOX1，已高HBsAg、TNF、EGFC证明该系统为高效、有用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征FDACephelonFDA所以该系统被认为是安全的．Pichia.pastoris来越重要的作用，促进更多外源基因在该系统的高效表达，供给更为广泛的基因工程产品［2、3］。KM71HIS4。其位点被ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。Pichia.pastoris酵母菌体内无自然质粒，所以表达载体需与宿主染色体发生表达载体都是穿梭质粒，先需带有信号肽序列。pPICZαA自酿酒酵母的α-交配因子〔α-factor〕，能很好的到达以上的要求。并且作为Zeocin，给我们筛选转化子的工作带来很大的便利［1、2］。，它的主要特点简介如下：AOX1〔alcoholoxidase，醇氧化酶〕；Zeocin100％都有外源基因的整合，大大简化了重组转化，ZeocinpPICZαAAmp，经济而又简便；。A0X13’端终止序列；⑷分泌效率强的信号肽α-factor.Invitrogen醇氧化酶可调控的强启动子，能高密度发外源基因整合在酵母基因组上，可以稳定存在。同时，高胞外，不但提高表达蛋白的活性，而且，有利于产物的纯化。一．毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制各种母液的配制13.4%酵母根底氮源培育基〕4℃保存。34g根底氮源培育基〔无硫酸铵〕+100g1000ml120mg100ml中，过滤除菌。100H0.4%Histidine4℃1400mgL-100ml水中，〔50℃以促进溶解〕，过滤除菌。〕1200g1000ml15min〕25ml95ml菌。〕1100ml900ml高压灭菌或过滤除菌。L-L-L-L-L-100ml除菌。1M〔potassiumphosphatebuffer，pH6.0〕，1mol/LK2HPO4132ml1mol/LKH2PO4868mlpH6.0，如需调整pH，则使用磷酸和氢氧化钾调整pH。常用溶液及缓冲夜碱裂解法抽提质粒DNA所用溶液：50mmol/Lglucose，100mmol/LEDTA，25mmol/LTris－HCI(pH8.0)溶液Ⅱ：0.2mol／LNaOH，1％SDS〔临用时配制〕ddH2O100ml。4℃1.2.3Rnase-H2O：ddH2O。4℃1Mpotassiumphosphatebuffer〔pH6.0〕：132ml1MK2HPO4868ml1M1L〕：242gTris57.1mlAceticAcid37.2gEDTA二．毕赤酵母表达的培育基配制［5］2.1LB〔Luria－Bertani〕培育基：Tryptonl％YeastExtract0.5％NaCll％PH7.020minpPICZαATOP10FZeocin25ug/ml。培育基：Tryptonl％YeastExtract0.5％NaCl0.5％PH7.020min。可于室温保存数月。用于培育pPICZαATOP10F’时，参加Zeocin25ug/ml，可以4℃1～2周。YPD〔YEPD〕YeastExtractPeptoneDextroseMedium，〔YeastExtractPeptoneDextroseMedium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培育基〕Trypton2%dextrose(glucose)2%+agar2%+Zeocin100μg/mlYPD4℃可保存几个月。参加YPDZ4℃1～2yeastextract1%peptone2%dextrose(glucose)2%sorbitol1M+agar2%+Zeocin100μg/mlYPDSYPDS+Zeocin4℃条件下，有效1～22.5MGYMinimalGlycerolMedium〔最小甘油培育基〕生物素〕800ml100ml10*YNB2ml500*B100ml10*GY，4℃22.6MGYHMinimalGlycerolMedium+Histidine〔最小甘油培育基+0.004%组氨酸〕1000mlMGY10ml100*H4℃22.7RDRegenerationDextroseMedium〔葡萄糖再生培育基〕186g700ml，高压灭菌；冷却后于45℃水浴；45℃24℃保存。2.8RDHRegenerationDextroseMedium+Histidine〔葡萄糖再生培育基+0.004%组氨酸〕10ml100*H78mlRD4℃保存。RDRDH4，100ml10*D、100ml10*YNB；2ml45℃1/琼脂液混匀；快速制备平板。4℃可保存数月。RDRDHTOP〔常用于酵母菌的包被〕186g7.5~10g700m60℃水浴；4，100ml10*D、100ml10*YNB；2ml45℃1/琼脂液混匀；将该TOP琼脂置于45℃水浴冷却、保温，备用。MDMDHMinimalDextroseMedium+〔Histidine〕最小葡萄糖培育基+〔0.004%组氨酸〕〔含有：1.34%YNB；；4*10-5%生物素；2%葡萄糖〕1.100ml10*YNB2ml500*B100ml10*D800ml即可；MDH，MD10ml100*H如配制平板，可无菌水的灭菌前，参加15~20g的琼脂。4℃可保存数月。2.12SOCTryptonl％YeastExtract0.5％NaCl0.05％Glucose(1mol/L)2%保存三．主要试验环节的操作酵母菌株的分别纯化GS1155mlYPD液体培育基，30℃，200rpmYPD30℃YPD4℃保存。TOP10F’的活化培育活化培育。TOP10F’5mlLLB〔25ug/mlZeocin〕中，37℃，200rpm16～18小时。毕赤酵母表达的试验方法DNA，具体操作如下：⑴建立反响体系：10xCIPbuffer4ulCIP1ulddH2O5ul——————————————————————————total45ul30min〔灭活〕。CIP，参加试剂如下：45ul10x5％SDS7ul10xEDTA〔pH8.0〕7ulproteinseK5ulddH2O6ul———————————————————total70ul2.2.3.320ulddH2O1％琼脂糖凝胶电泳，120V，DNA10F’感受态细胞的制备及转化200mlLB37℃，200rpm，100ul200mlLB16～1810％31ml5min。200ul2500V，5ms。1.5mlEP管中。37℃，150rpm45～60min。LLB－Zeocin37℃12～16*注：设空载体做比照。毕赤酵母电转化方法取100~500μl500ml2L28~30℃、250~300r/minOD6001.3~1.5；5min，500ml重悬；按步骤3离心，用250ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；按步骤3离心，用20ml的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；1.5ml；备注：可将其分装为80μμg的线性化DNA溶解在5~10μlTE溶液中，与80μl0.2cm中；5min；电压、电流、电容等参数，按优化的参数，进展电击；1ml1.5ml的EP管中；MDRDB200~600μl将平板置于30℃培育，直至单个菌落消灭。200Ω4～10msec。3.5PichiaPCR3.5.1平板上的菌落长到肉眼可见时〔约12小时〕；Kit〔这样做可以鉴定非定向克隆的方向〕；〕挑取菌落PCR1.5PCR1.5PCR，1％agarose对于PCR扩增显现特异性条带的克隆，把置于1.5毫升离心管中的半截牙签扔到5YPDZ30，8－12〔也就是克隆效率低〕，PCR筛可以使工作量大为降低。20μl10xReactionBuffer5.0μl2.0μl25mmol/LMgCl23.0μl1.2μl2.5mmol/LdNTPs5.0μl3.0μlPrimer1〔10μmol/L〕2.5μl1.0μlPrimer2〔10μmol/L〕2.5μl1.0μlddH2O31.5μl12.6μlTOTAL50.0μl20.0μl94℃4min变性94℃30s34个循环72℃30s4℃毕赤酵母基因组提取方法5mlYPDZGS115YPD16～181500g5-10min基乙醇，1ulLyticase，37℃30min。⑷10000g5~10min90ulTE，200ul30s，取上层水相。1/10NaAC，-20℃30min；⑺10000g20min，弃上清；75%乙醇漂洗沉淀一次；H2O，-20℃备用。3.7Mut+表型重组酵母的诱导表达试验25mlMGYBMG或BMGY培育基的250ml28-30°C/250-300rpmOD600=2-6(~16-18h)；室温下1500~3000g离心5minMMBMMBMMY左右〔100~200ml〕；28-30°C/250-300rpm24h100％0.5～1.0%；按时间点分别取菌液样品，取样量为1ml，置于1.5mlEP管中，最大转速离心点一般取：0、6、12、24、36、48、60、72、8496h；品用液氮或干冰速冻后，于-80°CSDS-、Western-BlotMuts25mlMGYBMGBMGY250ml28-30°C/250-300rpmOD600=2-6(~16-18h)；1/51/10MM、BMMBMMY〔10~20ml〕；将步骤2所得的菌液置于100ml的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于24h100％0.5～1.0%；按时间点分别取菌液样品，取样量为1ml，置于1.5mlEP管中，最大转速离心点一般取：0、24、48、72、96120h；品用液氮或干冰速冻后，于-80°CSDS-、Western-Blot四试验的留意事项信号肽识别位点的设计以质粒pPICZαA为例。在利用PCR如果质粒果质粒pPICZαAKEX2Lys－Arg增加了编码LysArgAAAAGAKEX2α-factor达产物释放至胞外。PCR利用PCRP3P4两引物的扩增在rhEGF的两端加上XhoⅠXba53GC［6］，防止引物合成中由于合成效率和纯化问题而导致的酶切位点的残缺。公司在限制酶领域的总体争论水NEBCleavagetotheendofDNAfragments［7］，但是，一些不常用的酶或［8］；XbaI、NheISpeI5’端保护5’5高保真DNA聚合酶的使用VentDNA〔HighFidelity〕DNA合酶，能订正DNA扩增中产生的错误，而传统的TaqDNA聚合酶，TthDNA聚合酶及的机率为2.1x104。这对于大批量的PCR产物而言，并不是格外严峻的问题，由于DNAPCRDNA“突变”。将会导致严峻的后果［9］。DNAPfu，DeepVent，Pwo，UlTmaPfu10hEGFPCRhEGFVentDNA扩增长度、保证性、产量和特异性等〕，质粒构建PCRDNA效率将有质的飞跃。密码子的偏好性的原则码子使用上的偏爱性对从翻译水平分析外源基因表达的规律有重要意义,也为改造外源基因或改造宿主细胞供给依据［10、11］。线性化及承受电转化的缘由：SacⅠ进展线性化的处理。由于未线性化的环状质粒之间性化处理。这种处理的目的：⑴防止随机插入重组时质粒在功能区断开，造成目的基因表达失活；⑵让同源重组以指定的方式发生。主要步骤如下：1〕酶切体系〔80ul〕21/10PH5.2NaAC，混匀13200rpm，20min，离心后弃上清300ul5min，弃上清〕。6)20ulddH2O1.还是用酚抽一下，去除内切酶；2.75%乙醇应洗两遍，尽可能去除盐离子，防止电转化杯被击穿，同时可提高效率；+2.5DNA，75%的乙醇认真的洗两遍。酶切的总结，不管是否是定向克隆还是非定向克酶切的关键在于切干净，彻底的酶切反响是成功的一半，特别是载体