精讲02第2章细胞生物学研究方法-全国高中生物竞赛之《细胞生物学》名师精讲课件

高中生物竞赛

《细胞生物学》第5版

丁明孝、王喜忠、张传茂、陈建国2/16，细胞生物学研究方法2/16.细胞生物学研究方法2.1细胞形态结构的观察方法电子显微镜技术显微镜的出现单克隆抗体、分子杂交方法细胞学说的建立进入超微与分子形态水平细胞成分、代谢过程的同位素示踪技术精确定性、定量分析超离心技术同位素示踪技术生物工程2/16.细胞生物学研究方法2.1细胞形态结构的观察方法

人眼的分辨率，光学显微镜的分辨率μm，而电子显微镜可达。

显微镜观察范围肉眼观察范围肉眼0.2mm光学显微镜0.2µm电子显微镜0.2nm扫描隧道显微镜样品制备技术2/16.细胞生物学研究方法2.1细胞形态结构的观察方法2.1.1光学显微镜1.普通复式光学显微镜（1）由3部分组成：光学放大系统（目镜与物镜）、照明系统（光源和聚光镜）、镜架及调节系统。2/16.细胞生物学研究方法2.1细胞形态结构的观察方法2.1.1光学显微镜1.普通复式光学显微镜对任何显微镜来说，重要的性能参数是分辨率，而不是放大倍数。分辨率是指能区分开两个质点间的最小距离普通光学显微镜最大分辨率0.2µmλ:光源波长N:介质折射率,空气为1,油为α:物镜镜口角(样品对物镜镜口的张角,最大140o,Sinα/2最大0.94)（2）普通复式光学显微镜——分辨率放大的倒立虚像2/16.细胞生物学研究方法2.1细胞形态结构的观察方法2.1.1光学显微镜1.普通复式光学显微镜（3）普通复式光学显微镜——成像经物镜形成倒立实像经目镜进一步放大成虚像2/16.细胞生物学研究方法2.1细胞形态结构的观察方法2.1.1光学显微镜1.普通复式光学显微镜（4）普通复式光学显微镜——样品制备2/16.细胞生物学研究方法2.1细胞形态结构的观察方法2.1.1光学显微镜2.相差显微镜和微分干涉显微镜

（1）相差显微镜

①发明：1932年，德国物理学家P.Zernike制备出第一台相差显微镜，并在1935年获得诺贝尔物理学奖。

②优点：样品不需染色，可以观察活细胞。

③原理：利用光线干涉的原理把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，表现为明与暗的对比，从而提高了各种结构之间的对比度，使标本的各种结构变得更清晰。【分析】利用光线干涉的原理，将相位差转换成振幅差，实现对非染色活细胞的观察A.当两束光的相位相同时，相互干涉的结果使光波的振幅增加，亮度增强。B.当两束光的相位相反时，则导致光波的振幅降低2/16.细胞生物学研究方法2.1细胞形态结构的观察方法2.1.1光学显微镜（1）相差显微镜【分析】相差显微镜是在普通光学显微镜的基础上，添加“环状光阑”和“相差板”，将光程差或相位差，转换成振幅差。这是在构造上，相差显微镜不同于普通光学显微镜两个特殊之处。2.相差显微镜和微分干涉显微镜2/16.细胞生物学研究方法2.1细胞形态结构的观察方法（2）微分干涉相差显微镜（DIC）1952年Nomarski发明，利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果，能显示结构的三维立体投影。标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。偏振光经合成后，使样品中厚度上的微小区别转化成明暗区别，增加了样品反差且具有立体感。适于研究活细胞中较大的细胞器。如果将微分干涉显微镜接上高分辨率录像装置，就可以用来观察并记录活细胞中的颗粒及细胞器的运动。计算机辅助的微分干涉显微镜可以进一步提高样品的反差并降低图像的背景“噪声”，使一些常规光学显微镜难于观察的一些显微结构，如单根微管（直径约24nm）等也可以在光镜下分辨出来。2.1.1光学显微镜2.相差显微镜和微分干涉显微镜2/16.细胞生物学研究方法2.1细胞形态结构的观察方法1952年Nomarski发明，利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果，能显示结构的三维立体投影。标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。偏振光经合成后，使样品中厚度上的微小区别转化成明暗区别，增加了样品反差且具有立体感。适于研究活细胞中较大的细胞器。（2）微分干涉相差显微镜（DIC）2.1.1光学显微镜2.相差显微镜和微分干涉显微镜2/16.细胞生物学研究方法2.1细胞形态结构的观察方法四种类型的光学显微镜(A)光学显微镜(B)相差显微镜(C)微分干涉相差显微镜(D)暗视野显微镜2/16.细胞生物学研究方法2.1细胞形态结构的观察方法正置显微镜与倒置显微镜比较组成一样，倒置显微镜的物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。2/16.细胞生物学研究方法2.1细胞形态结构的观察方法正置显微镜与倒置显微镜比较2/16.细胞生物学研究方法2.1细胞形态结构的观察方法（1）荧光分子吸收入射光能量后电子从基态跃迁到激发态，再从激发态回到基态而发出的可见光(波长比入射光长)2.1.1光学显微镜3.荧光显微镜①特点：利用汞灯或氙灯作为荧光激发光源，波长较短，分辨率高于普通显微镜；核心部件是滤光片系统及专用物镜镜头；滤光片系统由激发滤光片和阻断滤光片组成。②应用：对细胞内生物大分子进行定性、定位研究。反射波长低于510nm的光520~560nm的绿色荧光透过450~490nm蓝光透过透过波长超过510nm的光物镜样

品目镜激发滤光片阻断滤光片（2）原理2/16.细胞生物学研究方法2.1细胞形态结构的观察方法2.1.1光学显微镜3.荧光显微镜免疫荧光技术荧光素直接标记技术绿色荧光蛋白(GFP)的基因与编码某种蛋白质的基因相融合表达两种以上荧光素标记同一样品，可同时显示不同成分在细胞中的定位（3）样品制备2/16.细胞生物学研究方法2.1细胞形态结构的观察方法2.1.1光学显微镜3.荧光显微镜在光镜水平上，对细胞内特异的蛋白质、核酸、糖类、脂质以及某些离子等组分进行定性定位研究的有力工具荧光显微镜显示出在有丝分裂中期细胞中，纺锤体微管（绿色）、中期染色体（蓝色）和原纤维状蛋白（fibrillarin）（红色）等结构成分（4）应用2/16.细胞生物学研究方法2.1细胞形态结构的观察方法2.1.1光学显微镜3.荧光显微镜4.激光扫描共焦显微镜共聚焦显微镜及其显微图像2/16.细胞生物学研究方法2.1细胞形态结构的观察方法2.1.1光学显微镜以激光为光源聚光镜和物镜同时聚焦到同一点上，排除焦平面以外的成像利用激光扫描装置和计算机高速采集与处理汇聚每一个点上的信息，形成清晰的二维图像分辨率比普通荧光显微镜～1.7倍2/16.细胞生物学研究方法2.1细胞形态结构的观察方法4.激光扫描共焦显微镜2.1.1光学显微镜可通过“光学切片”叠加后重构出样品的三维结构zxy3D图像重建2/16.细胞生物学研究方法2.1细胞形态结构的观察方法4激光扫描共焦显微镜2.1.1光学显微镜荧光显微镜（a）和激光扫描共焦显微镜（b）2/16.细胞生物学研究方法2.1细胞形态结构的观察方法4激光扫描共焦显微镜2.1.1光学显微镜蓝色为细胞核，绿色为微管2/16.细胞生物学研究方法2.1细胞形态结构的观察方法4激光扫描共焦显微镜2.1.1光学显微镜2/16.细胞生物学研究方法2.1细胞形态结构的观察方法5.超高分辨率显微术基于单分子成像技术的PALM/STORM方法全内反射荧光显微术结构照明显微术方法4π和STED原理是基于斯涅耳定律，即当光线从光密介质进入光疏介质时，一部分光会发生折射，而另一部分光线会发生反射。该技术的特点是只能观察细胞紧靠玻片的大约100nm的范围，例如观察细胞质膜以及紧靠细胞质膜的细胞骨架组分的动态行为，而对细胞的其他部分的观察则无能为力。2.1.1光学显微镜2/16.细胞生物学研究方法2.1细胞形态结构的观察方法基于单分子成像技术的PALM/STORM方法全内反射荧光显微术结构照明显微术方法4π和STEDPALM的缺点是只能用于观察外源表达蛋白的定位，并且每一幅图像照相所需的时间很长，不适合用于活细胞动态观察。随机光学重构显微术（STORM）。采用不同的荧光染料对，应用STORM可以对多达4种内源性蛋白进行精细定位，分辨率可以达到20nm左右。其缺点是得到一张超分辨图像的时间很长，在活细胞中很难实现。5.超高分辨率显微术2.1.1光学显微镜2/16.细胞生物学研究方法2.1细胞形态结构的观察方法基于单分子成像技术的PALM/STORM方法全内反射荧光显微术结构照明显微术方法4π和STED4π显微镜并没有突破衍射极限。理论上，STED显微术的分辨率不受光的衍射过程所限制，利用该技术可以使水平面的分辨率达到纳米级，而且可以快速地观察活细胞内的实时动态变化，如记录神经元突触小泡的行为，但没有提高z轴方向的分辨率。如果将4π和STED结合，将可以同时提高z轴方向的分辨率。5.超高分辨率显微术2.1.1光学显微镜2/16.细胞生物学研究方法2.1细胞形态结构的观察方法基于单分子成像技术的PALM/STORM方法全内反射荧光显微术结构照明显微术方法4π和STED利用结构照明术可使x、y平面分辨率达到100nm，z轴向分辨率也提高了2倍。其优点是对于普通的免疫荧光标记样本和各种荧光蛋白表达样本，可以不经特殊处理直接观察。其缺点是分辨率远低于其他超高分辨率显微术（图2-13）。5.超高分辨率显微术2.1.1光学显微镜2/16.细胞生物学研究方法2.1细胞形态结构的观察方法2.1.2电子显微镜电子束作为光源电磁透镜聚焦镜筒高度真空图像通过荧光屏或感光胶片记录显微镜分辨本领光源透镜真空成像原理光学显微镜电子显微镜200nm近0.1nm可见光（波长约400~700nm）电子束（0.01~0.9nm）玻璃透镜电磁透镜不要求真空要求真空1.33x10-5~1.33x10-3Pa利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差电子束的波长与加速电压有关。当加速电压为50～100千伏时，电子束波长约为～纳米1．电子显微镜与光学显微镜的基本区别2/16.细胞生物学研究方法2.1细胞形态结构的观察方法2.1.2电子显微镜1.电子显微镜的基本知识（1）电子显微镜与光学显微镜的基本区别电子显微镜分辨率可达0.2nm电镜的分辨本领是指电镜处于最佳状态下的分辨率2/16.细胞生物学研究方法2.1细胞形态结构的观察方法2.1.2电子显微镜

（2）电子显微镜的有效放大倍数与分辨本领1.电子显微镜的基本知识电子束照明系统成像系统真空系统记录系统2/16.细胞生物学研究方法2.1细胞形态结构的观察方法2.1.2电子显微镜（3）电子显微镜的基本构造1.电子显微镜的基本知识戊二醛和四氧化锇环氧树脂厚度40-50nm重金属盐超薄切片黑白图像2/16.细胞生物学研究方法2.1细胞形态结构的观察方法2.1.2电子显微镜2.主要电镜制样技术（1）超薄切片技术2/16.细胞生物学研究方法2.1细胞形态结构的观察方法2.1.2电子显微镜（1）超薄切片技术2.主要电镜制样技术Figure9-45MolecularBiologyoftheCell(©GarlandScience2008)2/16.细胞生物学研究方法2.1细胞形态结构的观察方法2.1.2电子显微镜（1）超薄切片技术2.主要电镜制样技术细胞膜高尔基体细胞核线粒体核糖体观察线粒体基粒、核糖体、蛋白颗粒及细胞骨架纤维甚至病毒等重金属盐沉积在铜网上，而样品未被染色（故名负染）分辨率可达1.5nm左右2/16.细胞生物学研究方法2.1细胞形态结构的观察方法2.1.2电子显微镜（2）负染色技术2.主要电镜制样技术①用重金属盐对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品干燥后，凹陷处铺了一薄层重金属盐，而样品凸出的地方则没有染料沉积，结果在图像中背景是黑暗的，而样品像“透明”地光亮。②负染色是只染背景而不染样品，与光学显微镜样品的染色正好相反。包括冰冻断裂与蚀刻复型两步观察膜断裂面上的蛋白质颗粒和膜表面形貌特征，图像有立体感样品不需固定包埋

2/16.细胞生物学研究方法2.1细胞形态结构的观察方法2.1.2电子显微镜（3）冷冻蚀刻技术2.主要电镜制样技术冰冻蚀刻电镜照片—细胞断裂面结构2/16.细胞生物学研究方法2.1细胞形态结构的观察方法2.1.2电子显微镜（3）冷冻蚀刻技术2.主要电镜制样技术透射电镜照片与冰冻断裂和冰冻蚀刻电镜照片比较电镜三维重构技术低温电镜技术电子扫描断层成像技术核孔复合物2/16.细胞生物学研究方法2.1细胞形态结构的观察方法2.1.2电子显微镜（4）电镜三维重构与低温电镜技术2.主要电镜制样技术2/16.细胞生物学研究方法2.1细胞形态结构的观察方法2.1.2电子显微镜（4）电镜三维重构与低温电镜技术2.主要电镜制样技术2/16.细胞生物学研究方法2.1细胞形态结构的观察方法2.1.2电子显微镜（4）电镜三维重构与低温电镜技术2.主要电镜制样技术2/16.细胞生物学研究方法2.1细胞形态结构的观察方法（5）扫描电镜技术2.主要电镜制样技术利用电子“探针”在样品表面进行“扫描”激发样品表面放出的二次电子成像，可以得到样品表面的立体形貌样品利用CO2

临界点干燥法处理样品观察前喷镀一层金膜一般扫描电镜的分辨本领仅为3nm2.1.2电子显微镜注意样品制备技术的差异！2/16.细胞生物学研究方法2.1细胞形态结构的观察方法小结：光镜、透射电镜与扫描电镜原理比较探测微观世界物质表面形貌利用量子力学中的隧道效应具有原子尺度的高分辨本领可以在真空、大气、液体等多种条件下工作非破坏性测量2/16.细胞生物学研究方法2.1细胞形态结构的观察方法2.1.3扫描隧道显微镜2/16.细胞生物学研究方法2.2细胞及其组分的分析方法沉降系数（sedimentationcoefficient）用离心法时，大分子沉降速度的量度，等于每单位离心场的速度。或s=v/ω2r。s是沉降系数，ω是离心转子的角速度（弧度/秒），r是到旋转中心的距离，v是沉降速度。沉降系数以每单位重力的沉降时间表示，并且通常为1～200×10-13秒范围，10-13这个因子叫做沉降单位s，即1s=10-13秒，如血红蛋白的沉降系数约为4×10-13秒或4s。大多数蛋白质和核酸的沉降系数在4s和40s之间，核糖体及其亚基在30s和80s之间，多核糖体在100s以上。2/16.细胞生物学研究方法2.2细胞及其组分的分析方法2.2.1用超离心技术分离细胞组分利用不同的离心速度所产生的不同离心力，将各种质量和密度不同的亚细胞组分和各种颗粒分开图2-22用差速离心法分离细胞匀浆中的各种细胞组分图中显示，随着离心力（g）大小和离心时间的不同，各种细胞组分沉淀在不同的离心管中1.差速离心（1）将要分离的细胞组分小心地铺放在含有密度逐渐增加的、高溶解性的惰性物质形成的密度梯度溶液表面，通过离心力的作用使样品中不同组分以不同的沉降率在密度梯度溶液中沉降，形成不同的沉降带（2）可分为速度沉降和等密度沉降图2-23用密度梯度离心分离细胞组分示意图2/16.细胞生物学研究方法2.2细胞及其组分的分析方法2.2.1用超离心技术分离细胞组分2.密度梯度离心①速度沉降（velocitysedimentation）用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。特点：介质密度较低。原理：介质密度梯度平缓，分离物按各自的沉降系数以不同的速度沉降

而达到分离。（2）可分为速度沉降和等密度沉降2/16.细胞生物学研究方法2.2细胞及其组分的分析方法2.2.1用超离心技术分离细胞组分2.密度梯度离心②等密度沉降isopycnicsedimentation用途：分离密度不等的颗粒。特点：介质密度高，陡度大，介质最高密度大于被分离组分的最大密度。

力场比速率沉降法大10~100倍，需要高速或超速离心。原理：样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离心则沉降到与

自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密

度的成分分离。（2）可分为速度沉降和等密度沉降2/16.细胞生物学研究方法2.2细胞及其组分的分析方法2.2.1用超离心技术分离细胞组分2.密度梯度离心组织匀浆分离出各组分差速离心密度梯度离心差速离心：分离密度不同的细胞组分密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离用途：于分离细胞器与生物大分子及其复合物（2）可分为速度沉降和等密度沉降2/16.细胞生物学研究方法2.2细胞及其组分的分析方法2.2.1用超离心技术分离细胞组分2.密度梯度离心2/16.细胞生物学研究方法2.2细胞及其组分的分析方法2.2.2特异蛋白抗原的定位与定性细胞内特异蛋白的显示可通过抗原－抗体特异结合的方法得以实现若抗体偶联荧光染料，则可以通过荧光显微镜、激光共焦显微镜观察为了观察特异蛋白在细胞内的精细定位，抗体需偶联电子致密物(胶体金)，用电镜观察2/16.细胞生物学研究方法2.2细胞及其组分的分析方法2.2.2特异蛋白抗原的定位与定性1.免疫荧光技术抗原：能刺激机体产生抗体的物质。抗体：由抗原刺激在机体内产生，并与抗原发生特异性结合的蛋白质的总称。多克隆抗体：由不同的B淋巴细胞产生的抗体混合物。将免疫学方法（抗原抗体特异结合）与荧光标记技术结合起来，研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。利用荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。免疫荧光染色观察肿瘤细胞骨架2/16.细胞生物学研究方法2.2细胞及其组分的分析方法2.2.2特异蛋白抗原的定位与定性1.免疫荧光技术抗原：能刺激机体产生抗体的物质。抗体：由抗原刺激在机体内产生，并与抗原发生特异性结合的蛋白质的总称。多克隆抗体：由不同的B淋巴细胞产生的抗体混合物。将抗体进行特殊标记后用电子显微镜观察免疫反应的结果。免疫胶体金技术：将抗体与金颗粒偶联，经免疫染色后，在电镜下金颗粒所在部位即为抗原位置。免疫荧光染色观察肿瘤细胞骨架2/16.细胞生物学研究方法2.2细胞及其组分的分析方法2.2.2特异蛋白抗原的定位与定性2.免疫电镜技术在超微结构水平上研究特异蛋白抗原的定位可分为免疫铁蛋白技术、免疫酶标技术与免疫胶体金技术，其主要区别是与抗体结合的标志物不同免疫胶体金技术受到越来越多的青睐图2-25免疫胶体金电镜技术的基本原理与应用A.免疫胶体金标记技术原理的示意图：细菌蛋白A可与胶体金结合，也可以与抗体（如IgG）的Fc端特异结合。B.免疫胶体金标记显示膀胱上皮细胞膜蛋白的分布（箭头所指）2/16.细胞生物学研究方法2.2细胞及其组分的分析方法2.2.3细胞内特异核酸的定位与定性原位杂交（insituhybridization）：用标记的核酸探针通过分子杂交确定特异核苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置FluorescenceinSituHybridization光镜水平：同位素标记或荧光素标记的探针电镜水平：生物素标记的探针与抗生物素抗体相连胶体金标记结合图2-26用原位杂交技术显示Z13基因在受精后1d的斑马鱼胚胎的体节、眼和松果体中的表达（箭头所指）Telomerefluorescenceinsituhybridization(T-FISH)2/16.细胞生物学研究方法2.2细胞及其组分的分析方法2.2.3细胞内特异核酸的定位与定性流式细胞术（flowcytometry）：可定量地测定某一细胞中的DNA、RNA或某一特异标记蛋白的含量，以及细胞群体中上述成分含量不同的细胞的数量，还可将某一特异染色的细胞从细胞群体中分离出来，以及将DNA含量不同的中期染色体分离出来，甚至用于细胞分选图2-27流式细胞仪的工作原理A.流式细胞仪分选原理示意图。B.显示流式细胞仪分析处在不同时相的HeLa细胞的实验结果2/16.细胞生物学研究方法2.2细胞及其组分的分析方法2.2.4细胞成份的分析与细胞分选技术2/16.细胞生物学研究方法2.3细胞培养与细胞工程体外培养细胞必须注意三个环节：物质营养、生存环境和废物的排除。1.细胞培养：属于生命科学研究的基本实验技术，涉及：原核细胞培养（细菌）真核单细胞培养（酵母）动物细胞培养植物细胞培养2.3.1细胞培养（1）体外培养的动物细胞可分为：原代细胞：是指从机体取出后立即培养的细胞，一般指培养的第2代至传10代以内的细胞。传代细胞：是指适应在体外培养条件下持续传代培养的细胞。

①原代细胞培养步骤：胰酶或胶原酶与EDTA，将细胞从体内分离出来，在模拟体内环境的条件下，让其生存和生长。2/16.细胞生物学研究方法2.3细胞培养与细胞工程2.3.1细胞培养1.动物细胞培养②细胞系（cellline）：原代培养的细胞一般传至10代左右就不易传下去了，但极少数细胞能够渡过危机传至50代左右，这些传代细胞称为细胞系。仍保持原来染色体的二倍体数量及接触抑制行为2/16.细胞生物学研究方法2.3细胞培养与细胞工程2.3.1细胞培养1.动物细胞培养有限细胞系（cellline）：细胞传至50代以后，又出现危机，不能再传下去，这种传代次数有限的体外培养细胞称为有限细胞系。永生细胞系：在传代过程中部分细胞发生遗传突变，带有癌细胞的特点，在培养条件下可无限传代，这种传代细胞又叫连续细胞系。染色体改变，呈亚二倍体或非整倍性，失去接触抑制②细胞系（cellline）：③细胞克隆：利用单细胞克隆培养或通过药物筛选的方法从某一细胞系中选择单个细胞，并由此增殖形成具有基本相同遗传性状的细胞群体称为细胞克隆。④细胞株（cellstrain）：经生物学鉴定，具有特殊的遗传标记或性质的细胞克隆，称为细胞株。2/16.细胞生物学研究方法2.3细胞培养与细胞工程2.3.1细胞培养1.动物细胞培养（1）体外培养的动物细胞可分为基本形态：成纤维样细胞和上皮样细胞贴壁培养和悬浮培养HelaCHO成纤维细胞上皮样细胞2/16.细胞生物学研究方法2.3细胞培养与细胞工程2.3.1细胞培养1.动物细胞培养（2）基本形态肿瘤细胞失去接触抑制行为2/16.细胞生物学研究方法2.3细胞培养与细胞工程2.3.1细胞培养1.动物细胞培养（2）基本形态2/16.细胞生物学研究方法2.3细胞培养与细胞工程2.3.1细胞培养2.植物细胞培养单倍体细胞培养：主要用花药在人工培养基上进行培养。可以从小孢子（雄性生殖细胞）直接发育成胚状体，然后长成单倍体植株；或者通过愈伤组织诱导分化出芽和根，最终长成植株。原生质体悬浮液尼龙布(45μ)过滤离心7000转，5分钟原生质体重复3次培养胚状体原生质体扩大培养2/16.细胞生物学研究方法2.3细胞培养与细胞工程2.3.1细胞培养2.植物细胞培养原生质体培养：体细胞经纤维素酶处理去掉细胞壁的原生质体经诱导分化长成植株2/16.细胞生物学研究方法2.3细胞培养与细胞工程2.3.2细胞过程2/16.细胞生物学研究方法2.3细胞培养与细胞工程2.3.2细胞过程1.细胞融合与单克隆抗体技术（1）细胞融合灭活的病毒化学物质（如PEG）电融合合核体异核体同核体2/16.细胞生物学研究方法2.3细胞培养与细胞工程2.3.2细胞过程1.细胞融合与单克隆抗体技术（2）单克隆抗体技术传统抗体生产TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1984"fortheoriesconcerningthespecificityindevelopmentandcontroloftheimmunesystemandthediscoveryoftheprincipleforproductionofmonoclonalantibodies."2/16.细胞生物学研究方法图2-29单克隆抗体制备过程示意图2/16.细胞生物学研究方法（2）单克隆抗体技术图2-29单克隆抗体制备过程示意图2/16.细胞生物学研究方法原理：B淋巴细胞能够产生抗体，但在体外不能进行无限分裂;而瘤细胞虽然可以在体外进行无限传代，但不能产生抗体。将这两种细胞融合后得到的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性。（2）单克隆抗体技术（1）细胞拆合：胞质体（cytoplast）和核体（karyoplast）物理法：机械法或短波光化学法：细胞松弛素（2）显微镜下用显微操作装置对细胞进行拆合或微量注射，如核移植、显微注射基因等图2-30应用显微注射技术进行细胞核移植2/16.细胞生物学研究方法2.3细胞培养与细胞工程2.3.2细胞过程2.显微操作技术与动物的克隆克隆羊多莉的培育2/16.细胞生物学研究方法2.显微操作技术与动物的克隆2/16.细胞生物学研究方法2.4细胞及生物大分子的动态变化2.4.1荧光漂白恢复技术（fluorescencephotobleachingrecovery，FPR）亲脂性或亲水性荧光分子，如荧光素、绿色荧光蛋白等与蛋白或脂质耦联高能激光束的照射使某一区域荧光不可逆淬灭由于生物膜的流动性，淬灭区荧光强度逐渐恢复测定脂质或蛋白质在细胞中运动速率图2-31荧光漂白恢复技术原理示意图Figure10-36aMolecularBiologyoftheCell(©GarlandScience2008)2/16.细胞生物学研究方法2.4.1荧光漂白恢复技术（fluorescencephotobleachingrecovery，FPR）在表达GFP微管蛋白的间期（非分裂）细胞上进行的FRAP实验的显微照片。在实验过程中对细胞进行成像。两个并排的细胞被激光漂白，然后随着时间的推移，漂白区的荧光信号逐渐恢复。2/16.细胞生物学研究方法细胞骨架的FRAP研究荧光漂白损失技术Fluorescencelossinphotobleaching,FLIP2/16.细胞生物学研究方法在体内分析蛋白质－蛋白质相互作用利用转录激活因子的DNA结合域(DB)和转录激活域(AD)结合在一起才具有完整转录激活功能的原理图2-32用于检测蛋白质-蛋白质互作的酵母双杂交技术原理示意图2/16.细胞生物学研究方法2.4细胞及生物大分子的动态变化2.4.2酵母双杂交技术（yeasttwo-hybridsystem）检测活细胞内两种蛋白质分子是否直接相互作用如果两个蛋白相互作用，其中一个蛋白激发后发出的荧光可激发另一蛋白产生荧光两个蛋白未相互作用相互作用图2-33荧光共振能量转移原理图A.携带CFP的供体蛋白与携带YFP的受体蛋白分子之间的距离大于10nm时，在一定波长的紫外激发光（430nm）的照射下，只有供体蛋白中的CFP被激发，放出波长为490nm的蓝色荧光，而受体中的YFP不会被激发出黄色荧光。B.如果这两个蛋白质之间的距离在1～10nm的范围内，供体蛋白中CFP发出的蓝色荧光可以被受体蛋白中的YFP所吸收，并激发YFP发出波长为530nm的黄色荧光2/16.细胞生物学研究方法2.4细胞及生物大分子的动态变化2.4.3荧光共振能量转移技术（fluorescenceresonanceenergytransfer，FRET）D、A都能发荧光D的发射光谱和A的激发（或吸收）光谱必须有部分重叠D和A之间的距离必须小于10nm2/16.细胞生物学研究方法2.4.3荧光共振能量转移技术（fluorescenceresonanceenergytransfer，FRET）基本原理是：在一定波长的激发光照射下，只有携带发光基团D的供体分子可被激发出波长为D的荧光，而同一激发光不能激发携带发光基团A的受体分子发出波长为A的荧光。然而，当供体所发出的荧光光谱D与受体上的发光基团的吸收光谱A相互重叠，并且两个发光基团之间的距离小到一定程度时，就会发生不同程度的能量转移，即受体分子的发光基团吸收了供体所发出的荧光，结果受体分子放出了波长为A的荧光，这种现象称为FRET现象。在体内，如果两个蛋白质分子的距离在10nm之内，就可能发生FRET现象，由此认为这两个蛋白质存在着直接的相互作用。2/16.细胞生物学研究方法2.4细胞及生物大分子的动态变化2.4.3荧光共振能量转移技术（fluorescenceresonanceenergytransfer，FRET）利用放射性同位素的电离射线对乳胶(含AgBr或AgCl)的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究两个主要步骤：即同位素标记的生物大分子前体的掺入和细胞内同位素的显示2/16.细胞生物学研究方法2.4细胞及生物大分子的动态变化2.4.4放射自显影技术对细胞或生物体内生物大分子动态研究和追踪的标记方法：持续标记、脉冲标记显微放射自显影电镜放射自显影2/16.细胞生物学研究方法2.4细胞及生物大分子的动态变化2.4.4