动物细胞培养技术

关于动物细胞培养技术第1页，课件共100页，创作于2023年2月1.动物细胞的生长与培养动物细胞的特点进化程度高结构、形态、成分复杂细胞间连接形式多样生长相对缓慢功能全面第2页，课件共100页，创作于2023年2月1.1培养细胞的生物学特征Hepatocytes第3页，课件共100页，创作于2023年2月体外培养细胞的分型

（一）贴附型

成纤维细胞型上皮型细胞游走细胞型多形型细胞（二）悬浮型（三）半贴壁型第4页，课件共100页，创作于2023年2月（一）贴附型：大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞贴附:是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在方式结果:

基于贴附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组织，有机体的绝大多数细胞必须贴附于一固相表面才能生存和生长。培养时：这些细胞被放到体外环境中以后,同样需要贴附于某一固相表面才能生存和生长，因而属于贴附型细胞贴附(锚定或锚着)依赖型(性)细胞：唯有贴附于固相表面才能生存的细胞第5页，课件共100页，创作于2023年2月细胞在体内、外的贴附方式：存在差异体内：贴附是全方位,外形具有复杂的立体特征体外：多数情况，细胞只有一个附着平面，外形一般与体内时明显不同贴附的固相表面：玻璃、聚苯乙烯塑料按照培养细胞的主要形态，可分为几大类型

第6页，课件共100页，创作于2023年2月1、成纤维细胞型：第7页，课件共100页，创作于2023年2月名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的来源：由中胚层间充质组织起源的组织如：真正的成纤维细胞：心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮形态：似体内成纤维细胞的形态，胞体梭形或不规则三角形，胞质向外伸出2—3个长短不等的突起，中有卵圆形核生长特点：排列成放射状，漩涡状，并不紧靠连成片，细胞—细胞接触易断开而单独行动，游离的单独的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起第8页，课件共100页，创作于2023年2月2、上皮型细胞：第9页，课件共100页，创作于2023年2月名称：仅形态上似体内，实际上不完全相同来源：来源于外胚层、内胚层细胞,如：皮肤及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡,上皮性肿瘤形态：类似体内的上皮细胞，扁平，不规则多角形，中有圆形核生长特点：易相连成片，相靠—紧密相连—成薄层—铺石状生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动第10页，课件共100页，创作于2023年2月3、游走细胞型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。4、多型细胞型：有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。

第11页，课件共100页，创作于2023年2月（二）悬浮型：见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。概念：培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长

或以机械方法使保持悬浮状态下生长来源：自血，脾或骨髓，血中白细胞癌肿细胞特点：在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团优点：生存空间大，提供数量大，传代方便(不需消化)，

易于收获，可获得稳定状态缺点：纯化不方便，不能通过离心将死、活细胞分离第12页，课件共100页，创作于2023年2月第13页，课件共100页，创作于2023年2月无菌无毒害的环境1支持生长增殖的营养2其它类似体内的环境3维持细胞性状41.2细胞培养总原则第14页，课件共100页，创作于2023年2月(一)细胞培养无菌无毒环境实验室设计合理常用设施及设备培养器皿：透明度好、无毒、利于细胞贴附和生长的材料，常用一次性聚苯乙烯材料制品或中性硬度玻璃制品。第15页，课件共100页，创作于2023年2月第16页，课件共100页，创作于2023年2月细胞培养无菌操作基本技术工作环境及表面的处理细胞培养所用玻璃及塑料制品的处理培养液与培养细胞的处理第17页，课件共100页，创作于2023年2月(二)细胞的营养培养基：合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一，培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。血清：血清是细胞培养液中最重要的成分之一，含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分。其它成分（条件培养基）第18页，课件共100页，创作于2023年2月合成培养基的主要成分氨基酸碳水化合物无机盐维生素其它辅助物质培养基种类RPMI-1640（标准型）DMEM-高糖（标准型）DMEM-低糖（标准型）McCoys5AM199F12第19页，课件共100页，创作于2023年2月血清牛血清、马血清、人血清（1）储存于-20℃—-70℃低温冰箱中（2）一般厂商提供的血清为无菌（3）热灭活是指56℃,30分钟加热已完全解冻的血清，目的是使血清中的补体成分（complement）灭活（4）血清中的沉淀物絮状物，可用离心3000rpm,5分钟去除，也可不用处理。第20页，课件共100页，创作于2023年2月其它常用液体试剂Hank’sD-Hank’sPBSNaHCO3（7.5%

）胰酶溶液（0.25%）第21页，课件共100页，创作于2023年2月(三)其它类似体内的环境温度气体渗透压氢离子浓度(PH)其他第22页，课件共100页，创作于2023年2月(四)合理的计划，维持细胞性状

尽早冻存原代细胞，复苏后状态恢复的细胞以及转染后稳定存在的细胞需要做实验的细胞要选对数生长期防止细胞污染，如遇污染，及时处理第23页，课件共100页，创作于2023年2月一、细菌污染细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养液中加入了抗菌素(一般为预防剂量)，也可能因为操作不慎而引起污染。最常见的有革兰氏阳性菌。培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。也有的培养液肉眼观察无多少改变，只能在镜下发现菌体才知污染。所以，每天应仔细观察。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡，造成试验失败和细胞株(系)丢失。第24页，课件共100页，创作于2023年2月二、真菌污染

真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，尤其在霉雨季节进行细胞培养更易污染。最常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。

培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。念珠菌和酵母菌呈卵圆形散在细胞周边和细胞之间。个体细小，有增多趋势。镜下看时，要将培养瓶用酒精棉球擦干净，以防止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相混淆。真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。第25页，课件共100页，创作于2023年2月三、支原体污染

支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物，最小直径0.2μm，一般过滤除菌无法去除它，光镜下难以看清它的形态结构。开始不易发现，能在偏碱条件(pH7.6～8.0)下生存，对青霉素有抗药性。多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。电镜下可见其有三层结构，无细胞壁，中央有电子密度大的密集颗粒或丝状的中心囊。

培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。第26页，课件共100页，创作于2023年2月四、病毒污染采用组织细胞培养法生产疫苗，如果没有除去潜在病毒的组织培养物，会产生病毒污染。目前，从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒。尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。若二倍体细胞系有SV40或多发瘤病毒，B淋巴细胞含EB病毒，细胞会发生变异、转化，形成异倍体的细胞系。第27页，课件共100页，创作于2023年2月五、非同种细胞污染

由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开，操作不当，往往会使一种细胞被另一种细胞污染。如“灵长类”细胞系发现猴和鼠类细胞的混合物，ERK/KD细胞是从兔肾中分离出来的，而现在却认为是HeLa细胞。非细胞培养物所造成的化学成分的污染也偶有发生，大多是由于细胞培养所需物品清洗消毒不彻底而带入一些有毒化学物质所致。第28页，课件共100页，创作于2023年2月常用的排除微生物污染的方法

抗生素排除法：采用5～10倍于常用量的冲击法，加入高浓度抗生素后作用24～48h，再换入常规培养物，有时可能奏效。加温除菌：根据支原体不耐热的特点，可将受支原体污染的细胞至于41摄氏度作用5～10h（最长可达18h），以杀灭支原体。动物体内接种：受污染的肿瘤细胞可接种在同种动物皮下或腹腔内，利用动物的免疫功能消灭污染的微生物，而肿瘤细胞却能在动物体内继续生长，待一定时间后从体内取出肿瘤细胞进行培养与巨噬细胞共培养：巨噬细胞在体外可存活7～10天，并保持吞噬、消化微生物的能力。利用这一特点，可将少量的污染细胞与足够量的巨噬细胞共培养，从而消除污染。第29页，课件共100页，创作于2023年2月1.3培养细胞的生长和增殖过程

幼龄动物取动物器官和组织剪碎组织胰蛋白酶处理细胞培养单个细胞第30页，课件共100页，创作于2023年2月细胞悬液10代细胞50代细胞无限传代原代培养传代培养如何界定原代培养和传代培养；多数组织细胞固定在表面生长和分裂。随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖遗传物质改变遗传物质未改变第31页，课件共100页，创作于2023年2月原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。培养的第1代细胞与传10代以内的细胞称为原代细胞培养。传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。有关概念第32页，课件共100页，创作于2023年2月细胞的原代培养

将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。

第33页，课件共100页，创作于2023年2月组织块直接培养法（机械法）1、取材：将小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡2—3秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再用碘酒消毒腹部，将鼠带入超净台内解剖取肝脏，置平皿中。2、用Hank’s液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。3、用手术剪将肝脏剪成小块（1-2mm），再用Hank’s液洗三次，转移至小青霉素瓶中4、将组织块转移到培养瓶，贴附与瓶底面5、翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。入37℃静置3—5小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养

第34页，课件共100页，创作于2023年2月胰酶消化法1、取材：将小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡2—3秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再用碘酒消毒腹部，将鼠带入超净台内解剖取肝脏，置平皿中。2、用Hank’s液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。3、用手术剪将肝脏剪成小块（1mm2），再用Hank’s液洗三次，转移至小青霉素瓶中。4、视组织块量加入5—6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20—40分钟，每隔5分钟振荡一次.5、加入2ml培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）,用吸管吹打，冲散细胞。6、静置，使未分散的组织块下沉。7、吸取上层细胞悬液，转移到两个培养皿中，补加适量培养液，37℃下培养。第35页，课件共100页，创作于2023年2月（一）培养细胞生命期在培养中持续增殖和生长的时间。

第36页，课件共100页，创作于2023年2月1．原代培养期：从体内取出组织,接种培养到第一次传代阶段（初代培养）特点：1一4周、细胞呈活跃的移动、可见细胞分裂、形态结构和功能活动上与体内原组织相似性、多呈二倍体核型细胞群是异质的，细胞克隆形成率很低，即细胞独立生存性差。第37页，课件共100页，创作于2023年2月2．传代期：初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系。在全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系。为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。一般情况下当传代10～50次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。第38页，课件共100页，创作于2023年2月3．衰退期：此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期任何一点，由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化。转化的标志之一是细胞可能获得永生性或恶性性。第39页，课件共100页，创作于2023年2月细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系，也称连续细胞系。无限细胞系的形成主要发生在第二期末，或第三期初阶段。细胞获不死性后，核型大多变成异倍体。细胞转化亦可用人工方法诱发，转化后的细胞也可能具有恶性性质。细胞永生性和恶性性非同一性状。第40页，课件共100页，创作于2023年2月（二）组织培养细胞一代生存期

所谓细胞“一代”一词，系指从细胞接种到分离再培养时的一段时间，这已成为培养工作中的一种习惯说法，它与细胞倍增一代非同一含义。如某一细胞系为第153代细胞，即指该细胞系已传代153次。它与细胞世代或倍增不同；在细胞一代中，细胞能倍增3～6次。细胞传一代后，一般要经过以下三个阶段：?潜伏期指数生长期停滞期第41页，课件共100页，创作于2023年2月1．潜伏期：第42页，课件共100页，创作于2023年2月过程:游离:悬浮,胞质回缩,全部细胞变为圆球形吸附:贴附底物,一般24小时内贴壁潜伏期:可有运动活动,基本无增殖,少见分裂相第43页，课件共100页，创作于2023年2月

影响因素：

潜伏期的长短与：细胞种类接种的细胞密度培养条件第44页，课件共100页，创作于2023年2月1.细胞类型传代培养的细胞之潜伏期比原代培养的细胞短。传代培养期的细胞6-24h;原代24-96h或更长单个细胞快,细胞大团慢,组织块慢连续细胞系与发生恶性转化的细胞(6-24h)比有限细胞系与正常二倍体细胞的短来源：胚胎组织:短,2天可见细胞生长，成体:长

第45页，课件共100页，创作于2023年2月2.细胞密度

密度越大、数量越多，细胞群体越容易适应体外环境，潜伏期就短。相反，即便是在很小的培养空间内，如接种的细胞数量不够大，潜伏期仍会较长3.培养条件

培养液、pH底物、污染,有毒

第46页，课件共100页，创作于2023年2月2．指数增生期：这是细胞增值最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。一般以细胞分裂指数表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。一般细胞的分裂指数介于0.1%～0.5%，初代细胞分裂指数低，连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达3%～5%。第47页，课件共100页，创作于2023年2月特点：

是细胞增生最活跃、活力最旺盛的阶段培养物中细胞数量呈指数增长,细胞群体均一是理想的实验用细胞接触抑制密度抑制第48页，课件共100页，创作于2023年2月3．停滞期：细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止增殖，进入停滞期。此时细胞数量不再增加，故也称平台期（Plateau）。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累、pH降低。此时需做分离培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变，重则从底物脱落死亡第49页，课件共100页，创作于2023年2月特点

(1)细胞数量：

细胞达饱和密度，出现密度抑制。

(2)细胞活动小(3)生长组分下降

(4)及时传代：细胞已中毒，即使传代，也会影响下一代细胞的功能状况第50页，课件共100页，创作于2023年2月潜伏期指数生长期停滞期第51页，课件共100页，创作于2023年2月细胞计数及活力测定培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数，结果以每毫升细胞数表示。在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。第52页，课件共100页，创作于2023年2月细胞计数原理第53页，课件共100页，创作于2023年2月细胞计数操作步骤

1、将血球计数板及盖片擦试干净，并将盖片盖在计数板上。

2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。

3、静置3分钟。

4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：

细胞数/ml＝4大格细胞总数/4×10000

注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。

第54页，课件共100页，创作于2023年2月请计算一下~~~~~~~~~~~~细胞毒实验需要效应细胞与靶细胞的比例为20：1且靶细胞需要1x104/TEST。现有效应细胞10ml，取100ul效应细胞加入900ulPBS中，混匀后记数，细胞浓度为2x104/ml。靶细胞也有10ml，经记数，细胞浓度为1x105/ml。效应细胞共有多少？靶细胞共有多少？以现有的细胞做实验，能做几个TEST？第55页，课件共100页，创作于2023年2月细胞活力测定步骤

1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中。

2、加入0.5ml0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟。

3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。

4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。

死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。

活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。第56页，课件共100页，创作于2023年2月哺乳动物细胞冷冻保存主要目的：（1）保存种子细胞，以便随时取用。（2）降低人力和物力（3）减少细胞被微生物污染的危险性。（4）避免有限细胞系出现衰老或恶性转变（5）减少细胞因传代培养而引起的遗传变异和形态改变第57页，课件共100页，创作于2023年2月冷冻保存要点（1）冷冻过程要缓慢，有条件的地方，可用程控降温仪，按每分钟-1到-3℃速度降温，一直到-80℃以下，然后直接放入液氮中长期保存（2）冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于90％，无微生物污染。（3）细胞浓度控制在：1×106－1×107/ml。（4）使用高浓度血清（30%）（5）使用合适的细胞冷冻保护剂（DMSO、甘油）细胞冷冻保存液主要成分：冷冻保护剂（5-10%，培养基（60%），血清（30%）。第58页，课件共100页，创作于2023年2月细胞冻存实用程序收集细胞冻存液重悬分装入冻存管106-107/mL4℃40min-20℃30-60min-30℃30min-80℃过夜液氮罐保存并记录第59页，课件共100页，创作于2023年2月冷冻保存细胞的解冻与复苏（1）快速解冻（2）解冻操作过程动作要轻特别注意：解冻时务必注意安全，预防冷冻管爆裂。要带手套，用镊子将细胞冷冻管从液氮中取出，放入37℃水浴中。切不可直接用手，以免冻伤冷冻管在水浴中解冻时，液面不可超过冻存管盖面，否则，易发生污染第60页，课件共100页，创作于2023年2月解冻冷冻保存细胞的离心方法:从液氮中取出冻存的细胞，立即放入37℃水浴中快速解冻。将1－2ml冻存细胞液加入到25ml新鲜完全细胞生长培养液中，轻轻混匀。用80g离心2－3分钟（800-1000rpm5min），弃上清液。用完全生长培养液轻轻悬浮细胞团，并计数细胞。接种细胞到培养瓶中，起始密度不低于3×105/ml。24-48h后换液。第61页，课件共100页，创作于2023年2月1.4体外培养细胞的种类

细胞系细胞株二倍体细胞遗传缺陷细胞肿瘤细胞第62页，课件共100页，创作于2023年2月（一）细胞系

初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系。第63页，课件共100页，创作于2023年2月（二）细胞株

从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株第64页，课件共100页，创作于2023年2月（三）二倍体细胞

细胞群染色体数目具有与原供体二倍细胞染色体数相同或基本相同（2n细胞占75％或80％以上）的细胞群，称二倍体细胞。如仅数目相同，而核型不同的即染色体形态有改变者为假二倍体。为保持二倍体细胞能长期被利用，一般在初代或2～5代即大量冻存作为原种。第65页，课件共100页，创作于2023年2月（四）遗传缺陷细胞

从有先天遗传缺陷者取材（主要为成纤维细胞）培养的细胞，或用人工方法诱发突变的细胞，都属遗传缺欠细胞。这类细胞可能具有二倍体核型，也可呈异倍体。

第66页，课件共100页，创作于2023年2月（五）肿瘤细胞系或株

这是现有细胞系中最多的一类，我国已建细胞系主要为这类细胞。肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞，常已传几十代或百代以上，并具有不死性和异体接种致瘤性。

第67页，课件共100页，创作于2023年2月细胞系或细胞株的命名

HeLa：为供体患者的姓名（来源于宫颈癌）

CHO：中国地鼠卵巢细胞（ChineseHamsterOvary）宫-743：宫颈癌上皮细胞，1974年3月建立

NIH3T3：美国国立卫生研究院（NationalInstituteofHealth）建立；每3天传代，每次接种3×105细胞／毫升。第68页，课件共100页，创作于2023年2月细胞系或株的鉴定、管理和使用

ATCC入库细胞要求检测项目如下：

培养简历：组织来源日期、物种、组织起源、性别、年龄、供体正常或异常健康状态、细胞已传代数等

冻存液：培养基和防冻液名称

细胞活力：融解前后细胞接种存活率和生长特性

培养液：培养基种类和名称（一般要求不含抗生素）、血清来源和含量第69页，课件共100页，创作于2023年2月细胞形态：类型，如为上皮或成纤维细胞等，融解后细胞生长特性

核型：二倍体或多倍体，标记染色体的有无

无污染检测：包括细菌、真菌、支原体、原虫和病毒等

物种检测：检测同工酶，以证明细胞有否交叉污染以及反转录酶检测

免疫检测：一两种血清学检测

细胞建立者：建立者姓名；检测者姓名第70页，课件共100页，创作于2023年2月第71页，课件共100页，创作于2023年2月第72页，课件共100页，创作于2023年2月第73页，课件共100页，创作于2023年2月第74页，课件共100页，创作于2023年2月细胞凋亡细胞凋亡:是能量依赖的细胞内死亡程序活化而致的细胞自杀，由基因控制的细胞自主有序的主动死亡过程。细胞程序性死亡（programmedcelldeath，PCD）:指生理性细胞死亡。描述在一个多细胞生物体中某些细胞死亡是个体发育中的一个预定的，并受到严格程序控制的正常组成部分。第75页，课件共100页，创作于2023年2月细胞凋亡与坏死的区别——————————————————坏死凋亡1.性质病理性，非特异性,非遗传性生理性或病理性，特异性遗传性2.诱导因素强烈刺激（极端环境），随机发生较弱刺激，非随机发生3.生化特点被动过程，无新蛋白合成，主动过程，有新蛋白合成，不耗能耗能4.形态变化细胞结构全面溶解、破坏、胞膜及细胞器相对完整细胞肿胀细胞皱缩，核固缩5.DNA电泳弥散性降解，电泳呈均一DNA片段化（180-200bp），

DNA片状电泳呈“梯”状条带6.炎症反应溶酶体破裂，局部炎症反应溶酶体相对完整，局部无炎症反应7.凋亡小体无有8.基因调控无有第76页，课件共100页，创作于2023年2月第77页，课件共100页，创作于2023年2月常用细胞凋亡检测方法细胞凋亡的形态学检测磷脂酰丝氨酸外翻分析（AnnexinV法）线粒体膜势能的检测DNA片断化检测TUNEL法Caspase-3活性的检测

凋亡相关蛋白TFAR19蛋白的表达和细胞定位分析第78页，课件共100页，创作于2023年2月细胞凋亡的形态学检测第79页，课件共100页，创作于2023年2月磷脂酰丝氨酸外翻分析（AnnexinV法）磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中.Annexin-V是一种分子量为35～36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。碘化丙啶（propidineiodide，PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来第80页，课件共100页，创作于2023年2月AnnexinV-FITCFluorescencePIFluorescence

TimecourseofapoptosisinTF-1cellsculturedinGM-CSF-freemedium第81页，课件共100页，创作于2023年2月第82页，课件共100页，创作于2023年2月线粒体膜势能的检测线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡，而线粒体跨膜电位的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前，一旦线粒体跨膜电位崩溃，则细胞凋亡不可逆转。线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。

第83页，课件共100页，创作于2023年2月DNA片断化检测细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩，染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂，形成50～300kbp长的DNA大片段，或180～200bp整数倍的寡核苷酸片段，在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱（DNAladder）。第84页，课件共100页，创作于2023年2月TUNEL法细胞凋亡中，染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3‘-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3‘-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal-deoxynucleotidyltransferasemediatednickendlabeling,TUNEL）。

第85页，课件共100页，创作于2023年2月第86页，课件共100页，创作于2023年2月2.干细