紫杉醇的细胞工程制药

生物制药工艺课程紫杉醇的细胞工程制药背景介绍紫杉醇是红豆杉属植物中的一种复杂的次生代谢产物,也是目前所了解的唯一一种可以促进微管聚合和

稳定已聚合微管的药物。紫杉醇的结构与性质

紫杉醇外观为白色结晶体粉末，无臭、无味，微溶于水，易溶于氯仿、丙酮等有机溶剂。分子式C47H51NO14,结构式：药理细胞接触紫杉醇后会在细胞内积累大量的微管，这些微管的积累干扰了细胞的各种功能,特别是使细胞分裂停止于有丝分裂期，阻断了细胞的正常分裂。通过Ⅱ-Ⅲ临床研究，紫杉醇主要适用于卵巢癌和乳腺癌，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤也都有一定疗效。

迄今为止，国际市场上只有2种紫杉醇原料药：一种来自各种红豆杉树皮；另一种是从欧洲观赏紫杉枝条里提取出“10-浆果赤霉碱”，然后再经半合成而成，即多西他赛（多烯紫杉醇），其结构与天然提取紫杉醇十分相似。这两种原料药均为国际医药市场上的畅销原料药产品，并长期处于供不应求状态。在美国，紫杉醇注射剂（商品名：Paclitaxel）主要由百时美施贵宝独家生产，现已有大约二三家制药企业生产紫杉醇原料药和制剂，但该市场基本上为百时美施贵宝所垄断，其它几家企业生产的紫杉醇制剂销售额合计只及百时美施贵宝的一个零头。而多西他赛原料药和制剂则主要由法国普朗克公司以及英国、意大利等几家公司合作生产，以普朗克的产量最大。

获取紫杉醇的途径化学合成红豆杉中提取真菌发酵植物组织培养

化学合成1.全合成：路线复杂，反应条件难以控制，产率低，用到剧毒原料，仅限于实验室水平2.半合成：

国外专利技术壁垒，国内生产附加值低红豆杉中直接提取但存在以下的问题：资源匮乏红豆杉生长缓慢，树皮剥取后不能再生，树木将死去。紫杉醇在植物体内含量极低，最多0.069%。需多步柱分离技术，生产成本高

近年来，国内外科研人员纷纷研究开发快速高效的紫杉醇提取方法，研发的重点集中在溶剂浸提、渗漉、超声提取等方面。中南大学化学化工学院满瑞林等科研人员应用超临界CO2流体萃取技术提

取紫杉醇获得成功。验证得知浸膏中紫杉醇质量分数为1.12%，高于传统溶剂的浸提结果(0.87%)。真菌发酵真菌发酵生产紫杉醇因真菌的紫杉醇含量仅有植物细胞的十万分之一,离生产的距离太远。从长远来看,植物组织培养才是解决紫杉醇供需矛盾的最佳途径。组织培养组织培养是在无菌和人为控制外因（营养成分、光、温、湿）的条件下，培养和研究植物组织、器官，甚至进而从中分化、发育出整体植株的技术。植物组织培养愈伤组织培养继代培养悬浮细胞培养紫衫细胞大量培养愈伤组织培养选择合适的外植体：以幼茎为佳除去病原菌和杂菌：处理外植体配置合适的培养基。诱导及培养：将上述小块组织接种于MS培养基中，于25℃的二氧化碳培养箱中培养40天。PH5.8，诱导和分化，即可形成小的愈伤组织块。继代培养愈伤组织长出后经过4~6周的迅速细胞分裂，原有培养基的水分和营养成分多以耗失有害代谢产物已在培养基中积累，必须移植。即是继代愈伤组织也易分泌橙红色色素或发生褐化，使生长速度减慢，甚至死亡（这是愈伤组织分泌的酚类物质被氧化成醌类物质造成的）。*缓解褐化在培养基中加入还原剂或吸收酚类的物质,可以减少致死现象,保持愈伤组织的生长活性。如：半胱氨酸、维生素C、活性炭PS：由于吸附剂对营养物质和激素的吸收,较高浓度的吸附剂会部分地抑制愈伤组织的生长继代悬浮悬浮培养步骤：悬浮细胞培养只有当愈伤组织经过长时期固体培养,表现出相当的生理稳定性后,才能进行悬浮培养。一般采用B5培养基，碳源多为蔗糖。温度、接种量、光照强度，pH值等的改变均能影响细胞的生长率和产物合成半连续培养：每隔一定时间倒出一定量的悬浮液，同时补充加入等量的新鲜培养液连续培养：连续收获细胞，同时不断补充培养液加入培养基排出培养基及其培养物

紫衫细胞大量培养前期利用碳水化合物的选择加快细胞生长,使细胞量迅速增加。达到一定细胞量后,改用利于紫杉醇合成的培养液。通过调整合成培养液的组成,延长紫杉醇合成时间（静止期）。为了提高生产率，需要提高活性细胞浓度，大规模地培养红豆杉细胞。现在已经发展了不少大规模培养系统，同时使用固定化的细胞，原位提取等现代发酵技术方法能够在一定程度上提高活性细胞的浓度。

提高紫杉醇产量的方法前体饲喂添加抑制剂添加诱导因子筛选细胞株系前体饲喂一方面可通过增加底物量来加快反应速度和提高产率另一方面能够反馈抑制分支路径而促进反应顺利进行,有效提高紫杉醇产量。常用：苯甲酸，苯甲酰甘氨酸添加抑制剂添加抑制剂能够反馈抑制分支路径而使反应向有利于紫杉醇合成的方向进行。发现合成代谢抑制剂氯化胆碱CCC可以使紫杉醇含量提高，但浓度过高却抑制合成。添加诱导子紫杉醇是一种植物防卫素，可以被诱导茉莉酸甲酯----参与植物防御信号的转导与放大花生四烯酸----浓度为5µg/g时即可将紫杉醇含量提高9.3倍,与茉莉酸甲酯表现出明显的诱导协同作用。

筛选出高产的细胞株系

细胞克隆技术筛选目前，主要运用现代生物基因工程的方法来获得高产细胞系。紫杉醇含量高的外植体愈伤组织高产细胞植株诱导变异问题与前景①红豆杉属植物组织细胞培养中的褐化现像，尚无良好的解决办法。②紫杉醇本身是一种细胞生长的毒性物质,其量的积累愈多,对细胞增殖的抑制越强。即使添加真菌诱导子及生物合成前体,在一段时间内可以增加紫杉醇产量，但随着细胞的遗传，会逐渐产生抗性，使产量降低，这也是组织细胞培养生产紫杉醇无法工业化生产的一大原因。③紫杉醇作为一种抗有丝分裂机制，在有丝分裂过程中，干扰了细胞的正常分裂，使红豆杉细胞染色体数目极易发生变化,红豆杉中紫杉醇的含量极不稳定，因此稳定的保存并筛选高产的紫杉醇细胞系显得尤为重要。

面临的问题与挑战

利用组织培养技术对红豆杉细胞悬浮培养。直接分离得到紫杉醇，这是一条很有发展潜力的获取紫杉醇的途径，现已有9种红豆杉植物建立了细胞悬浮培养系统，培养技术的研究取得了很大进展。

近年来，国内外在红豆杉人工栽培、紫杉醇化学合成与半合成、真菌发酵、红豆杉细胞培养、代谢工程方面的研究取得了很大进展，使紫杉醇的供需矛盾得到了一定程度的缓解，但是这些方法仍存在一定问题。①提取紫杉醇的红豆杉树资源不足，又破坏生态环境，无法持续生产；红豆杉的种繁、栽培与扦插尽管可以解决优选、优