发酵液的预处理

关于发酵液的预处理第1页，课件共70页，创作于2023年2月基本要求：了解发酵液的特性和固液分离及设备，掌握发酵液预处理的方法。重点：降低液体粘度的方法；凝聚与絮凝；发酵液中高价无机离子的除去；杂蛋白的除去。

第2页，课件共70页，创作于2023年2月一、发酵液的一般特征

1、发酵液的组成

（1）大部分是水；

（2）细胞或碎片；

（3）少量未用完的培养基；

（4）一定量的代谢产物及副产物。

第一节概述第3页，课件共70页，创作于2023年2月

2、发酵液的特性

（1）发酵产物浓度较低，大多为1%~10%；大部分为水，一般为90%~99%。

（2）发酵液中的悬浮固形物主要是菌体和蛋白的胶状物，其颗粒小，带电荷，可形成稳定的胶体溶液；相对密度与液相相差不大；固体粒子可压缩性大；液相粘度大，大多为非牛顿型流体。

（3）发酵液中含有培养基成分，对后续操作产生一点影响。

（4）发酵液中有代谢产物及性质相似的副产物

（5）发酵液中还含有色素、毒性物质、热原质等有机杂质，导致其性质不稳定，随时间变化。（空气氧化、微生物污染、蛋白酶水解）第4页，课件共70页，创作于2023年2月第5页，课件共70页，创作于2023年2月二、发酵液预处理的目的和要求

1、发酵液预处理的目的（1）改变发酵液的物理性质，促进从悬浮液中分离固形物的速度，提高固液分离器的效率；（2）尽可能使产物转入便于后续工序处理的某一相中（多数是液相）；（3）去除发酵液中部分杂质，以利于后续各步操作。第6页，课件共70页，创作于2023年2月2、发酵液预处理的要求预处理要满足以下要求，才能达到目的。（1）菌体分离采用离心和过滤方法。胞外产物，预处理时应尽可能使产物转移到液相，然后用固液分离除去固相。胞内产物，则应先收集菌体或细胞，经细胞破碎后，使产物转移到液相，再用固液分离除去细胞碎片。

第7页，课件共70页，创作于2023年2月（2）固体悬浮物的去除采用过滤方法，获得澄清液（3）蛋白质的去除：可溶性蛋白（4）重金属离子的去除（5）色素、毒性物质、热原质等有机杂质的去除（6）改变发酵液的性质，以利于提取和精制后续工序操作的顺利进行（7）调节适宜的pH和温度第8页，课件共70页，创作于2023年2月

发酵液预处理的方法有三类：提高过滤速度的方法、改变发酵液性质的方法、杂质去除的方法。具体方法有凝聚与絮凝方法、加热法、加水稀释法、调节pH法、加入助滤剂法、加入反应剂法、加吸附剂法或加盐法、高价无机离子去除的方法、可溶性杂蛋白去除的方法、色素及其他杂质去除的方法等。第二节发酵液预处理的方法第9页，课件共70页，创作于2023年2月一、凝聚与絮凝方法采用凝聚和絮凝技术能有效改变细胞、细胞碎片及溶解大分子物质的分散状态，破坏其稳定性，使其聚结成较大的可分离的颗粒，以提高过滤速率，便于分离；同时，还能有效地除去杂蛋白质和固体杂质，提高滤液质量。工业最常用方法之一。

凝聚和絮凝是两种方法，两个概念。第10页，课件共70页，创作于2023年2月

凝聚是向胶体悬浮液中加入某种电解质，在电解质的异电离子作用下，由于胶体粒子之间双电层电排斥作用降低，电位下降，使胶体体系不稳定（脱稳），胶体粒子间因相互碰撞而聚集成1mm大小块状凝聚体的过程。

絮凝是指在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用，将胶体粒子交联成网，形成l0mm大小絮凝团的过程。第11页，课件共70页，创作于2023年2月1、凝聚（1）凝聚机理（原理）凝聚剂的作用有些是对初始粒子表面电荷的简单中和；另一些是消除双电荷层（采用中性盐例如NaCl等）而脱稳；还有一些是通过氢键或其他复杂的形式与粒子相结合而产生凝聚。

第12页，课件共70页，创作于2023年2月双电层的形成及作用发酵液中的菌体、细胞或蛋白质等胶体粒子的表面，由于吸附溶液中的离子和自身基团的电离，一般都带有电荷。在生理pH值下，菌体或蛋白质常常带有负电荷，由于静电引力的作用，使溶液中带相反电荷的阳离子被吸附在其周围，在界面上形成双电层。这种双电层的结构使胶粒之间不易聚集而保持稳定的分散状态。双电层的电位越高，电排斥作用越强，胶体粒子的分散程度也就越大，发酵液过滤就越困难。第13页，课件共70页，创作于2023年2月凝聚值：使胶体粒子发生凝聚的最低电解质浓度（mmol/L），表示电解质的凝聚能力。反离子的价数越高，凝聚值就越小，即凝聚能力越强。阳离子对带负电荷的发酵液胶体粒子凝聚力的次序：Al3+＞Fe3+＞H+＞Ca2+＞Mg2+＞K+＞Na+＞Li+

第14页，课件共70页，创作于2023年2月（2）凝聚剂种类主要是一些无机类电解质，由于大部分被处理物质的颗粒带负电荷，工业上常用的凝聚剂大多为阳离子型，分为：无机盐类：如硫酸铝、矾、硫酸铁和硫酸亚铁。金属氧化物类：如氢氧化铝、氢氧化铁、氢氧化钙或石灰等。聚合无机盐类：如聚合铝和聚合铁等。第15页，课件共70页，创作于2023年2月2、絮凝（1）机理：絮凝剂主要起架桥作用，即一个高分子聚合物（絮凝剂）的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面上，产生桥架联接时，形成了较大的絮团。第16页，课件共70页，创作于2023年2月絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物，其相对分子量可达数万至一千万，具有长链状结构，其链节上含有许多活性官能团。通过静电引力、范德华力或氢键的作用，强烈地吸附在胶粒的表面。絮凝剂的结构要求：一方面要求其分子必须含有较多的活性官能团，使之能和胶体粒子结合；另一方面要求有长链的线性结构，以便同时和多个胶体粒子结合。第17页，课件共70页，创作于2023年2月（2）絮凝剂的分类A、按絮凝剂官能团分为三大类型：

阴离子性：聚丙烯酸钠和聚苯乙烯磺酸。

阳离子性：聚丙烯酸二烷基胺乙酯和聚二烯丙基四胺盐。

非离子性：聚氧化乙烯等。B、根据来源分:

有机高分子聚合物：聚丙烯酰胺类衍生物、聚苯乙烯类衍生物。

无机高分子聚合物：聚合铝盐、聚合铁盐等。

天然高分子有机物：海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖等。第18页，课件共70页，创作于2023年2月常用的絮凝剂：有机合成的聚丙烯酰胺类衍生物。优点：絮凝速度快，絮凝体粗大，用量小，分离效果好，适用范围广。缺点：有一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺，不宜用于食品及医药工业。聚丙烯酸类阴离子絮凝剂，无毒，可用于食品及医药工业。第19页，课件共70页，创作于2023年2月（3）影响絮凝效果的因素（A）絮凝剂的用量：一般为粒子表面积约有一半被聚合物覆盖时所用的絮凝剂量；（B）絮凝剂的相对分子量和类型；（C）溶液的pH值；（D）搅拌速度和时间。在絮凝过程中，常需要加入一定的助滤剂以增加絮凝效果。第20页，课件共70页，创作于2023年2月3、混凝无机电解质和絮凝剂交叉使用，可以大大提高絮凝的效果，这种包括凝聚和絮凝机理的过程，称为混凝。对带负电荷的菌体或蛋白质，阳离子型高分子絮凝剂同时具有降低胶粒双电层电位和产生吸附桥架的双重机理，所以可以单独使用。对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，则主要通过分子间引力和氢键作用产生吸附桥架，所以它们常与无机电解质凝聚剂搭配使用。第21页，课件共70页，创作于2023年2月在β-半乳糖苷酶（胞内酶）发酵液中采用絮凝技术除去细胞碎片的方法，利用脱乙酰壳多糖和聚乙烯亚胺阳离子絮凝剂以及氯化钙无机电解质，分别在细胞破碎前后处理发酵液，有机絮凝剂在破碎前预先加入640ppm，氯化钙在破碎后加入40mmol/L，并调节一定的pH，这样可将细微的细胞碎片粒子聚集起来。絮凝处理的结果不仅大大改善了离心分离后滤液的澄清度，使细胞碎片的去除率提高了十倍以上，而且凝固了部分可溶性杂蛋白质，滤液总蛋白的含量降低了40％。实验还证明，在絮凝过程中，β-半乳糖苷酶的活性并没有受到影响。第22页，课件共70页，创作于2023年2月二、加水稀释法和加热法（降低液体粘度的方法）根据流体力学原理，滤液通过滤饼的速率与液体的粘度成反比，因此，降低液体的粘度可有效提高过滤速度。常用的方法：加水稀释法和加热法。1、加水稀释法加水一倍，粘度下降50%以上才有效。2、加热法升高温度可有效降低液体粘度，提高过滤速率；同时，使蛋白质凝聚，形成较大的凝聚体，进一步改善发酵液的过滤特性。需控制加热温度和时间。

第23页，课件共70页，创作于2023年2月三、调整pH法（常用方法）

pH直接影响发酵液中某些物质的电解质和电荷性质，适当调节pH值可改善其过滤特性。原理：（1）等电点沉淀法大多数蛋白质的等电点在酸性范围内（pH4.0-5.5），利用酸性来调节发酵液pH使之达到等电点，可除去蛋白质等酸性两性物质。第24页，课件共70页，创作于2023年2月（2）在膜过滤中，发酵液中的大分子物质易于与膜发生吸附，调整pH改变易吸附分子的电荷性质，减少堵塞和污染。（3）细胞、细胞碎片及某些胶体物质等在某个pH值下也可能趋于絮凝而成为较大颗粒，有利于过滤的进行。第25页，课件共70页，创作于2023年2月四、加入助滤剂法助滤剂是一种颗粒均匀、质地坚硬、不可压缩的惰性粒状物质，用于扩大过滤表面的适用范围，使非常稀薄或非常细小的悬浮液在过滤时发生的快速挤压和介质堵塞现象得到减轻，易于过滤。

硅藻土、纤维素、石棉粉、珍珠岩、淀粉、活性炭等。第26页，课件共70页，创作于2023年2月1、助滤剂使用原理充当过滤介质的助滤剂表面具有吸附胶体的能力，并且由此助滤剂颗粒形成的滤饼具有格子型结构，不可压缩，滤孔不会被全部堵塞，可以保持良好的渗透性，既能使悬浮液中细小颗粒状胶态物质截留在格子骨架上，又能使清液有流畅的沟道。悬浮液中大量的细微胶体粒子被吸附到助滤剂表面上，改变了滤饼的结构，使它的可压缩性下降，过滤阻力降低。第27页，课件共70页，创作于2023年2月

2、助滤剂的使用助滤剂的使用方法有两种：

（1）在滤布上预涂一层助滤剂，作为过滤介质使用，待滤毕后与滤饼一起除去；（2）助滤剂按一定比例均匀地混入待滤的发酵液中，然后一起进入过滤机，使其形成较松的滤饼，降低其可压缩性，让滤液可以顺畅流通。这两种方法经常同时使用，以提高过滤速度。第28页，课件共70页，创作于2023年2月选择和使用助滤剂要点：

（1）根据目的产物选择助滤剂品种；（2）根据过滤介质和过滤情况选择助滤剂品种；（3）助滤剂粒度的选择；（4）助滤剂使用量的选择。第29页，课件共70页，创作于2023年2月五、加入反应剂法加入某些不影响产物的反应剂，可消除发酵液中某些杂质对过滤的影响，提高过滤速率。反应剂和某些可溶性盐类（如CaSO4、AlPO4等）生成不溶性沉淀，生成的沉淀能防止菌丝体粘结，沉淀本身还可作为助滤剂，并能使胶状物和悬浮物凝固，从而改善过滤性能。第30页，课件共70页，创作于2023年2月六、加吸附剂法或加盐法该法是将吸附剂加入到细菌发酵液中，使菌体吸附在吸附剂上的方法；或用无机盐等在发酵液中形成的大絮状物把发酵液中的悬浮粒子吸附在其中，使悬浮粒子沉淀下来，从而大大改善发酵液的过滤特性。采用的吸附剂：磷酸氢二钠和氯化钙形成的CaHPO4凝胶、氧化铝凝胶、聚丙酰胺凝胶等。第31页，课件共70页，创作于2023年2月

七、高价无机离子去除的方法

发酵液中主要的无机离子有：Ca2+、Mg2+和Fe3+等。主要影响离子交换树脂的交换容量。1、钙离子的去除发酵液中的钙离子主要来自培养基中的营养盐成分，常采用酸化剂将其除去。通常使用的酸化剂为草酸以及草酸钠，形成草酸钙沉淀。草酸钙还能使杂蛋白质凝固，改善发酵液的过滤性能。第32页，课件共70页，创作于2023年2月2、镁离子的去除用三聚磷酸钠，形成磷酸镁沉淀，即可消除对离子交换的影响。（三聚磷酸钠也可除去钙离子）3、铁离子的去除用黄血盐，形成普鲁士蓝沉淀。也可采用加入碱化剂（如NaOH、NH4OH等）生成Fe（OH）3沉淀，同时也能沉淀部分蛋白质。第33页，课件共70页，创作于2023年2月八、可溶性杂蛋白质去除的方法对产品分离过程的危害：（1）直接影响产品质量和收得率；（2）杂蛋白质产生乳化现象，使两相分离不清；（3）杂蛋白质使过滤介质堵塞或受污染，影响过滤速率。杂蛋白质的去除以下常用方法。第34页，课件共70页，创作于2023年2月1、等电点沉淀法利用蛋白质两性物质在等电点时溶解度最低，易产生沉淀的性质。用酸或碱调发酵液pH。2、加热变性法（最常用）

蛋白质从有规则的排列变成不规则结构的过程，称为变性，变性蛋白质的溶解度较小。加热不仅使蛋白质变性，同时降低液体枯度，提高过滤速率。柠檬酸生产，发酵液加热80℃，蛋白质变性凝固和降低发酵液粘度，即可大大提高过滤速率

。第35页，课件共70页，创作于2023年2月3、化学变性沉淀法使蛋白质变性的化学因素有：极端pH、加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等。生产常用的方法：（1）调pH使蛋白质变性沉淀如在抗生素生产中，常将发酵液pH调至酸性范围(pH2~3)或碱性范围(pH8~9)使蛋白质凝固，一般以酸性下除去的蛋白质较多。第36页，课件共70页，创作于2023年2月（2）加入有机溶剂、碱金属中性盐、表面活性剂等，使蛋白质粒子的双电层破坏，而沉淀。（3）加入化学试剂pH＜PI，与一价阴离子形成沉淀；

pH＞PI，与一些阳离子形成沉淀蛋白质在酸性溶液中，与阴离子（三氯乙酸盐等）形成沉淀；在碱性溶液中，与阳离子（Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+、Pb2+）形成沉淀。第37页，课件共70页，创作于2023年2月变性法存在一定的局限性。如加热法只适合于对热较稳定的目的产物；极端pH也会导致某些目的产物失活，并且要消耗大量酸碱；而有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。第38页，课件共70页，创作于2023年2月

4、吸附法加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。例如在枯草芽抱杆菌发酵液中，加入氯化钙和磷酸氢二钠，两者生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去，从而可加快过滤速率。第39页，课件共70页，创作于2023年2月九、色素及其他杂质去除的方法常用脱色方法：离子交换和活性炭吸附等方法。第40页，课件共70页，创作于2023年2月第三节发酵液固液分离及设备一、发酵液固液分离的方法发酵液的固液分离是指用过滤、离心等手段除去发酵液中的悬浮固体（如菌体、细胞、细胞碎片、蛋白质及其絮凝体）的过程。第41页，课件共70页，创作于2023年2月1、发酵液固液分离的目的产物或是胞内或是胞外。（1）为获得含所需产物的细胞（菌丝体）或发酵液；（2）为除去发酵液中的固形杂质。2、影响发酵液固液分离的因素（1）菌种：决定发酵液中各种悬浮粒子的大小和形状；（2）发酵液黏度：发酵条件（pH、温度）培养基成分、发酵时间、杂菌污染、消泡剂等。第42页，课件共70页，创作于2023年2月

3、发酵液固液分离的方法发酵液固液分离的主要方法：过滤和离心分离。不同性状的发酵液应选择不同的固液分离方法和设备。霉菌和放线菌（细胞体积较大的丝状菌）：过滤；细菌和酵母菌：高速离心机分离；发酵液采用絮凝和添加助滤剂预处理后，也可过滤。第43页，课件共70页，创作于2023年2月第44页，课件共70页，创作于2023年2月二、离心分离及设备离心分离是指在离心场的作用下，将悬浮液中的固相和液相加以分离的方法。离心分离主要用于颗粒较细的悬浮液和乳浊液的分离。离心分离的方法按照离心原理的不同分为：差示离心、均匀介质离心、密度梯度离心、等密度梯度离心和平衡等密度梯度离心等。第45页，课件共70页，创作于2023年2月离心机是利用转鼓高速转动所产生的离心力，来实现悬浮液、乳浊液分离或浓缩的一类机械。离心力比重力高几千到几十万倍。离心分离的特点：

（1）分离速度快，分离效率高，液相澄清度好；（2）投资高，能耗大，连续排料时，固相干度不如过滤设备。第46页，课件共70页，创作于2023年2月按离心机工作原理，可分为过滤式离心机和沉降式离心机。1、过滤式离心机在转鼓上开有小孔，有过滤介质，在离心力作用下，液体穿过过滤介质，经小孔流出而得以分离。用于处理固体颗粒较大、固体含量较高的悬浮液。

第47页，课件共70页，创作于2023年2月过滤式离心机（1）三足式离心机（2）刮刀式离心机（手动、自动）（3）锥篮式离心机（立锥、卧锥）（4）卧螺-活塞式离心机分离原理：过滤型；进料、卸料为间隙式。第48页，课件共70页，创作于2023年2月离心机在高速运转(装料转速)时，开始装料，介质经进料管、布料管至布料盘，在布料盘上获得足够的离心力而甩至转鼓壁，在离心力作用下通过滤网将液体滤出，液体(母液)经底盘集液槽至出液管排出，当滤饼重量(或体积)达到机器额定装料重量(或容量)时，关闭进料阀，离心机加速至额定转速，对介质更进一步分离，当达到分离要求后，离心机低速运转，刮刀装置按规定程序进行刮料，滤饼从底盘卸料斗落至接料盘或输送带上，完成一次工作循环。第49页，课件共70页，创作于2023年2月2、沉降式离心机转鼓上无小孔，不需过滤介质，在离心力作用下，物料按密度的大小不同分层沉降而得以分离。用于固-液、液-液和液-液-固分离。分离依据：（1）相对的密度差；（2）液体的粘度和固体颗粒的形状；（3）离心力大小；（4）液体表面积。第50页，课件共70页，创作于2023年2月（1）碟片式离心机是沉降式离心机的一种，最广泛使用。适用于细菌、酵母菌、放线菌等细胞悬浮液及细胞碎片悬浮液；分离因数1000~20000；生产能力较大，最大处理量300m3/h，一般用于大规模分离过程。第51页，课件共70页，创作于2023年2月第52页，课件共70页，创作于2023年2月（2）管式离心机也是沉降式离心机的一种。

管式离心机结构简单、操作稳定，分离效率高，特别适用于固形物浓度低（低于1%）的发酵液的分离；因转鼓容积小，不能连续工作，生产能力较小。

第53页，课件共70页，创作于2023年2月分离效率很高，分离因数为1万~60万。用于细胞分离以及细胞碎片、细胞器、病毒、蛋白质、核酸等生物大分子的分离。用于固-液和液-液分离。液-液分离为连续操作，固-液分离为间歇操作。第54页，课件共70页，创作于2023年2月（3）倾析式离心机倾析式离心机依靠离心力和螺旋的推进作用自动连续排渣，也称螺旋卸料沉降离心机。第55页，课件共70页，创作于2023年2月倾析式离心机结构紧凑、操作连续、适应性强、应用范围广、维修方便。特别适用于含固形物较多的液体分离。但分离因数低，为1500~3000。不适合于酵母、细菌等微生物悬浮液的分离。常用于淀粉精制和废液处理。第56页，课件共70页，创作于2023年2月三、过滤分离及设备过滤的原理是悬浮液通过过滤介质时，固态颗粒与溶液分离。按过滤机理，过滤操作可分为澄清过滤和滤饼过滤两种。

第57页，课件共70页，创作于2023年2月澄清过滤：用硅藻土、活性碳以及金属、非金属烧结材料等过滤介质，形成过滤层，当悬浮液通过过滤层时，固体颗粒被阻拦或吸附在介质上，使滤液澄清。过滤介质起主要的过滤作用。适于固体含量低于0.1g/100mL、颗粒直径在5~100µm的悬浮液。麦芽汁、酒类、饮料、饮用水。第58页，课件共70页，创作于2023年2月滤饼过滤：以滤布为过滤介质，当悬浮液通过滤布时，固体颗粒被滤布阻拦而逐渐形成滤饼，当滤饼达到一定厚度时，即可起过滤作用，可获得澄清的滤液。悬浮液自身形成的滤饼起主要过滤作用。滤布：天然或合成纤维织布、金属织布、石棉板、玻璃纤维板、合成纤维等。适于固体含量大于0.1g/100mL的悬浮液。滤饼过滤按推动力的不同可分为四种：重力过滤、加压过滤、真空过滤和离心过滤。第59页，课件共70页，创作于2023年2月1、板框过滤机(p54)第60页，课件共70页，创作于2023年2月板框过滤机应用于培养基制备以及霉菌、放线菌、酵母菌和细菌等发酵液的固液