第八章环境毒理学常用研究方法演示

（优选）第八章环境毒理学常用研究方法目前一页\总数七十页\编于十八点毒理学研究方法体内实验invivotests体外实验invitrotests(1)流行病调查/临床观察(2)动物实验目前二页\总数七十页\编于十八点第一节实验准备1.1动物的准备①选择实验动物②编号与标记③固定与麻醉目前三页\总数七十页\编于十八点（1）选择实验动物黏膜刺激高血压目前四页\总数七十页\编于十八点1）种属的选择原则在机体反应上与人体近似易获得、易饲养、易管理敏感、合适－实验资料目前五页\总数七十页\编于十八点目前六页\总数七十页\编于十八点大鼠－致癌豚鼠－过敏反应目前七页\总数七十页\编于十八点常用动物介绍①猫气体、蒸气对黏膜的刺激②豚鼠或兔皮肤③豚鼠过敏性反应④猫、狗、兔呕吐⑤兔和猫体温⑦狗、兔、大鼠血压⑧大鼠和小鼠致癌⑨小鼠慢性中毒对脏器的损害目前八页\总数七十页\编于十八点2）个体选择①年龄：幼年>成年，急性实验－成年②性别：无特殊要求就雌雄各半③生理状态：如怀孕、哺乳④健康状态：检查、预检目前九页\总数七十页\编于十八点（2）实验动物的标记编号染色、烙印、号牌大动物：记录外表和毛色目前十页\总数七十页\编于十八点（3）实验动物的捕捉及固定做好防护戴厚手套用器具固定目前十一页\总数七十页\编于十八点目前十二页\总数七十页\编于十八点目前十三页\总数七十页\编于十八点目前十四页\总数七十页\编于十八点目前十五页\总数七十页\编于十八点（4）实验动物的随机分组分2组：任意从随机数字表的某一行某一数字开始抄录14个数

再抄录一个数字为78，因为归入A组的小鼠有8只，故以8除，得余数6。于是把第6个A（即编写为第12号的小鼠）划给B组

目前十六页\总数七十页\编于十八点分3组：再取一个随机数除以6，看余数目前十七页\总数七十页\编于十八点（5）实验动物的麻醉动外科手术避免剧烈挣扎麻醉药物：乙醚目前十八页\总数七十页\编于十八点（1）全身麻醉a）吸入法：开放法、封闭法－挥发性b）腹腔和静脉给药麻醉法－非挥发性（2）局部麻醉a）猫：一般应用0.5-1.0%盐酸普鲁卡因注射。粘膜表面麻醉宜用2%盐酸可卡因b）兔在眼球手术时，可于结膜囊滴入0.02%盐酸可卡因溶液，数秒钟即可出现麻醉c）狗：用0.5-1%盐酸普鲁卡因注射。眼鼻、咽喉表面麻醉可用2%盐酸可卡因目前十九页\总数七十页\编于十八点目前二十页\总数七十页\编于十八点麻醉注意事项（1）静脉注射必须缓慢，同时观察肌肉紧张性、角膜反射和对皮肤夹捏的反应。当这些活动明显减弱或消失时，立即停止注射。配制的药液浓度要适中。（2）麻醉时需注意保温。麻醉期间，动物的体温调节机能往往受到抑制，出现体温下降。保温的方法有：实验桌内装灯，电褥，台灯照射等。无论用哪种方法加温都应根据动物的肛门体温而定。（3）慢性实验时，在寒冷冬季，麻醉剂在注射前应加热至动物体温水平。目前二十一页\总数七十页\编于十八点1.2毒物的准备（1）了解毒物的物理常数

密度、溶解度、蒸汽压、熔点、沸点、油/水分配系数等（2）剂型：

毒性高、刺激性大－稀释固态－溶液、软膏目前二十二页\总数七十页\编于十八点（3）溶剂：①本身毒性很小或无毒②不与受检毒物产生增毒或减毒作用③不影响毒物吸收④无特殊的刺激性或气味目前二十三页\总数七十页\编于十八点1.3生物材料的采集和制备（1）血液的采集需求少刺破组织取毛细血管的血需求多静脉采血、动脉注意：光线、温度、器皿消毒、抗凝剂目前二十四页\总数七十页\编于十八点割（剪）尾取血眼眶静脉丛采血断头取血颈动脉取血腹主动脉股动（静）脉取血目前二十五页\总数七十页\编于十八点目前二十六页\总数七十页\编于十八点目前二十七页\总数七十页\编于十八点（2）尿液的收集连续收集在代谢笼下配置粪尿分离漏斗一次性尿液收集逼尿法、导尿法、输尿管插管法剖腹采集尿液、提鼠采集尿液

目前二十八页\总数七十页\编于十八点目前二十九页\总数七十页\编于十八点尿液收集注意事项实验期间膳食一致，特定时间完成收集防止尿液的污染标本迅速测定或冷冻保存避免器皿污染灌喂水或青菜满足尿量需求目前三十页\总数七十页\编于十八点（3）粪便的收集代谢笼、粪尿分离器外观形态新鲜、完整，分析时取内层粪便器皿干净目前三十一页\总数七十页\编于十八点（4）呼出气的收集研究毒物的吸收代谢和对肺功能的影响动物需固定目前三十二页\总数七十页\编于十八点（5）组织匀浆的制备酶：取样－洗净－研磨－离心－测定用于毒物的测定目前三十三页\总数七十页\编于十八点1.4预备试验（1）选择合适的实验动物（2）设计染毒剂量及其分组（3）操作技术的检验和训练（4）发现新线索、新指标目前三十四页\总数七十页\编于十八点第二节常用染毒技术2.常用染毒途径吸入染毒、经皮肤染毒－最重要的灌胃气管注入注射（腹腔、静脉、肌内、皮下）目前三十五页\总数七十页\编于十八点根据实验目的进行选择，同时考虑：（1）人群接触环境毒物的实际情况生产车间－呼吸道（2）毒物的理化性质固态、液态、气态（3）受检毒物的来源消耗量的大小目前三十六页\总数七十页\编于十八点2.1吸入染毒法－大气污染物1）动式吸入染毒法优点：①柜内毒物浓度相对稳定②受试环境具有持久的稳定性缺点：①毒物消耗量大目前三十七页\总数七十页\编于十八点2）静式吸入染毒法－急性在具有一定气体容积的密闭容器中或在密封染毒柜内进行优点：设备简单，操作方便缺点：要经过一段时间才能达到实验浓度要求目前三十八页\总数七十页\编于十八点3）面罩染毒法优点：避免皮肤吸收注意检查面罩的密封性4）吸入染尘法颗粒污染物<5μm目前三十九页\总数七十页\编于十八点2.2气管注入法经喉插入法气管穿刺法暴露气管穿刺法①适用于颗粒物染毒。②颗粒物可制备成生理盐水混悬液，也可将颗粒物中的有害成分提取，再用提取物进行染毒。③此法需在动物麻醉下进行，难度较大，适宜急性试验

目前四十页\总数七十页\编于十八点2.3经口染毒法不挥发性液体和固体毒物灌胃法－液体或制剂喂饲法－混在食物中经口滴入－淀粉糊剂吞咽－胶囊目前四十一页\总数七十页\编于十八点2.4注射染毒法毒物对局部损害不能太大①腹腔注射②肌内注射

不溶于水但溶于油或其他溶剂③静脉注射④皮下注射⑤皮内注射目前四十二页\总数七十页\编于十八点目前四十三页\总数七十页\编于十八点2.5经皮染毒法家兔和豚鼠斑贴法兔耳法结膜囊染毒目前四十四页\总数七十页\编于十八点第三节毒理学实验的设计方法3.1实验设计明确实验目的、了解毒物、预备实验实验类型（急性、慢性）、实验动物染毒方式、浓度分组、对照组（平行、自身）3.2动物分组随机化目前四十五页\总数七十页\编于十八点第四节急性毒性实验4.1急性毒性实验的内容①急性毒性测定－LD50/LC50②皮肤染毒实验－经皮肤进入③局部作用实验－有无刺激腐蚀④中毒症状的观察－作用程度、部位⑤功能及病理组织学检查－部位、程度目前四十六页\总数七十页\编于十八点4.2哺乳动物的急性毒性实验一、半致死剂量的测定（途径？）（1）动物准备(小动物、预观察)（2）剂量选择（3）药液配置及染毒－等容量法（4）症状观察（5）病理学检查及其他指标观察（6）结果评价－LD50、毒性级别目前四十七页\总数七十页\编于十八点剂量的选择①预实验测定：最大无作用剂量、100％死亡剂量②按等比级数（<2.2,一般1.2~1.5）间距设计浓度系列，系列浓度中有一个的死亡率为40～60％为最佳目前四十八页\总数七十页\编于十八点二、急性阈剂量的测定关键：选定适当的观测指标机理—肝肾、有机磷农药—胆碱酯酶新化学物质—整体状态、非特异性指标实验方法游泳试验、刺激阈试验目前四十九页\总数七十页\编于十八点三、局部作用试验皮肤和黏膜症状（豚鼠、家兔）急性皮肤刺激/腐蚀试验急性眼刺激/腐蚀试验

结膜囊染毒目前五十页\总数七十页\编于十八点四、急性联合毒性的测定过筛试验确定大概的作用类型1/2LD50

①死亡率>80%，增毒；30％～80％，相加；<30％，拮抗②实测死亡率（O）/预期死亡率（P）目前五十一页\总数七十页\编于十八点混合毒物LD50的测定方法①分别测定各毒物的LD50②按等毒性比例混合测定混合毒物的LD50③评定作用类型K<0.4拮抗；0.4<K<2.5相加；K>2.5协同目前五十二页\总数七十页\编于十八点4.3水生动物毒性实验一、鱼类毒性实验动物选择—区域代表性实验条件—水温、溶氧、pH二、甲壳动物实验水蚤幼虫的准备TLm的测定目前五十三页\总数七十页\编于十八点斑马鱼青鳉鱼目前五十四页\总数七十页\编于十八点第五节毒物蓄积的研究方法蓄积毒性作用：物质蓄积：环境污染物进入>排出功能蓄积：结构和功能变化的积累慢性、亚慢性实验必须先评价蓄积性目前五十五页\总数七十页\编于十八点5.1物质蓄积的研究方法生物蓄积的极限值与其在单位时间内的吸收量成正比生物半衰期越短，达到极限所需时间就短A=a×T1/2×1.44目前五十六页\总数七十页\编于十八点5.2功能蓄积的研究方法K=

ED50(n)

ED50(1)

①固定剂量连续染毒法；>5LD50，蓄积作用不明显②剂量定期递增染毒法（等比递增）③20天蓄积实验法－停药7天内死亡情况目前五十七页\总数七十页\编于十八点LD50K>5,轻度蓄积目前五十八页\总数七十页\编于十八点5.3蓄积率的测定方法蓄积率＝×100％预给剂量对照组LD50-预给组LD50蓄积量＝对照组LD50－预给组LD50目前五十九页\总数七十页\编于十八点第六节亚慢性和慢性毒性实验必须先做蓄积实验判断可能性6.1亚慢性毒性实验(1/30～1/20)①动物要求敏感、两种（啮齿类、非啮齿类）

健康、年幼②剂量（高、中、低）一般取LD50的1/80～1/50，每天定时染毒，剂量相等③观察指标一般指标、生化指标、病理学检查目前六十页\总数七十页\编于十八点6.2慢性毒性实验实验时间一般要求1～2年或者终生染毒一般要求选用几种动物，年龄要小设3～4个剂量组和一个对照组LD50的1/1000～1/20之间取3～4个剂量注意事项：指标提前观察、同步进行、注意异常情况、延长饲养时间继续观察目前六十一页\总数七十页\编于十八点第七节致癌性实验7.1长期动物实验①实验动物的选择：抗病力强、容易饲养、肿瘤自发率低、寿命长、对受试物敏感。两种或以上动物②动物数目：小型动物50只；大型减少③剂量分组与对照（阴性、阳性对照）：

高剂量（加速致癌）、低剂量（接近人类）目前六十二页\总数七十页\编于十八点④染毒途径：口、皮肤、注射⑤实验时间：动物生命期的1/3～1/2⑥指标观测：外表、行为、X射线、病理学检查⑦结果评判：

潜伏期：第一例病理学检查：恶性、良性、癌前期变阳性结果的判断：肿瘤数、潜伏期短目前六十三页\总数七十页\编于十八点7.2短期筛检方法Ames实验：外源化学物致突变作用DNA修复测定：3H-Tdr哺乳动物细胞的体外恶性转化目前六十四页\总数七十页\编于十八点Ames试验组氨酸营养缺陷型菌株（His-）