生物化学冲刺串讲

第一 糖

（第二 之类和生物膜 （第三 蛋白质 （第四 第五 核

（（第六 维生素、激素和抗生 （第七 代谢总论、生物氧化和生物能 （第八 糖代第九 脂代

（（第十章 蛋白质降解与氨基酸代谢第十一 核算降解与核苷酸代

（（第十二 ＤＮＡ的复制、损伤修复及重 （第十三 ＲＮＡ生物合 （转录 （第十四 蛋白质的生物合 （第十五 细胞代谢与基因表达调 （第十六 基因工程和蛋白质工程 （生物化学主要内容及分值分１．常见生物大分子的结构与功能，４５包括糖、脂、蛋白质、核酸的生物化学，主要是大分子的结构组成与功能特点；脂蛋白质＋核 包括生物大分子的结构特征、大分子构件的结构特征，生物学功能、结构与生物学功能的适应特点，分离纯化技术原理，２．酶学 酶通论酶反应动力酶的作用机制及调节维生素激酶学的基本理论，酶的活性调节类型、激素、维生素如何参与酶活性的调节而影响代谢３．生物能学及物质代谢与能量代 （３０％）代谢总论、生物能学、生物氧化（）糖代谢蛋白质代谢脂代谢核苷酸代细胞能量的代谢调４．核酸及蛋白质的生物合成。（）３０ＤＮＡ生物合成ＲＮＡ生物合成蛋白质生物合成基因表达调控５．基因工程技术（）１５１第一 糖知识要点１．掌握糖的生物学作用；糖的旋光异构等基本概念；单糖半缩醛羟基的还原２．糖蛋白、糖胺聚糖和蛋白聚糖的结构多样性和各自的主要生物学功能；各种多糖的单组考点１：糖类的生物学作用结构物质；能源储存物质细胞膜及其他细胞结构中的糖如血型糖；活性糖分子是重要的信息分子 信息分子食用菌中的糖 （香菇多糖、茯苓多糖、灵芝多糖、昆布多糖等）可以作为药物使用； 生理活性；糖类是重要的中间代谢物，可以转化为氨基酸、核苷酸和脂类。 中间代谢物考点２：糖的定义１．糖类主要由Ｃ、Ｈ、Ｏ三种元素组成，有些还有Ｎ、Ｓ、Ｐ等 单糖多符合结构通式（ＣＨ２Ｏ）ｎ，但仅从通式上并不能判断某分子是否就是糖，即：符合通式的不一定是糖，如ＣＨ３ＣＯＯＨ（乙酸），ＣＨ２Ｏ（甲醛），Ｃ３Ｈ６Ｏ３（乳酸）；是糖的不一定都符合通式，如Ｃ５Ｈ１０Ｏ４（脱氧核糖），（鼠李糖）。糖类可以定义为：多羟基醛；多羟基酮；多羟基醛或多羟基酮的衍生物；可以水解为多羟基醛或多羟基酮或它们的衍生物的物质。最小的糖分子是二羟基丙酮或甘油醛考点３：糖的旋光异构体及其性质旋光异葡萄糖及绝大多数糖都有使平面偏振光发生偏转的能力，即糖的旋光性，是因为糖都具有手性碳。糖的旋光性和旋光度由糖分子中的所有手性碳上的羟基方向所决定。糖的旋光性以右旋（以Ｄ或表示）或左旋（以或表示）以甘油醛为标准（构型命名系统）；构型命名系统。８．构型是指一个分子由于其各原子特有的空间排列而使该分子具有特定的立体化学结构。当一个物质由一种构型转变为另一种构型时，要求有共价键的断裂或重新形成。表明一个物质应有其特定的构型。糖苷键有α、β构型，（一个环状多糖有α、β两种异头物，异头碳的羟基与最末的手性碳的羟基具相同取向，为α异头物。）糖的构型与旋光性之间不一定相对应，即Ｄ型不一定代表右旋、Ｌ型也不一定代表左旋，因为两者的规定性不同。对于葡萄糖来说，型正好是右旋，型也正好是左旋。２构型不同，糖的种类不同，生物学性质也各糖有四个手性碳，构型有２４＝糖有四个手性碳，构型有２４＝构型不同，糖的种类不同，生物学性质也各异由于手性碳的存在，导致糖的单体种类很多，远超过其他的大分子单体种类，所以糖类存在结构的多样性，而结构的多样性也蕴含着糖可携带信息的多样性，所以糖蛋白是信息识别的重要结构基础。（糖链）。９．构象指一个分子中，不改变共价键结构，仅靠单键的旋转或扭曲而改变分子中基团在空的排布位置，而产生不同的排列方式。根据Ｘ－射线晶体分析，葡萄糖吡喃环与环己烷的椅式结构相似，ｂ葡萄糖的可能构象有２种椅式（Ａ，Ｂ）和６种船式，主要是椅式。构象与稳定性相淀粉与纤维素的糖苷键的区别考点４：醛基糖还原性相关的性醛基具有还原性，在单糖中，醛基糖与酮糖可以发生互变异构。多糖具有还原端和非还原端，但不具还原性。糖的还原性可以有：Ｆｅｈｌｉｎｇ反应，，糖的多羟基可以形成苯腙一些重要多糖的单体淀粉、纤维素、糖原：葡萄糖蔗糖：葡萄糖β１，２果糖菊糖：果聚几丁质：Ｎ－乙酰－葡萄糖胺果胶 杂多糖糖胺聚糖：己糖醛酸和己糖胺重复二糖单位构成，二单位常被带负电荷的羧基或硫酸基修饰，因此呈酸性。如硫酸软骨素、透明质酸、硫酸角质素等。考点５：糖蛋白及其生物学功１．糖蛋白：糖链作为蛋白质的辅基的一类蛋白质。（糖链较短，一般小于１５个单糖单位，称寡糖连或聚糖链；许多膜蛋白和分泌蛋白都是糖蛋白，糖成分的含量在１％之间变动。）３常见的糖蛋白有：很多膜蛋白如血型抗原、膜受体等；免疫球蛋白激素蛋白如促黄体素、促性腺激素等；细胞外基质蛋白如胶原蛋白、层黏蛋白等；很多酶如核糖核酸酶、纤溶酶等。２．糖胺聚糖：（ｇｌｙｃｏｓｎｏｇｌｙｃａｎＧＡＧ）：是胞外基质的重要成分，由己糖醛酸和己糖胺重复二糖单位构成，二糖单位常被带负电荷的羧基或硫酸基修饰，因此呈酸性。（糖胺聚糖的主要作用有：保持结缔组织的水分；调节阳离子在组织中的分布；对关节的保护和润滑作用；促进创伤愈合的作用。糖胺聚糖主要有透明质酸、硫酸软骨素、硫酸角质素、肝素等。）５．糖肽连键的类Ｎ－糖肽键：即β－构型的Ｎ－乙酰葡糖胺异头碳与天冬酰胺的γ－酰胺Ｎ原子形成的糖苷键，在血浆蛋白和糖蛋白中分布广泛．糖肽键：即单糖的异头碳与羟基氨基酸的羟基氧原子形成的共价键。包括乙酰半乳糖胺与丝氨酸或苏氨酸形成的糖肽键，主要存在于黏液蛋白和某些球蛋白。半乳糖胺与羟赖氨酸形成的糖肽键，主要存在于胶原蛋白。呋喃阿拉伯糖与羟脯氨酸形成的糖肽键，主要存在于植物，包括细胞壁的伸展蛋白和凝集素等６．糖蛋白的生物学作Ａ．促进新生肽链的正确折叠：基因定点突变法获得的一些去糖基化糖蛋白不能正常折叠，也不能形成正常的聚合体，基因工程中真核细胞表达的糖蛋白因含有糖链而不发生聚集，可分泌到胞外，原核生物的表达产物不能糖基化而聚集成包含体。Ｂ．促进分泌蛋白的分泌及其稳定性Ｃ．参与分子识别和细胞识别如血浆中老蛋白质的清除：不少血清糖蛋白含有以唾液酸残基为末端的Ｎ－糖链糖蛋白，当末端的唾液酸残基被血管壁上的唾液酸酶切除，暴露出半乳糖残基后，可被肝细胞膜上的受体识别，通过胞吞被肝细胞内溶酶体降解。末端唾液酸残基被切除的速率与蛋白质本身结构有关，决定着蛋白质的寿命。精子和卵子的识别：哺乳动物卵子外层的糖蛋白透明带上的糖链能与精子表面的凝集素受体识别，引发精子头部的顶体释放蛋白酶和透明质酸酶使透明带水解，精子核进入卵内。糖链与细胞黏着：组织中细胞与细胞之间充满由糖蛋白、蛋白聚糖和透明质酸组成的胞外基（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘ，Ｍ，细胞交织在网状基质中，细胞与细胞，细胞与基质之间的黏着靠黏着蛋白或细胞黏着分子（ｃｅｌｌａｄｈｅｓｉｏｎｍｌｅｕｌｅ，黏着蛋白多数是含Ｎ－糖链的糖蛋白。淋巴细胞归巢有相似的机制，肿瘤细胞的转移和归巢与黏着蛋白介导的黏着行为有关．Ｄ．糖链与糖蛋白的生物活有些酶是糖蛋白，糖基对酶的活性的影响因酶而异—些蛋白类激素如促卵泡激素（Ｈ、促黄体激素（Ｈ）、促甲状腺激素（Ｈ、红细胞生成素（ＥＰＯ）等均为糖蛋白，糖蛋白糖链对激素的活性及寿命的影响因激素而异。ＩｇＧ是含糖链的蛋白，糖链缺失可以引起相关的自身免疫病。Ｅ．糖链与血型物红细胞表面的血型抗原称凝集原；血清中含有的凝集原的抗体称凝集素，而凝集原的基因凝集原的血型决定族是寡糖，血型基因是一些专一性糖基转移酶。４第二 脂类和生物知识要点１．掌握脂的定义、分类和生物学作用；必须脂肪酸基本概念和种类；生物膜的基本结构与功能２．磷脂的种类和生物学功能；固醇的结构与功能；脂蛋白的分类与功能３．生物膜转运的种类及特点４．熟悉脂质过氧化定义与自由基。考点１：脂质的定义及其生物学作１．脂质的定义：脂质是低溶于水，高溶于非极性溶剂的有机分子。（化学结构的多样性２．脂质的分类：单纯脂质：主要有甘油三酯和蜡；复合脂质：主要有磷脂和糖脂；衍生脂质：主要有取代烃，固醇类，萜和其他脂质（脂质分类是依据结构特点，核心是了解不同脂质的结构特点及功能。）。３．脂质的生物学作用：．贮存能量；构成体质；生物活性物质（固醇类激素等）。考点２：常见脂肪酸及其结构１．脂肪酸的种类：其中棕榈酸（１６：０）、硬脂酸（１８：０）、棕榈油酸（１６：１，９）、油（１８：１，９）、芥子酸（２２：１，１３）、亚油酸（１８：２）、α－亚麻酸（１８：３，９，１２，１５）、γ－亚麻酸（１８：３，６９，１２）、花生四稀酸（１８：３，５８，１１，１４）、ＥＰＡ（２０：５，５，８，１１，１４，１７）和ＤＨＡ（２２：６，４７，１０，１３，１６，１９）等较重要。（天然脂肪酸的双键多为顺式，少数为反式注意双键的位置ω－３系列，ω－６系列双键距离甲基末端的碳原子个数；注意脂类的生理活性；９指的是距离官能团的位置）亚油酸和亚麻酸必须由膳食供给，称必须脂肪酸。亚油酸是花生四烯酸的前体。考点３：活性脂质类二十碳类二十碳烷是由２０碳ＰＵＦＡ衍生而成的，包括前列腺素、凝血烷和白三烯等，合成的前体主要是花生四烯酸。前列腺素存在广泛，种类较多，不同的前列腺素或同一前列腺素作用于不同的细胞，产生不同的生理效应，如升高体温，促进炎症，控制跨膜转运，调整突触传递，诱导睡眠，扩张血管等。凝血 烷最早从血小板分离获得，能引起动脉收缩，诱发血小板聚集，促进血拴形成。白三烯最早从白细胞分离获得，能促进趋化性，炎症和变态反应。阿司匹林消炎、镇痛、退热的原因是抑制前列腺素的合成，也抑制凝血烷合成，因而有抗凝血作用。类固醇：由环戊烷多氢菲为基础的化合物，分子为扁平状，平面上的取代基直立时较稳定，也有平伏状的胆固醇可转化为雄激素、雌激素、糖皮质激素、盐皮质激素和维生素Ｄ。胆固醇在肝脏中可５化为胆汁酸，能使油脂乳化，以促进吸收。考点４：脂质过氧化作用１．自由基：含有奇数价电子并因此在一个轨道上有一个未成对电子的原子或原子团，反应活性极高。（包括：普通氧，超氧阴离子，羟自由基，过氧化氢、单线态氧等）２．自由基链式反应：有少数自由基诱导产生反应，反应过程可以产生更多的自由基，使反应加速，最终完成反应。包括引发、增长、终止三个阶段。（反应性足够强的起始自由基抽去脂质分子的氢原子，或高能辐射使脂质分子均裂，可生成起始脂质自由基。增长：起始脂质自由基通过加成、抽氢、断裂等一种或几种方式生成更多的脂质自由基，这种反应反复进行，即成为链式反应。终止：两个自由基之间可发生偶联或歧化反应，消除自由基，使链式反应终止。）３．脂质过氧化：即脂质的自动氧化，或者多不饱和脂肪酸的或脂质的氧化变质。（脂质过氧化导致生物膜功能异常、动脉粥样硬化、衰老，使脂褐素含量增加、ＤＮＡ损伤等，抗氧化剂或自由基清除剂可以抑制脂质过氧化的发生，常见的抗氧化剂：超氧化物歧化酶（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ，ＳＯＤ）、：、过氧化氢酶（ｃａｔａｌａｓｅ）、谷胱甘肽过氧化物酶（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＧＳＨ－ＰＸ）、维生素Ｅ、某些中药活性成分：如黄酮类和某些苷类化合物、人工合成的抗氧化剂。考点５：磷脂种类及其结包括甘油磷脂和鞘磷脂两甘油磷脂如磷脂酰胆碱（卵磷脂），磷脂酰乙醇胺（脑磷脂）心磷脂（双磷脂酰甘油），ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ）：＂含有两个磷脂酸分子的磷脂。每分子磷脂酸的磷酸基团又分别与一个甘油分子的、上的羟基以酯键相连）等鞘磷脂：即鞘氨醇（一种含有不饱和烃基链的十八碳氨基醇）磷脂，在脑髓鞘和红细胞膜中含量丰富。由鞘氨醇、脂肪酸和磷脂酰胆碱组成。神经酰胺：脂肪酸通过酰胺键与鞘氨醇相连，即为神经酰胺鞘磷脂：即神经酰胺的１位羟基被磷酰胆碱或磷酰乙醇胺酯化形成的化合物鞘糖脂：即神经酰胺的１－位羟基被糖基化形成的化合物，主要分两类：中性鞘糖脂：最先从脑中获得，又称脑苷脂。糖基为半乳糖、葡萄糖等，其糖基在细胞表面，参与细胞识别。酸性鞘糖脂：糖基被硫酸化的称硫酸鞘糖脂或硫苷脂；糖基含唾液酸的称唾液酸鞘糖脂，又称神经节苷脂。考点６：脂蛋白及其功１．血浆脂蛋白的分类：各类血浆脂蛋白的组成如表所示６２．血浆脂蛋白的功能乳糜微粒由小肠上皮细胞合成，主要功能是从小肠转运三酰甘油、胆固醇及其它脂质到血浆和其他组织 （吸收）；在肝细胞的内质网中合成，主要功能是从肝脏运载内源性三酰甘油和胆固醇至各组（合成、储存）的主要功能是转运胆固醇至外围组织，并调节这些部位胆固醇的从头合成新生的前体形式在肝和小肠中合成，改型中吸收死细胞和其它脂蛋白，将胆固醇酯化后快速往复地转送到或ＬＤＬ（内源性脂从组织运输至肝脏）；血浆中水平高而水平低的个体容易患心血管疾病。考点７：生物膜的组成及其功能１．生物膜由蛋白质和极性脂质组成，少量的碳水化合物也是糖蛋白或糖脂的一部分２．所有生物膜拥有共同的基本特征：对多数极性分子或带电分子不通透，允许非极性分子通透；约５－８ｎｍ厚，横切电镜照片近似三层结构。脂类与水相共存时会迅速形成一种脂双分子层结构而避开水的作用，生物膜的厚度（电镜测定为５－８ｎｍ）是由３ｎｍ的脂双分子层和蛋白的厚度决定的，所有证据都支持生物膜由脂双分子层构成。考点８：生物膜的组成与结膜结构的流动镶嵌模型（ＦｌｕｉｄＭｏｓａｉｌ生物膜中兼性的磷脂和固醇形成一个脂质双分子层，非极性部分相对构成双分子层的核心，极性的头部朝外；脂质双分子层结构中，球状蛋白以非正规间隔埋于其中；另一些蛋白则伸出（突出）膜的一面或另一面；还有一些蛋白跨越整个膜。蛋白质在脂双分子层中的方向是不对称的，表现为膜蛋白功能的不对称。脂质与蛋白质之间构成一个流动的镶嵌结构。生物膜结构的特征：膜组分不对成分布；膜流动性７．生物膜的功能：内外屏障；物质交换、细胞间通讯；（生物膜的形成对于生物的物质贮存及细胞间的通讯起着关键作用。）考点９：膜转１．被动运输是顺浓度梯度运输，不会引起物质的积累。被动运输还分为自由扩散（简单扩散）和协助扩散（促进扩散）协助扩散其运输特点是：①比自由扩散转运速率高；②存在最大转运速率，因膜上载体蛋白的结合位点已达饱和相关；③有特异性，即与特定溶质结合。２．主动运输是指物质逆浓度梯度运输，在载体的协助下，在能量的作用下运进或运出细胞膜的过程。主动运输直接或间接地依赖于一些放能过程，非热力学自动发生，往往伴随有光的吸收、氧化作用、水解或其他顺浓度梯度的运输。真题讲解（一）选择１．关于油脂的化学性质的叙述错误的为 Ａ．油脂的皂化值大时说明所含脂肪酸分子７Ｂ．酸值低的油脂其质量也Ｃ．向油脂中加入抗氧化剂是为了除去分子Ｄ．油脂的乙酰化值大时，其分子中所含的羟基也Ｅ．氢化作用可防止油脂的酸２．关于甘油磷脂的叙述错误的 Ａ．在ｐＨ７时卵磷脂和脑磷脂以兼性离子状态存Ｂ．用弱碱水解甘油磷脂可生成脂肪酸Ｃ．甘油磷脂可用丙酮提Ｄ．将甘油磷脂置于水中，可形成微团结Ｅ．甘油磷脂与鞘磷脂的主要差别在于所含醇基不８第三 蛋白知识要点１．掌握蛋白质中常见氨基酸的结构特点及其在蛋白质高级结构中的作用２．掌握等电点的判断，等点点相关的氨基酸、大分子分离技术，如蛋白质的等电点沉淀、电泳时带电性质的判断。３．蛋白质分类的常用方法和生理功能４．熟悉多肽链氨基酸序列测定的基本方法。包括Ｎ－末端和Ｃ－末端分析的常用方法；二硫桥断裂的方法；氨基酸组成分析的方法；肽链部分分解的方法；肽段氨基酸序列的测定方法；肽段拼接的方法；确定二硫桥位置的方法。具备利用实验数据推测短肽链氨基酸序列的能力。５．维持蛋白质高级结构的作用力，蛋白质高级结构与功能的关系，如变性等６．掌握蛋白质二级结构的含义，α－螺旋，β－折叠片、β－转角、β－凸起、无规卷曲等二级结构元件的结构特点。７．掌握超二级结构和结构域的概念。知识要点：８．熟悉肌红蛋白质和血红蛋白的结构和功能。理解协同效应，Ｈｉｌｌ系数，Ｂｏｈｒ效应，ＢＰＧ作用的机制、熟悉常见的血红蛋白分子病。９．掌握利用沉淀法、凝胶过滤法、离子交换层析法、亲和层析法、快速液相层析法、ＰＡＧＥ法、ＩＥＳ法、ＩＥＳ－ＰＡＧＥ双向电泳法等方法分离分析蛋白蛋的基本原理和基本步骤，熟悉测定蛋白质含量的常用方法。考点１：氨基酸的分１．常见的蛋白质氨基酸共二十种２．按化学结构分为脂肪族、芳香族和杂环族三类３．按基的极性分为非极性基氨基酸、不带电荷的极性基氨基酸、带正电荷的极基氨基酸、带负电荷的极性基氨基酸四类４．也可将氨基酸分为非极性脂肪族基氨基酸、非极性芳香族基氨基酸、不带电荷的极性基氨基酸、带正电荷的极性基氨基酸、带负电荷的极性基氨基酸五类。氨基酸的三字符号要记清楚酸性氨基酸、碱性氨基酸、可以磷酸化的氨基酸、不能形成α螺旋的氨基酸，常位于催化中心的氨基酸等。考点２：等电点及其应１．等电点的与带电荷性质的判断，ｐＨ高于等电点，带负电荷，反之带正电荷２．含多个可解离基团的分子等等电点的判断３．等电点的应用：蛋白质、氨基酸的离子交换层析、电泳，等电点沉淀等等９考点３：蛋白质的分类与功（一）蛋白质的化学组成和分蛋白质的元素组成：Ｃ、Ｈ、Ｏ、Ｎ、Ｓ，其中含Ｎ平均为１６％，这一数据可用于蛋白质的含量测定（凯氏定氮法）。１．简单蛋完全由氨基酸组成，不含非蛋白成分根据溶解性的不同，可分为：清蛋白、球蛋白、谷蛋白（溶于稀酸或稀碱）、醇溶蛋白（溶于７０％－８０％的乙醇）、组蛋白（溶于水或稀酸，可用稀氨水沉淀）、精蛋白（溶于水或稀酸，不溶于氨水）和硬蛋白（只能溶于强酸）。２．结合蛋由蛋白质和非蛋白成分组成，后者称为辅基。根据辅基的不同，可将结合蛋白分为以下７类：核蛋白、脂蛋白、糖蛋白、磷蛋白、血红素蛋白、黄素蛋白和金属蛋白。考点４：蛋白质的化学组成与分３．按蛋白质的生物学功能分（１）催化功能；（２）结构功能；（３）运输功能；（４）贮存功能；（５）运动功（６）防御功能；（７）调节功能；（８）感觉功能；（９）遗传调控功遗传信息的储存和表达都与蛋白质有关。ＤＮＡ在在染色体中是缠绕在蛋白质（组蛋白）上的。有些蛋白质，如阻遏蛋白，与特定基因的表达有关。β－半乳糖苷酶基因的表达受到一种阻遏蛋白的抑制，当需要合成β半乳糖苷酶时经过去阻遏作用才能表达。（１０）其他功某些生物能合成有毒的蛋白质，用以攻击或自卫。如蛇毒、蜂毒等。考点５：蛋白质一级结构的测定（一）蛋白质测序的策略（片段重叠法１．确定蛋白质的纯度在以上２．测定多肽链的数目３．拆分多肽链４．分析每一条多肽链的氨基酸组成５．鉴定多肽链的Ｎ末端和Ｃ末端氨基酸残基６．用两种以上方法裂解多肽链成较小的肽段７．测定各肽段的氨基酸序列。８．拼接各肽段成完整的多肽链。９．确定二硫键的位置。（二）末端

末端

基酸残基的鉴１．末端的测（１）二硝基氟苯（ＤＮＦＢ）法（Ｓａｎｇｅｒ法）：２，４－二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链Ｎ–端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物 （ＤＮＰ）。（２）丹磺酰氯法：在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰氨基酸。（３）异硫酸苯酯（ＰＩＴＣ）法：Ｎ末端氨基酸生成相应的ＰＴＨ（苯乙内酰硫脲）!ＡＡ，并脱离肽链，可连续测定末端氨基酸，广泛应用于肽链的的氨基酸序列测定。（４）氨肽酶法２．末端的测（１）还原法。末端氨基酸可用硼氢化锂还原生成相应的α氨基醇。肽链水解后，再用层析法鉴定（２）肼解法。多肽与肼在无水条件下加热，可以断裂所有的肽键，除Ｃ末端氨基酸外，其他氨基酸都转变为相应的酰肼化合物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与Ｃ－端氨基酸分离，Ｃ末端氨基酸可用纸层析鉴定。但精氨酸会变成鸟氨酸，半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺被破坏。（３）羧肽酶法（三）二硫桥的断过甲酸氧化法，巯基还原（四）多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯１．酶法裂解（酶的作用位点）碱性氨基酸的羧基参与的肽键芳香族氨基酸的羧基参与的肽键疏水性氨基酸的羧基参与的肽两端均为疏水性氨基酸，酸性条胰蛋白酶ｔｒｙｐｓｉｎ水解产物：以赖氨酸精氨酸的羧基为末端的糜蛋白酶ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ水解产物，疏水性芳香族氨基酸羧基为末端的２．化学法裂解：甲硫氨酸羧基参与形成的肽键，溴化裂解羟胺断裂法：断裂ＡｓｎＧｌｙ之间的肽键，但专一性不强，也可以断裂Ａｓｎｅｕ和Ａｓｎｌａ之间的键．（五）氨基酸组成的分—般用酸水解，得到氨基酸混合物，再分离测定氨基酸。目前用氨基酸自动分析仪，２小时即可完成。酸水解中，色氨酸破坏，丝氨酸苏氨酸酪氨酸部分破坏，天冬酰胺和谷氨酰胺中的酰胺基被水解。碱水解很多氨基酸破坏，但色氨酸保存。２．末端降解法：可用氨肽酶和羧肽酶，只能测出末端的几个氨基酸。羧肽酶Ｙ可作用于任何氨基酸，有可能以此为基础开发出新的氨基酸的顺序测定仪。３．根据核苷酸序列推定法：分离ｍＲＮＡ，经反转录测定ｃＤＮＡ的核苷酸序列，再用遗传密码推定氨基酸序列。４．质谱法：可分析微量的肽链，短肽在第一台质谱仪中经电喷射电离，按荷质比分离，依次在经碰撞池被裂解成离子碎片，在第二台质谱仪中测出各个离子碎片的谱线，推算出短肽的氨基酸序列。在蛋白质组学中应用广泛，但不能区分亮氨酸和异亮氨酸。（六）二硫桥位置的确用对角线电泳法：电泳，过甲酸熏蒸断裂二硫键，二向电考点６：蛋白质的氨基酸序列与生物功能的关（二）蛋白质氨基酸序列的局部断裂可以产生相应的生物活性如血液凝固过程一级结构变化引起生物功能的变化２．蛋白质的一级结构决定了蛋白质的空间结构与蛋白质的生物学功能。实验证据：蛋白质的变性复性实验。（镰刀形贫血症等）蛋白质折叠的动力折叠不是随机搜索的过程。（ｌｅｖｉｔｈａｌ难题？折叠时二硫键异构酶和肽基脯氨酸异构酶起重要作用分子伴侣在折叠时有重要作用，主要是防止肽链的错误折叠。分子伴侣 （ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ）—类在序列上没有相关性但有共同功能的蛋白质，它们在细胞内帮助其他含多肽的结构完成确的组装，而且在组装完毕后与之分离，不构成这些蛋白质结构执行功能时的组份”。热休克蛋白就是一大类分子伴侣。考点７：维持蛋白质的空间结构的作用（二）稳定蛋白质三维结构的作用氢键 （方向性、饱和性）、）范德华力（定向效应、诱导效应、分散效应）疏水作用 （熵效应）、盐键、二硫键。三级结构是指多肽链主链和侧链原子的空间排布。次级键维持其稳定，最主要的键是疏水键。四级结构是指两条以上具有三级结构的多肽链之间缔合在一起的结构。其中每条具有三级结的多肽链称为亚基，一般具有四级结构的蛋白质才有生物学活性。维持其稳定的是次级键，如氢键、盐键、疏水键、范德华力等。考点８：蛋白质空间结构相关的定义１．二级结构：多肽链折叠的规则方式２．α螺旋α螺旋的结多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构，螺旋一周，沿轴上升的距离即螺距０．５４ｍ含３．６个氨基酸残基；两个氨基酸之间的距离为０．１５ｍ肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行，每一个氨基酸残基的酰胺基团的基与其后第四个氨基酸残基酰胺基团的基形成氢键。蛋白质分子为右手ａ螺旋（．影响α螺旋形成的因素：Ｒ基太小使键角自由度过大，带同种电荷的Ｒ基相互靠近，β碳原子上有分支均不利于形成α螺旋，含脯氨酸的肽段不能形成α螺旋。）β折叠折叠是由两条或多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通过链间的氢键交联而形成的。肽链的主链呈锯齿桩折叠构象。两个氨基酸之间的轴心距为０．３５ｍｂ－折叠结构可以由两条肽链之间形成，也可以在同一肽链的不同部分之间形成。几乎所有肽键都参与链内氢键的交联，氢键与链的长轴接近垂直。β转角和β凸转角由四个氨基酸残基组成，弯曲处的第一个氨基酸残基的－Ｃ＝Ｏ和第四个残基的!Ｎ－Ｈ之间形成氢键，形成一个不很稳定的环状结构。多位于分子表面，促进肽链回折。β凸起可以认为是β折叠中额外插入一个氨基酸残基，使得两个正常氢键之间一侧是两个氨基酸残基，一侧是一个氨基酸残基。如图：无规则卷１．超二级结构：ｓｕｐｅｒ－ｓｅｃｏｎｄａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅ：蛋白质二级结构和三级结构之间的一个过渡性结构层次，在肽链折叠过程中，因一些二级结构的构象单元彼此相互作用组合而成。典型的超二级结构有罗斯曼折叠模式βαβ、４股α螺旋形成的四螺旋束等。２．结构域结构域是生物大分子中具有特异结构和独立功能的区域，在二级结构、超二级结构基础上形成的三级结构局部折叠区，相对独立的紧密结构实体，称为结构域，往往与功能相关，也称作功能域。（但是同一种蛋白质中不同结构域间常可通过不具二级结构的短序列连接起来。蛋白质分子中不同的结构域常由基因的不同外显子所编码）１．有关四级结构的一些概念：蛋白质的层次结构中的第四个层次，．特指组成蛋白质的各个亚基通过非共价键相互作用（包括疏水相互作用、氢键和盐键等）排列组装而成的立体结构。２．在蛋白质四级结构中，每个各具独立三级结构的多肽链称为亚基３．四级缔合的驱动力：主要有范氏作用力，氢键，离子键和疏水作用力，其中疏水作用力最为重要，二硫键对于稳定四级结构有重要意义。４．四级缔合在结构和功能上的优越性增强结构稳定性；提高遗传的经济性和效率；构成功能部位是催化部位聚集；为别构效应提供结构基础．（大分子优越性）考点９：肌红蛋白与血红蛋血红蛋白的结构与功１．血红蛋白的结构：四亚２．功能：运输氧及３．氧结合引起的血红蛋白构象变４．血红蛋白的协同性氧结 （Ｈｂ氧结合曲线５．、ＣＯ２和对血红蛋白结合氧的影 Ｈ＋、ＣＯ促进Ｏ的释 （Ｂｏｈｒ效应 ＢＰＧ（２，３二磷酸甘油酸）降低血红蛋白对氧的亲和（在糖无氧酵解通路中，１，３二磷酸甘油酸（１，３）有１５～在二磷酸甘油酸变位酶催化下生成２，３，后者再经２，３磷酸酶催化生成３磷酸甘油酸。经此２，３的侧支循环称２，３支路。红细胞中２，３磷酸酶活性远低于ＢＰＧ变位酶，使２，３－的生成大于分解，因而红细胞中２，３的浓度处于有机磷酸酯的巅峰，较糖酵解其它中间产物的有机磷酸酯高出数甚至数百倍。）６．胎儿红细胞中血红蛋白由于其亚基组成不一样，其血红蛋白对氧的亲和力高于成 （>考点１０：蛋白质的分离纯化和表（一）蛋白质的酸碱性各个解离基团的ｐ值与游离氨基酸的不完全相同。短肽的等电点和净电荷量可以根据ｐ值计算，蛋白质的等电点要用等电聚焦等方法测定。（二）蛋白质分子的大小与形１．根据化学组成测定最低相对分子质２．渗透压法测定相对分子质３．沉降分析法测定相对分子质量（沉降系数ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，ｓ）颗粒在单位离心力场中移动的速度。（三）蛋白质的分离纯化方１．根据分子大小不同的纯化方（１）透析：透析是把待纯化的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里，放入透析液 （蒸馏水或缓冲液）中进行的，透析液可以更换，直至透析袋内无机盐等小分子物质降到最小值为止。（２）超滤：利用压力或离心力，强行使水和其他小分子溶质通过半透膜，而蛋白质被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐的目的。（３）．密度梯度离心（４）凝胶过２．利用溶解度差别的纯化方（）等电点沉淀和ｐＨ控利用蛋白质在等电点时溶解度最低以及不同的蛋白质具有不同等电点一这特性，对蛋白质进行分离纯化的方法称为等电点沉淀法。在等电点时，蛋白质分子的净电荷为零，消除了分子间的静电斥力，但由于水膜的存在，蛋白质仍有一定的溶解度而沉淀不完全，所以等电沉淀法经常与盐析法或有机溶剂沉淀法联合使用。单独使用等电点法主要是用于去除等电点相距较大的杂蛋白。在加酸或加碱调节ｐ的过程中，要一边搅拌一边慢慢加入，以防止局部过酸或过碱。（２）蛋白质的盐溶和盐定义：一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶；而当盐浓度升高到一定程度后，蛋白质的溶解度又随着盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析作用。在同一浓度的盐溶液中，不同蛋白质的溶解度不同，借此可达到彼此分离的目的。原理：盐浓度增高到一定数值后，水活性降低，水化膜相继被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚积并从溶液中析出。蛋白质的盐析通常采用中性盐，如硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠、磷酸钠等，其中应用最广的是硫酸铵。（３）ｐＨ和温度对蛋白质溶解度的影ｐ的影大多数蛋白质在等点电时，在盐溶液中的溶解度最低。所以盐析时溶液ｐＨ值调到等电点效果最好。（４）有机溶剂分级分离作用机理：降低水溶液的介电常数，使溶质溶解度降低；破坏大分子周围水膜，使溶解度降低。３．根据电荷不同的纯化方（１）电泳，（聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ，等电聚焦，双向电泳，毛细管电泳）以ＰＡＧ为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体 （ｃａｒｒｉｅｒａｍｐｈｏｌｙｔｅｓ），在电场作用下，两性电解质载体在凝胶中移动，形成ｐＨ梯度，蛋白质在凝胶中迁移至其ｐＩ的ｐＨ处，即不再泳动而聚焦成带，这种方法称聚丙烯酰胺等电聚焦电泳 （ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃｆｏｃｕｓｉｎｇ－ＰＡＧＥ，简释ＩＥＦ－ＰＡＧＥ）。双向电泳：双向ＰＡＧＥ电泳是由两种类型的ＰＡＧＥ组合而成。样品经第一向电泳分离后，再以垂直它的方向进行第二向电泳。一般以第一向为ＩＥＦ－ＰＡＧＥ，第二向为ＳＤＳ－ＰＡＧＥ的双向分离技术，简称（２）离子交换层４．利用选择性吸附的纯化方（１）羟基磷灰石层析：羟基磷灰石［Ｃａ５（ＰＯ４）３ＯＨ２（简称Ａ）］：ＨＡ的Ｃａ２＋基团和生物分子表面的负电荷基团的相互反应，在用ＨＡ分离生物分子过程中起着重要作用。而ＨＡ的ＰＯ４３－基团与生物分子表面的阳电荷基团的相互反应，则仅起着次要的作用。（２）疏水作用层以苯基琼脂糖或辛基琼脂糖为固体支持物，与蛋白质表面的疏水区相互作用，用降低离子强度或增加置换剂的方法洗脱。常用的置换剂有非离子型去污剂、脂肪醇、脂肪胺等。疏水作用层析容易引起蛋白质变性，在蛋白质分离中使用不广。５．利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方亲和层析是利用生物分子间所具有的专一而又可逆的亲和力而使生物分子分离纯化的层析技术。具有专一而又可逆的亲和力的生物分子是成对互配的。主要的有：酶和底物、酶与竞争性抑制剂、酶和辅酶、抗原与抗体、和ＲＮＡ、激素和其受体、与结合蛋白等。在成对互配的生物分子中，可把任何一方作为固定相，而对样品溶液中的另一方分子进行亲层析，达到分离纯化目的。例如，酶与其辅酶是成对互配的，既可把辅酶作为固定相，使样品中酶分离纯化，也可把酶作为固定相，使样品中的辅酶分离纯化第四 知识要点１．酶作为生物催化剂的特性，酶的相关定义如：酶蛋白和辅因子的概念２．熟悉酶的分类；掌握酶活力、活力单位、比活力及转换数的概念，熟悉其测定方法３．熟悉米氏方程相关的计算，可以正确判断有抑制剂存在时米氏方程的变化；掌握米氏常数的意义和测定方法，具备利用米氏方程解决有关计算问题的能力。７．掌握酶作用的专一性、酶的活性中心的概念及其酶蛋白结构与功能的关系。４．掌握酶催化作用的机制和影响酶催化效率的有关因素５．掌握别构调节、共价调节、酶原的激活等酶活性调节机制，并能举例说明６．掌握多酶体系、寡聚酶、同工酶、固定化酶、诱导酶、核酶和抗体酶的概念。考点１：酶催化作用的特点酶作为生物催化剂的特１．易失２．具有很高的催化效３．具有很高的专一４．酶的活性受到调节控（１）调节酶的浓（２）通过（激素）调节酶的活性反馈抑制调节酶的活性抑制剂和激活剂调节酶的活性别构调节考点２：酶的化学本质及其组（一）酶的化学本质：大多数酶是蛋白（二）酶的化学组辅基，ｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃｇｒｏｕｐ结合紧密辅酶，ｃｏ－ｅｎｚｙｍｅ 结合松弛单体 （ｍｏｎｏｍｅｒｉｃｅｎｙｍｅ）：仅有一条具有活性部位的多肽链，全部参与水解反应寡聚酶（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃｅｎｙｍｅ）：由几个或多个亚基组成，亚基牢固地联在一起，单个亚基没有催化活性。亚基之间以非共价键结合。多酶复合物（ｍｕｌｔｉｅｎｚｙｍｅｙｔｍ：几个酶镶嵌而成的复合物。这些酶催化将底物转化为产物的一系列顺序反应。多酶复合物（ｍｕｌｔｉｅｎｚｙｍｅｙｔｍ多酶体系几个功能相关的酶嵌合在一起，共同完成一个特定的代谢过程，其中一种酶的产物往往是另种酶的底物，从而有利于特定的连续的催化反应的进行考点３：酶的分１． 氧化还原酶２． 转移酶３． 水解酶４． 裂合酶５． 异构酶６．ｌｉｇａｓｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ 连接酶类考点４：酶的活力测定和分离纯化（一）酶活力的测１．酶活力：酶活力指酶催化某一反应的能力２．酶的活力单位：酶活力的大小是以酶单位数表示的。所谓酶单位是在某一特定条件下，使酶反应达到某一速度所需要的酶量，而速度即指单位时间（秒、分、小时）内反应物的变化量（毫克、微克、微摩尔等）。酶单位一般有三种表示方法。惯用单位；国际单位（ＩＵ）规定一个国际单位（ＩＵ）为在实验规定的条件下（如温度为２５℃、最适ｐＨ、最适底物浓度时），每分钟催化一个微摩尔底物变化所需要的酶量。酶的浓度可以ＩＵ／Ｌ或ＩＵ／ｍＬ来表示；）ｋａｔａｌ单位（１９７２年酶学委员会又提出一种新的酶单位ｋａｔａｌ（简称ｋａｔ），１ｋａｔ＝６０ＩＵ）３．酶的比活 比活 ＝活力／ｍｇ蛋白 比活力越大，酶的纯度越高４．酶活力的测定方酶活力测定就是在一定时间内产物生成量或底物减少量酶的分离纯化过程中每一个步骤多要测定酶的活力和比活力，计算纯化倍数和回收率。好的纯化方法应当有较大的纯化倍数和较高的回收率。纯化倍数 ＝每次比活力／第一次比活力回收率 ＝每次总活力／第一次总活力考点５：核酶、抗体酶、同工核酶（ｉｏｅ是具有催化功能的ＲＮＡ分子，是生物催化剂，可降解特异的ｍＲＮＡ序列。核酶又称核酸类酶、酶ＲＮＡ、核酶类酶ＲＮＡ。它的发现打破了酶是蛋白质的传统观念。抗体酶ａｂｙｍｅ：通过改变抗体中与抗原结合的微环境，并在适当的部位引入相应的催化基团，所产生的具有催化活性的抗体。可由两种途径获得抗体酶：①采用过渡态的底物类似物诱导；②在现有的抗体基础上，通过化学修饰或通过蛋白质工程向其配体结合部位导入催化基团。抗体酶在医学领域有很好的应用前景，也可以说明过渡态互补理论的正确性能催化相同的化学反应，但在蛋白质分子的结构、理化性质和免疫性能等方面都存在明显差异的一组酶。如乳酸脱氢酶考点６：酶的反应动力学与米氏方（一）底物浓度对酶反应速率的影１．米氏方ＫＶ＝Ｖｍａｘ［Ｋｍ ＋［ｍ２．动力学参数的意（１）Ｋｍ的意Ａ．Ｋｍ值等于反应速度达最大反应速度一半时的底物浓度，单位是浓度单位，是酶的特征常数，酶对一定的底物只有一个特定的ｍＶ／２＝Ｖ［Ｓ］／（Ｋｍ＋［Ｓ］ Ｋｍ＝［Ｂ．Ｋｍ越小酶对底物的亲和力越大，Ｋｍ最小的底物为最适底物Ｃ．Ｋｍ可用于判断反应的方向及代谢途径的限速步骤（２）Ｖｍａｘ和ｋ３（Ｋｃａｔ）的意在一定的酶浓度下，Ｖｍａｘ为常数底物浓度很大时，Ｖｍａｘ与酶浓度成正比（３）ＫｃａｔＫｍ的意由于Ｋｃａｔ＝ｋ３；ＫｃａｔＫｍ＝ｋ３ｋ（ｋ２ｋ３）当ｋ２→０时，Ｋｃａｔｍ＝ｋ１即ＫｃａｔＫｍ表示ｋ２→０时的ｋ１，即ｋ１的最大值３．利用作图法测定Ｋｍ和Ｖｍａｘ（双倒数作图法 Ｖｍａｘ［ （１）竞争性抑制作（２）非竞争性抑制作用：底物和抑制剂同时与酶结合，但形成的不能进一步转变为产物（３）反竞争性抑制作用：抑制剂必须在酶与底物结合后才能进一步形成复合物（４）不同类型抑制作用的米氏方考点７：酶的作用机（一）酶作用机制的假说酶与反应的过渡态互补酶与底物的过渡态互补，亲合力最强，释放出结合能使ＥＳ的过渡态能级降低，有利于底物分子跨越能垒，加速酶促反应速度。证据：抗体酶的制抗体酶：即是抗体又