中和试验及应用

中和试验机体受到病毒感染后体内产生特异性中和抗体并与相应的病毒粒子呈现特异性结合因而阻止病毒对敏感细胞的吸附或抑制其侵入使病毒失去感染能力。中和试验Test)是以测定病毒的感染力为基础，以比较病毒受免疫血清中和后的残存感染力为依据，来判定免疫血清中和病毒的能力。中和试常用的有两方法：种是固定病量与等系列倍比稀的血清混合另一种是固血清用与等量系列数稀释(即十倍次稀)的病毒混合然后把血清－病毒混合物置适当的条件下感作一定时间后种于敏感细胞鸡胚或动物测定血清阻止病毒感染宿主的能力及其效价如果接种血清病毒混合物的宿主与对照(指仅接种病毒的宿主一样地出现病变或死亡明血清中没有相应的中和抗体中和反应不仅能定性而且能定量故中和试验可应用于1.病毒株的种型鉴定中和试验具有较高的特异性利用同一病毒的不同型的毒株或不同型标准血清即可测知相应血清或病毒的型所以中和试验不但可以定属而且可以定型。2.测定血清抗体效价中和抗体出现于病毒感染的较早期在体内的维持时间较长。动物体内中和抗体水平的高低，可显示动物抵抗病毒的能力。3.分析病毒的抗原性。毒素和抗毒素亦可进行中和试验，其方法与病毒中和试验基本相同。用组织细胞进行中和试验有常量法和量法种因微量法简便结果易于判定，适于作大批量试验，所以近来得到了广泛的应用。()定血清稀释病法(病毒中和试验)1.病毒毒价的测定毒价单位量病毒毒价(毒力)的单位过去多用最小致死量(MLD)，即经规定的途径，以不同的剂量接种试验动物，在一定时间内能致全组试验动物死亡的最小剂量。但由于剂量的递增与死亡率递增不呈线性关系，在越接近100％死亡时对剂量的递增越不敏感而一般在死亡率越接近0％时，对剂量的变化越敏感，故现多改用半数致死(LD)作为毒价测定单位，即经规50定的途径以不同的剂量接种试验动物在一定时间内能致半数试验动物死亡的剂量。用鸡胚测定时，毒价单位为鸡胚半数致死量(ELD)或鸡胚半数感染量50(EID)。用细胞培养测定时，用组织细胞半数感染(TCID)。在测定疫苗的免5050疫性能时，则用半数免疫量(IMD)或半数保护量(PD)。5050(1)LD的测定(以流行性乙型脑炎病毒为例)。50测定方法：将接种病毒，并已发病濒死的小鼠，无菌法取脑组织，称重、加稀释液充分研磨，配制成10

-1

悬液，3000r/min心20分钟，取上清液，以倍递次稀释成10

-1

、10

-2

、

-3

……10

-9

，每个稀释度分别接种5只鼠，每只脑内注射0.03ml逐日观察记录各组的死亡数。

表2LD的计算（接种剂量0.03ml）50病毒稀释度

接种鼠数

活鼠数

死鼠数

积累总计活鼠死亡

死亡比

死亡率(%)10-410-510-610-710-810-9

555555

001455

554100

00151015

15105100

15/1510/105/61/60/100/15

100100831700LD的计算：50（1）按Reed和氏法计算。高于50%的死亡分数-50%83%-50%距离比例=────────────────────=──────=0.5高于50%的死亡百分数-低于50%的死亡百分数83%－17%LD的对数=高于50%病毒稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数50本例高于50%病毒稀释度的对数－离比例为.5系数的对数为－1。代入上式：LgLD=-6+0.5×(－1)=－6.5则LD=1050生死亡。

-6.5

，，即该病毒作10

-6.5

稀释，接种0.03ml能使半数小鼠发注意：稀释血清法中和试验，计TCID或LDMID时，计算公式应改为：505050TCID的对数=高于50%血清稀释度的对数－距离比例×稀释系数的对数。50（2）按Karber氏法计算，其公式为：IgLD（或TCID）=L+d(S－0.5)5050L为病毒最低稀释度的对数，d组距，即稀释系数，S为死亡比值的和。本例L=－4，d=－1，S=1+1+5/6+1/6=3IgLD=－4+(－1)×(3－0.5)=－6.550则LD=1050

-6.5

，0.03ml注意：用本法计算稀释血清中和试验中和效价时，应为保护比值之和。(2)EID的测定（以新城疫病毒为例）将新鲜病毒液体0倍递次稀释法释50成10-110-2、10-3……10-9不同稀释度，分别接9-10日龄鸡胚尿囊腔，鸡胚必须来自健康母鸡，并且没有新城疫抗体。每只鸡胚接0.2ml，每个稀释度接

种6只鸡胚为一组，以石蜡封口，置37-38℃培养，每天照蛋，24h之内死亡的鸡胚弃掉，24h之后死亡的鸡胚置℃保存。连续培5天，取尿囊液作血球凝集试验，出现血凝者判阳性，记录结果，按上述方法计算EID。50(3)TCID的测定（以致细胞病变病毒为例）取新鲜病毒悬液，以10倍递50次稀释成不同稀释度，每个稀释度分别接种Hank洗3次的组织细胞管，每管细胞接种0.2ml每个稀释度接种4只细胞管接种病毒后的细胞管放在细胞盘内，细胞层一侧在下，使病毒与细胞充分接触，放置7℃吸附1h，加入维持液，置37℃培养，逐日观察并记录细胞病毒管数，按上述方法计算。502.中和试验(1)病毒稀释度的选择选择病毒稀释度范围，要根据毒价测定的结果而定如病毒的毒价为10

-6

则试验组选用10

-2

－10

-8

对照组选用10

-4

－10

-8

其原则是：最高稀释度要求动物全存活（或无细胞病变最低稀释度动物全死亡（或均出现细胞病变(2)血清处理用于试验的所有血清在用前须56℃30min加温灭活。但来自不同动物的血清，灭活的温度和时间也是不同的。(3)病毒的稀释按选定的病毒稀释度范围，将病毒液10倍递次稀释，使之成为所需要的稀释度。(4感作将不同稀释度病毒分别定量加入两排无菌试管内第一排每管加入与病毒等量的免疫（或被检）血清作为试验组；第二排每管加入与免疫（或被检）血清同种的正常阴性血清作为对照组；充分摇匀后放7℃感作12h。(5)接种按“病毒价测定”中所述接种方法接种试验动物（或鸡胚、组织细胞观察持续时间，根据病毒和接种途径而定。(6)中和指数据计算物按Reed和Muench两氏法（Karber）法分别计算试验组和对照组的LD（或EID、TCID）505050试验级LD(EID、TCID)505050中和指数=──────────────────对照组LD

50

(EID、TCID)5050假如试验组LD为10-2.2对照LD为10-5.6则中和指数为05050也就是说该待检血清中和病毒的能力比正常血清大995倍。

3.3

10

3.3

=1995，(7)结果判定固定血清―稀释病毒法进行中和试验，当中和指数大50，表示补检血清中有中和抗体；中和指数10-50可疑；若中和指数小于10为无中和抗体存在。()固定病释血清法血清中和试验）1.病毒毒价的测定（微量法）(1)病毒的制备将病毒接种于单层细胞，℃吸附h后加入维持液，置温箱培养；逐日观察，待细胞病变CPE）75%以上，收获病毒悬液冻融或超声波处理，以3000r/min心10min，取上清液，定量分装成1ml小瓶置-70℃保存备用，选用的病毒必须是对细胞有较稳定的致病力。(2)病毒毒价测定

取置-70℃冰箱保存的病毒一瓶，将病毒96培养板

上作10递进稀释10，-2，-11……，每孔病毒悬液量50l，每个稀释度作8孔，每孔加入1胞悬液，每块板的最后一行设8孔细胞对照，制备细胞悬液的浓度以使细胞在24h长满单层为度。把培养板置5%CO2温箱7℃培养，从48-14h逐日观察细胞病变，记录结果。按Reed和Muench两氏法计算TCID。5056%-50%距离比例=────────56%-33%本例高于50%病毒稀释度的对数为－6离比例为释系数的对数为－。表2-25TCID计算接种剂量0μl）50病毒稀释度

接种数

CPE

无CPE数

累CPE

计无CPE

率

百分数(%)10

-2

8

8

0

39

0

39/39

10010

-3

8

8

0

31

0

31/31

10010

-4

8

7

1

23

1

23/24

9610

-5

8

5

3

15

4

15/19

7910

-6

8

4

4

10

8

10/18

5610

-7

8

4

4

6

12

6/18

3310

-8

8

2

6

2

18

2/20

1010

-9

8

0

8

0

26

0/26

0IgTCID

50

=－6＋0.26×(－1)=－6.3则TCID=1050管发生病变。

-6.3

，50即病毒作0

-6.3

稀释，每孔接种50μl，可使半数组织细胞2.中和试验(1)血清的处理动物血清中有多种蛋白质成分对抗体中和病毒有辅助作用如补体免疫球蛋白和抗补体抗体等为排除这些不耐热的非特异性反应因素用于中和试验的血清须经加热灭活处理各种不同来源的血清须采用不同温度处理，猪、牛、猴、猫及小鼠血清为0℃；水牛、狗及地鼠血清为62℃；马兔血清为65℃和豚鼠血清为56℃加热时间为20-30min60℃以上加热时，为防止蛋白质凝固，应先以生理盐水作适当稀释。(2)稀释血清取已灭活处理的血清在96孔微量细胞培养板上用稀释液作一系列倍比稀释，使其稀释度分别为原血清1:2、1:41:81:161:32、1:64，每孔含量为50μl，每个稀释度作4孔。

(3)病毒取70℃冰箱保存的病毒液，按经测定的毒价作稀释50（与等量血清混合，其毒价100TCID本例病毒价10-6.350μl。所以应50将病毒作2×10-4.3稀释。(4)感作

每孔加入50μl病毒液，封好盖，置于37℃温箱中和h。病毒与血清混合0℃下，不发生中和反应4℃以上中和反应即可发生。常规采用37℃作用1h一般病毒都可发生充分的中和反应但对易于灭活的病毒可置4℃冰箱感作，根据不同耐热性的病毒感作温度和时间应有所不同。(5)加入细胞悬液在制备细胞悬液时，其浓度以在24h内长满单层为度：血清病毒中和1h取出，每孔加入100μl细胞悬液。置%CO37℃温箱培养，2自培养48h开始逐日观察记录，14h终判。由于各种病毒引起细胞病变时间不同判时间应根据病毒致细胞病变的快慢而定。(6)设立对照为保证试验结果的准确性，每次试验都必须设置下列对照，特别是在初次进行该种病毒的中和试验时尤为重要阳性和阴性血清对照阳性和阴性血清与待检血清进行平行试验阳性血清对照应不出现细胞病变而阴性血清对照应出现细胞病变。病毒回归试验每次试验每一块板上都设立病毒对照相将病毒作0.1、10、100、1000TCID释，每个稀释度作孔，每孔50μl。然后每孔100l50细胞悬液。0.1TCIDTCID应不引起细胞病变，而且100TCID必须引起细5050胞病变，否则该试验不能成立。血清毒性对照相为检查被检血清本身对细胞有无任何毒性作用设立被检血清毒性对照是必要的即在组织细胞中加入低倍稀释的待检血（相当于中和试验中被检血清的最低稀释度正常细胞对照相即不接种病毒和待检血清的细胞悬液孔正常细胞对照应在整个中和试验中一直保持良好的形态和生活特征避免培养板本身引起试验误差，应在每块板上都设立这一对照。(7)结果判定和计算当病毒回归试验，阳性、阴性、正常细胞对照相，血清毒性对照全部成立时才能进行判定被检血清孔出现100%CPE判为阴性50%以上细胞出现保护者为阳性固定病毒稀释血清中和试验的结果计算是计算出能保护50%胞孔不产生细胞病变的血清稀释度，该稀释度即为该份血清的中和抗体效价。用Reed和Muench两氏法（或Karber法）计算结果，如表2-2680%－50%距离比例＝──────＝80%－20%对数

IgTCID=高于50血清稀释度的对数－距离比例×稀释系数的50IgTCID＝－1.5－0.5×（－0.3）＝－1.3550

表-26固病毒稀血法和体价算CPE数

积累血清稀释

CPE数

无CPE数

CPE比率

百分数总孔数

CPE

无CPE1:4(10

)0/4

040

120/1201:8(10)0/404080/801:16(10)

1/413141/5201:32(10

)3/431414/5801:64(10)

4/440808/8100则TCID＝1050

-1.36

，50μl因10

-1.35

=1/22，即1:22的血清可保护0％细胞不产生病变，就是该份血清的中和抗体效价。影响中和试验的因素：(1)病毒毒价的准确性是中和试验成败的关键，毒价过高易出现假阴性能，过低会出现假阳性。在微量血清中和试验中，一般使用00-500TCID。50(2)用于试验的阳性血清规戒律，必须是用标准病毒接种易感动物制备的。(3)细胞量度的多少与试验有密切关系胞量过大或过小易造成判断上的错误，一般以在24h，内形成单层为宜。(4)毒价测定的判定时间应与正式试验的判定时间相符。中和试检测应用病毒或毒素与相应的抗体结合后去对易感动物的致病力之中和试验。本试验主要用于）从待血清中检出抗体，或从病料中检出病毒，从而诊断病毒性传染病毒素血清检查材料中的毒素或鉴定细菌的毒素类型测定抗病毒血清或抗毒素效价新分离病毒的鉴定和分型中和试验不仅可在易感的实验动物体内进行亦可在细胞培养上或鸡胚上进行试验方法主要有简单定性试验、固定血清稀释病毒法、固定病毒稀释血清法、空斑减少法等。

1、血清中和实验鉴定新城疫血清中和实验既可用已知抗鸡新城疫病毒的血清来鉴定可疑病毒可用已知的新城疫病毒来测定鸡血清中是否含有特异性抗体确定鸡群是否感染过新城疫中和实验可以在鸡胚或细胞培养以及易感鸡中进行方法是在鸡新城疫免疫血清（或待检血清）中，加入一定量的待检病毒（或已知病毒两者混合均匀后，接10～11日龄的SPF鸡胚，或鸡胚成纤维细胞，或有易感性的鸡，并设立不加血清的病毒对照结果注射血清和病毒混合材料的鸡胚或鸡不死亡鸡胚成纤维细胞无病变对照组死亡或细胞培养出现病变肯定为新城疫病毒。2、血清中和实验诊断猪瘟将不同稀释度的血清与已知浓度的稀释病毒混合接种细胞培养物进行培养，18-24h后进行荧光抗体检查；或与猪瘟兔化弱毒疫苗HCLV）中和，接种到兔中观察兔体温反应以此确定血清的终点滴度在西欧最常用的方法是过氧化物酶中和实验（NPLA在一些北美洲和拉丁美洲国家则多使用免疫过氧化物酶单层实验（1PMA）方法。3、血清中和实验检测猪繁殖与呼吸综合征一般来说，在群体水平上血清学诊断易操作，特异性强，敏感性高。但对个体的检测则比较困难有时出现非特异性反应但可以在～3周后取样复测解决此问题。血清学检测一般用吸附实验（如IPMA、IF、ELISA些实验常用某种抗原型的病毒进行对其他抗原异型病毒抗体的灵敏度较低应用抗体结合试验，在病猪感染了7～14天检出抗病毒抗体，50天抗体滴度出现高峰。有些在病猪感染后3～6个月内血清转为阴性有些病猪血清阳性维持较久中和抗体在病猪感染后出现较慢，但滴度不高。可在感染3-4周检测到中和抗体，这种抗体能维持年或更长时间。有报道，在血清中和实验中使用补体能提高试验的灵敏度关于病猪感染后血清阳性持续时间的长短目前尚未进行广泛深入的研究因其有可能随实验方法不同而异母源抗体半衰期为12～14天一般仔猪在出生后4～8周内可检测到病毒随母猪生产时的滴度及所用试验方法而异在污染的环境中，血清学检测为阳性的母猪所产仔猪能在～6周龄时血清转为阳性。应用巨噬细胞分离病毒以及利用两类血清型病毒的在实验室容易操作，这种试验可用MARC-145细胞系增殖欧洲型病毒和美洲型病毒操作。使用MARC-145

细胞系做间接免疫荧光实验（1FA）能顺利进行血清学反应。目前，灵敏度高