微生物的分离与纯化技术OK

实验七微生物的分离与纯化技术

土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。一般土壤中，细菌最多，放线菌及霉菌次之，而酵母菌主要见于果园及菜园土壤中。

从混杂微生物群体中获得只含某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。基本原理是选择适合于待分离微生物生长的条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧的要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。一、实验目的和内容目的：学习从土壤中分离微生物的方法，学习无菌操作技术。内容：1培养基的配制及相关物品的灭菌；2用稀释法从土壤中分离微生物；３用平板划线方法分离微生物二、实验材料和用具牛肉膏蛋白胨固体培养基、高氏1号固体培养基，土豆蔗糖固体培养基，99mL无菌水(带玻璃珠)，9mL无菌水，10%酚液，土壤样品无菌培养皿、1mL无菌移液管、天平、称量纸、药勺、试管架高压灭菌锅三、操作步骤（一）固体培养基的配制（４人一组）l．称量和溶解

2．pH调节、分装（三角瓶）、包扎。3.灭菌(二)土壤稀释分离（8人一组）1．取土壤取表层以下5—10cm处的土样，放入无菌的袋或瓶中备用，或放在4℃冰箱中暂存。2．制备稀释液(要无菌操作)(1)准备

三角瓶装99mL水（加玻璃珠），1只；试管装4.5mL无菌水，；包扎、灭菌角匙一只（2）制备土壤悬液：

无菌角匙称土样1g，迅速倒入带玻璃珠的99mL无菌水瓶中(玻璃珠用量10粒左右)，振荡5～10min，使土样充分打散，即成为10-2的土壤悬液。在每根无菌移液管的报纸套上做好标记，如10-3、10-4、10-5。无菌移液管用前从中间拆开报纸套，取出移液管，用后再插回报纸套，保护移液管尖端。每次吸取土液，要将移液管插入液面，以口吹吸3次，每次吸上的液面要高于前一次，以减少稀释中的误差。放土液操作时移液管尖不能接触下一稀释度液体的液面，每一个稀释度换用一支移液管。(3)稀释：用无菌移液管吸10-2的土壤悬液1mL，放入9mL无菌水中即为10-3稀释液，如此重复，可依次制成10-3～10-７的稀释液。3.平板接种培养

3.1稀释倾注平板法(混菌)细菌:取10-6、10-7两管稀释液各1mL，分别接入相应标号的平皿，每个稀释度接两个平皿。取冷却至50℃（以不烫手为宜）的牛肉膏蛋白胨培养基，分别倒入以上培养皿中(装量以铺满皿底为宜，约10-15ml)，迅速摇动平皿，使菌液与培养基充分混匀，但不沾湿皿的边缘，待琼脂凝固即成细菌平板。

倒平板时要注意无菌操作。放线菌取10-4、10-5两管稀释液各1mL，分别接入相应标号的平皿，每个稀释度接两个平皿。取冷却至50℃（以不烫手为宜）的高氏1号培养基（添加10%酚数滴），分别倒入以上培养皿中(装量以铺满皿底为宜，约10-15mL)，迅速摇动平皿，使菌液与培养基充分混匀，但不沾湿皿的边缘，待琼脂凝固即成放线菌平板。霉菌取10-4、10-5两管稀释液各1ML，分别接入相应标号的平皿，每个稀释度接两个平皿取冷却至50℃（以不烫手为宜）的土豆蔗糖培养基，分别倒入以上培养皿中(装量以铺满皿底为宜，约10-15mL)，迅速摇动平皿，使菌液与培养基充分混匀，但不沾湿皿的边缘，待琼脂凝固即成霉菌平板。倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用右手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约10mL，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。3.2平板划线分离法。倒平板按无菌操作要求，在火焰旁操作，倒固体培养基平板。划线分离使用接种环，挑取１０-２土壤悬液，在平板中划线分离。划线的方法多样，目的是获得单个菌落。用接种环以无菌操作挑取１０-２土壤悬液，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3～4条，再转动培养皿约70度角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同样的方法通过第二次划线部分作第三次划线。

掌握好力度，不要划破培养基。4．培养将接种好的平板倒置，即皿盖朝下放置，(可减少培养基水分蒸发、可减少污染)，培养细菌：37℃，恒温培养箱中培养1～2d。培养放线菌：28℃，恒温培养箱中培养3～5d。培养霉菌：28℃，恒温培养箱中培养3～5d。四、结果观察从土壤或培养液中稀释分离的微生物菌落[注意雷事项]1.称药播品天平谷用完欺要及问时关赴毕。2.土壤袜稀释涝分离注意宰无菌证操作（酒祸精灯孙）制备爱土壤腐悬液槽时注榜意温盐度不虽能太览高。3.倒平住板温度（50度左而右，督不烫沈手为死宜，娱温度精太低亚琼脂淹凝固碰；温绑度太风高会吼烫死爱培养爽物）装量(以铺延满皿感底为鼻宜，洽约10酷-1候5m协L)，太庭少铺慎不满锁，铺组不平势整，熔而且嘱如果央培养田时间敏长，倦则容衫易干祝裂；支太多闸浪费巡寿。平板篇表面部应平字整混菌魔法倒葛平板贫与平香板划淋线法开倒平赴板不喜同：混菌福法倒舞平板捏前先帖加1m盖l土壤矿稀释应液，读再倒坚入培贩养基但；平板输划线年法倒究平板两是先季倒入哀培养裁基制尚成平纤板，裤再挑稼菌划带线4.划线时，晓掌握拖好力虑度，狠不要刺划破拒培养湖基。5.剩余披的培才养基献不能麻倒入蒸水槽伟，以等防填故塞。6.各种么器皿辟用完及时姻清洗。7.玻璃袭珠、轿皮筋摧、报适纸等用进完回面收值日丽生负责高压活灭菌培锅灭荡菌时桑的看丈守工耐作。在斜盛面试熄管上时用记孝号笔遭标明尚待接页种的菌种瞒名称袍、接揉种者塔和日观期（eg:酵母/0泻31渣6/王06曲03届15）。双手奸用医描用酒雀精消蹄毒。点燃万酒精论灯或朵煤气额灯。将菌富种试祸管和肆待接麦种的受斜面铁试管茄，用赔大拇道指和硬食指泼、中淹指、跪无名早指握胞在左播手中够，试毒管底碍部放哀在手里掌内输并将煮中指索夹在参两试叶管之犁间，闲使斜面丹向上捞成水映平状知态，在绢火焰归边用佩右手消松动锦试管拿塞以墙利于绵接种钢时拔竞出。细菌姥斜面垃接种惨技术右手睡拿接钩种环柔通过臣火焰贤烧灼南灭菌，在登火焰岁边用输右手滥的手邻掌边绸缘和橡小指车，小最指和算无名骄指分芽别夹屑持棉帆塞(或试兄管帽)将其阻取出括，并蜜迅速述烧灼搏管口传。取聚试管摆棉塞渐或试奶管帽施时要音缓慢想拔出祖，不洋宜用心力过毙猛。将灭颠菌的企接种峡环伸膛入菌符种试止管内篮，先甘将环剪接触甲试管距内壁掏或未瘦长菌糊的培聪养基深，使抛接种斜环的吹温度睬下降针达到维冷却贱的目船的，黑然后晒再挑索取少段许菌阻苔。武将接体种环追退出唇菌种稠试管追，迅脾速伸写入待冤接种梨的斜逢面试与管，承用环贿在斜踢面上由下柴往上汤做S形划怠线。不剃要将愧培养紧基划与破，烤也不啄要使跟接种厚环接夜触壁各或管缴口。接种霜环退坟出斜葡面试扒管，斩再用蜘火焰浮烧灼剃管口姐，并上在火筒焰边顽将试雨管塞盾上。贿将谱接种偷环逐朽渐接淹近火杏焰再灭烧灼骑，如货果接捡种环慎上沾淡的菌羽体较吗多时缘瑞，应领先将必环在磁火焰师边烤裹干，籍然后旧烧灼住，以顷免未史烧死肃的菌饼种飞甚溅出膝污染渐环境丧，接队种病悼原菌解时更呜要注摸意此佣点。超净抄工作毅台工作途原理：鼓浮风机酿驱动亦空气然通过恭高效概过滤烘器得策以净却化，软净化习的空们气被碑徐徐遣吹过忘台面刻空间仪而将牙其中怕的尘展埃、披细菌戚甚至涌病毒承颗粒垦带走救，使牛工作隔区构较成无掏菌环廉境。超净励台的佩使用裙与保诵养：使用搂前最粗好开抱启超角净台遣内紫外捐灯照匀射10－30分钟，然缩慧后让演超净饰台预含工作10－15分钟条，以疼除去丢臭氧酬和使菌用工盟作台虏面空壤间呈苍净化雅状态螺；使用矛完毕厌后，域要用70瓦%酒精湿将台亭面和农台内桥四周则擦拭你干净西，以份保证概超净却台无数菌。还要吃定期哥用福步尔马勾林熏亿蒸超眉净台划线踪蝶分离俯法操与作录洪像无菌菊操作促接种画操作龟录像1、菌纠落（co彻lo魄ny）单个给微生浓物在精适宜恒的固词体培斧养基表面尘或内窜部生湿长、繁藏殖到拨一定涉程度即可以奔形成肉眼许可见阵的、有一定栏形态社结构的子积细胞德生长朝群体仙，称门为菌落。当固映体培寸养基素表面卡众多膏菌落唱连成垦一片妹时，娇便成江为菌苔(1拣aw饶n)。菌落揪的观灿察2、菌勺落特据征各种字细菌事在一喊定条陡件下害形成啄的菌涌落具顺有一跃定的稳定黄性和最专一乔性特将征，称可为菌拔落特叔征。菌落扒特征单是衡量讽菌种栽纯度米、辨贝认和不鉴定边菌种的重纱要依惠据。菌落泰特征箭描述菌落挠特征网包括大小顶，形歼状，熔隆起挖形状扔，边掀缘情峰况，微表面睁状态菌，表谁面光汁泽，档质地戚，颜摩色，氏透明赵度等。

菌落特征细菌菌落一般