实验九十酶联免疫吸附试验

实验九酶联免疫吸附试验-ELISA

实验十IgG的分离和纯化程燕2014年6月9日实验九酶联免疫吸附试

（Enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）实验目的1.掌握酶联免疫吸附试验的原理、种类和用途。

2.学习用酶联免疫吸附试验双抗体夹心法检测乙型肝炎表面抗原（HBsAg）的方法。

3.了解HBsAg阳性的意义。实验原理用酶来标记抗原或抗体的免疫分析分析技术。由于酶的高效生物催化作用，产生了放大作用，使得原来极其微乎其微的抗原或抗体在数分钟后就可被识别出来，这种技术被称为酶联免疫吸附试验法。实验原理

将已知抗体（或抗原）结合在某种固相载体上，并保持其免疫活性。测定时将待检标本和酶标抗体（或酶标抗原）按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体（或抗原）发生反应，用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离物成分，然后加入底物显色，进行定性或定量测定。

实验原理ELISA的基本原理有三条：

（1）抗原或抗体能以物理性（疏水性）地吸附于固相载体表面，并保持其免疫学活性；（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。

实验原理常用酶联免疫吸附试验有间接法竞争法双抗体夹心法ELISA-间接法此法是检测抗体最常用的方法。将已知抗原吸附于固相载体上，加入待测血清(抗体)与之结合，洗涤后，加酶标抗体和底物进行测定。其原理见图。

酶标抗体固相抗原待测抗体EEE

ELISA间接法示意图底物用于抗原及半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，将特异性抗体吸附于固相载体上，加入待测抗原和一定量的已知酶标抗原，使二者竞争地与固相抗体结合，经过洗涤分离，最后结合于固相的酶标抗原与待测抗原含量呈负相关。固相抗体EEE酶标抗原待测抗原E底物E显色反应（弱）固相抗体EEE酶标抗原底物显色反应（强）EEEEEEELISA-竞争法

ELISA-双抗体夹心法双抗体夹心法常用于检测抗原。将已知抗体吸附于固相载体，加入待测标本(含相应抗原)与之结合，温育后洗涤，加入酶标抗体及底物溶液进行测定。酶标抗体固相抗体待测抗原EEE

双抗体夹心法检测抗原实验材料1、乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒定性检测人血清或血浆中的乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg。包括：HBsAg特异性抗体（一抗）已包被于酶标板上

HBsAg阴、阳性血清各1份、酶标抗体（二抗）1份，显色剂A、B各1份，终止液1份，洗涤液1份，2、待检血清5份3、微量加样器（10-100ul）及匹配的枪头4、废液缸注意：有污染性。夹心法检测HBsAg方法

由于抗体1已包被在酶标板上，故直接从加抗原开始。1、加样：每组2条8孔，待检8孔，阴性对照、阳性对照、空白对照各1孔。分别加75ul待测样本和阴、阳性对照于相应孔内，盖封板膜，置37℃恒温箱温育60分钟。

2、加酶标抗体：除空白对照孔外，每孔加1滴酶标溶液，混匀后封板，置37℃水浴箱温育30分钟。

3、洗涤：用洗涤液（按说明配制）注满各孔，静置20秒，甩去洗涤液，重复4次，最后一次在吸水纸上拍干。

4、显色：每孔加底物液A、B各1滴（50ul），轻拍混匀，置37℃避光显色30分钟，肉眼观察。

5、终止：每孔加终止液1滴（50ul），轻拍混匀。在10分钟内酶标

6、测定：用酶标仪（波长450nm）测定各孔吸光度OD值。

酶：辣根过氧化物酶(HRP)底物：3,3‘,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）在辣根过氧化物酶催化下，TMB会产生可溶性蓝色产物。使用2M

H2SO4终止反应，在

450nm测定吸光度。结果判断

1、定性：夹心法ELSIA中，阳性孔呈色深于阴性孔。2、P/N值≥2.1者判为HBsAg阳性；P/N值＜2.1者判为阴性。介于中间为可疑。S：待测样本OD值COV：cut-offvalue=NCx+0.100NCx：阴性对照OD值的均值阳性判定值=S/COV≧1.0：阳性﹤1.0：阴性实验烘报告1、计宅算5个待董测样晴本的S/辜CO吉V，判冈断结浮果2、本董实验陷中采韵用的宾酶、球底物江及反邀应原油理。实验装十Ig乎G的分营离和今纯化实验美目的实践Ig每G分离劝纯化负过程了解龙分离习、纯辟化抗敏体的齐原理比较粱成年剑牛血回清与辽新生峰牛血菠清中Ig喜G的含咬量（觉眼观膛）实验扎原理利用哈蛋白近质盐硬析原安理，戒分离手血清木中的Ig炒G:不同颜蛋白福质在述同一眼浓度刷盐溶效液中滨的溶庆解度年不同暑，因狼此，薄可利怎用不估同浓泄度的耀盐溶画液使慈血清每中的挠各个柴蛋白勾质成锄分分颈别析谊出。血清呀蛋白片质：疏复杂山混合市物。1、白史蛋白奶、a1、a2、β球蛋蜘白，赢纤维剥蛋白蕉原，跪凝血罢酶原诱和其归它凝统血因违子等浮均由肝细丝式胞合成傍。2、γ球蛋攀白主艰要来训自浆细分胞。免疫箱球蛋万白大命多数琴存在迁于丙肚种球犁蛋白导（γ-球蛋姿白）爸中。免疫欺球蛋悟白可符以分牵为Ig挂G、Ig聪A、Ig键M、Ig仆D、Ig尊E五类越。一般pH验7.妹0时，50％硫周酸铵册饱和蹄度可径将所罚有的5种Ig（球访蛋白执）沉使淀出捡来。33％饱诱和度废大部吵分Ig搂G可沉嘉淀出傅来。意义鹊：制敞备出愤的纯沟化Ig兰G，可便用于宰酶标饥抗体瓣或荧胃光抗唐体的求制备忘。实验峡器材1．动诵物抗拉血清夹：成乳年牛消血清讲、新薄生牛已血清2．硫乡丰酸铵易饱和犬溶液渣、0.尼01居mo朗l/斧L的PB该S3．冰斩箱、惹离心棵机、雕电磁端搅拌软器、妙天平趴、尼萌龙绳恒等。实验青步骤1.取xm太l血清巩（2m惜l），加竿等量0.槽01沟mo傍l/叨L的PB辨S稀释歼，搅穴拌下孩逐滴漂加入享饱和(N善H4)2SO4溶液2X惹m根l（4m踪蝶l），边捡加边俱搅拌慢，4℃静置30分钟冬以上尼，使炒其充亡分沉孤淀。2.离心舰：30付00～40随00吉r/扯mi侵n离心20俩mi介n，弃丙上清管。3.以0.雪01横mo遥l/细L的PB军S溶解绢沉淀谱至Xm碧l（5m怖l），再逐杠滴加研入饱菜和(N尊H4)2SO4X/柜2m按l（2.训5m系l)。置4℃，30～60分钟省。4.再离繁心：30配00裤r～40平00燃r/龄mi满n离心20采mi喘n，弃钉上清削。5.重复脾上述森第3、4步骤1－2次，产可得嫩到较肠纯的Ig意G。[6蹈.透析腊除盐:装入饱透析层袋,分别状