第四章动植物细胞培养产酶

第四章动植物细胞培养产酶TheproductionofEnzymebyCulturingofAnimalorPlantCells概述动物细胞无细胞壁，容易贴壁对营养要求严格（血清培养基）对环境敏感（pH、溶氧、温度、剪切应力）植物细胞有细胞壁，但比微生物的细胞壁脆弱营养要求较动物细胞简单生长缓慢，培养周期长，要达到高密度较困难植物细胞与动物细胞、微生物细胞培养的比较特征哺乳动物细胞植物细胞微生物细胞大小(m)10～10010～1001～10生长形式悬浮、贴壁悬浮悬浮营养要求很复杂很复杂简单倍增时间(h)15～10020～1200.5～5细胞分化有有限分化无环境影响非常敏感敏感一般产物存在部位胞内或胞外胞内或胞外胞内或胞外产物浓度低低高供氧需求(KLa)1～2520～30100～1000产物种类疫苗、单抗、酶、生长因子、激素等天然色素、天然有机化合物等抗生素、有机小分子、酶等植物细胞与动物细胞、微生物细胞培养的比较动物细胞、植物细胞和微生物细胞可以用相同方式培养动物细胞、植物细胞的生产周期比微生物长植物细胞和动物细胞对剪切力敏感植物、微生物和动物细胞的主要目的产物各不相同动物细胞——蛋白疫苗、抗体、激素、酶（蛋白质或多肽）植物细胞——色素、香精、天然产物（小分子）、酶本章主要内容动植物细胞中酶生物合成的调节植物细胞培养产酶植物细胞及其培养特点植物细胞培养及产酶的工艺控制动物细胞培养产酶动物细胞及其培养特点动物细胞培养及产酶的工艺控制从基因到蛋白质有关微生物细胞中酶合成的调节理论也基本适用于动植物细胞动植物细胞具有比微生物更多的调节方式转录水平调节翻译水平调节激素、神经调节第一节动植物细胞中酶生物合成的调节基因扩增加速酶的合成通过增加基因的数量调节基因表达，可以发生在个体发育某一阶段或细胞分化某一过程细胞的一种应急方式基因扩增可以由选择压力引起耐药性细胞的抗药性产生例：CHO细胞为对抗氨甲基喋呤对二氢叶酸还原酶的抑制，编码这种酶的基因急剧扩增第一节动植物细胞中酶生物合成的调节

增强子促进酶的生物合成增强子（modulator）——能高效增强或促进基因转录的一段DNA序列增强子能促进同源或异源启动基因的转录活性，可高效增强某些酶基因的表达具有细胞或组织特异性，在不同细胞或组织中增强效果不同抗原诱导抗体酶的生物合成抗体酶（abzyme）：催化性抗体，是具有生物催化功能的抗体分子，是人工改造的对抗体可变区赋予催化特性的特殊抗体修饰法在抗体与抗原结合部位引进催化基团诱导法（主要方法）半抗原诱导酶蛋白诱导1902年，Haberlandt首次提出分离植物单细胞并培养成植株的设想植物细胞的全能性Haberlandt植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶种类产酶植物细胞产酶品种胡萝卜细胞糖苷酶紫苜蓿细胞-半乳糖苷酶甜菜细胞过氧化物酶、酸性/碱性转化酶、糖化酶大豆细胞过氧化物酶、苯丙氨酸裂合酶花生细胞苯丙氨酸裂合酶假挪威槭细胞漆酶利马豆细胞-葡萄糖苷酶番木瓜细胞木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶大蒜细胞超氧化物歧化酶菠萝细胞菠萝蛋白酶剑麻细胞剑麻蛋白酶植物细胞结构植物细胞的主要特点体积较大：比动物细胞和微生物细胞都大细胞生长速率和代谢速率低于微生物细胞，生长周期长营养要求较动物细胞简单细胞生长及合成次级代谢产物需要光照条件对剪切力较敏感主要用于产天然产物、色素、香精等有机物（次级代谢物）植物细胞培养的优势提高目标物的产率缩短生产周期木瓜蛋白酶：木瓜生长期8个月，木瓜细胞培养约1个月易于管理，不受自然因素控制可以提高产物质量通过严格的培养条件控制，减少植株病虫害和污染缺点培养条件要求高——光照、剪切力影响显著植物细胞生长缓慢——相对于微生物植物体外培养胚培养、器官培养、愈伤组织培养、细胞培养植物另细胞蔬培养——外植鼓体选都择和卧处理外植龙体（ex巴pl潮an俭t）从植铜株取遍出，咽经预易处理拾后用脾于组袄织和缸细胞炸培养恶的植谜物组仁织片禽段或拒小块根、尖茎、桐叶、袋芽、魔花、荒果实条、种坟子等选择踢：无诊病虫俯害、序生长干旺盛幻玉、生里长有总规则切片重：0.疗5～1醉cm消毒70顺%乙醇5%次氯峰酸钠/置10圈%漂白勿粉0.胞01～0.污1%念H宋gC弃l2植物鹿细胞好培养——获取酒植物蝇细胞手：直网接分悉离法直接角分离烤法即仪直接禁从外成植体测中分锅离机械这法将外动植体纪捣碎络，过书滤或滤离心倒分离榴细胞质壁鹅未分捡离；鲜细胞句破碎停率高总，完血整细穷胞数熄量少酶解租法利用阵果胶驴酶、队纤维到素酶萌等处禽理外董植体躁，分望离具伟有代恩谢活衔性的幕细胞能降黄解细笑胞壁委，必镇须对嗓细胞组给予娱渗透辉压保报护植物融细胞愉培养——获取庙植物蝇细胞宪：愈源伤组挖织诱击导法愈伤醉组织堂（ca备ll徒us）由外艇植体赠组织嫩增生众的细子胞产病生的乏团状挡不定抖型的违疏散较排列阵的薄始壁细耀胞群飞体；法本意涝是指据植物矩体的态局部吸受到泛创伤劣刺激币后，垦在伤夺口表袭面新略生的袖可帮劫助伤潮口愈衔合的嗓组织诱导邀过程配制胶半固塌体诱楼导培削养基灭菌嫩、植域入外废植体1～3周后通继代究培养植物腊细胞呆培养——获取盐植物吴细胞臣：原墙生质惯体再夫生法一般桐采用惠酶解圆法分圈离原衣生质奥体，启使用爷纤维森素酶棚和果茅胶酶悉混合拐物保持枯溶液养的高如渗状捆态防止灰原生方质体文胀裂渗透氧压稳拾定剂干：糖尺、盐隐、甘纪露醇糕、山湖梨醇服等原生抚质体抽培养城，再定生细骡胞壁植物略细胞偶培养——悬浮诉培养将游有离的泄单细德胞或愤细胞债团按翻照一巧定的器细胞恨密度拉悬浮宅在液错体培错养基狂中进痛行培榴养的案方法悬浮单培养必的细微胞一皱般来预源于烤愈伤启组织吊，选橡择较邀松散号的为纷宜植物械细胞深培养——产物锹分离预纯化收集干培养城液，摊从中叼获得鼻所需井的产肠物植物和细胞府培养垂基水：蛮一般弟用去丝式离子奖水或衬蒸馏绪水无机绝成分大量弱元素遗：N、P、K、Ca、Mg、S微量复元素或：Fe、B、Mn、Zn、Cu、Mo、Co有机律成分碳源津：糖妖，以合蔗糖绪最常晓用氮源提：氨写基酸妖（Gl塑y、Al少a、Se驱r、Cy稀s…）及丹蛋白倦水解圣物、角无机叶氮维生旷素：田主要李是B族维庙生素访和维靠生素C生长傲调节握剂：咸生长厨激素般、细湾胞分用裂素诉等（鞭微量恋）其他捞：肌仍醇、第琼脂弄等常用厚的植廉物细战胞培门养基MS培养雀基硝酸均盐浓程度较汉高，家营养虚成分哥适宜馒，使森用范钻围广B5培养薪基NH4+浓度羊较低若，适豆用于鞭双子毯叶木启本植站物Wh葬it冶e培养座基无机路盐浓扮度低酒，高Mg穗(I蝇I)、B(厅II牙I)，适熔用于给生根脂培养KM版-8下P培养骂基有机韵成分叮种类计齐全访，用牙于原貌生质掀体培总养培养巧基配胞制配制妙母液意，使阀用时注按需票要稀振释工艺膝条件隶及其滩控制温度室温矿范围齐（25oC左右图）最适稻产酶回温度贵和最歌适生床长温强度不避同pH微酸串性（pH焰5～6）细胞逐培养宇时，pH一般侍变化纲不大溶解赢氧植物融细胞陈需氧晶量不鸡高，融供氧灶不宜桃过量对剪剑切力增敏感废，通续风搅竟拌不茅宜太粒剧烈工艺荡条件绿及其熊控制光照光照鄙对植五物细彼胞的爹生长你和产码物合普成具梢有重射要影绪响（骡植物嚼特色紫）光照汉有时活也抑矩制产汇物合协成添加臭前体前体仙：处弓于目慕的代竹谢物勉代谢射途径置上游遗的物涛质添加虽前体泻相对甲于添垄加了亩反应纹的底到物刺激岔剂（el家ec崭to辫r）引导有物质僵朝特芹定的辜代谢辛方向骄进行严，强鹅化次柴级代饼谢产劈燕物的裤生物看合成常用梯微生贱物细戒胞壁劣碎片寒和胞伪外酶产酶彩实例——大蒜布细胞辜培养伤产SO破D超氧劈燕化物暂歧化谅酶（su平pe森ro皮xi倘de姑d恭is绒mu揉ta指se，SO陶D，EC挪1堪.1栋5.介1.察1）生物棍体内驰清除骨超氧意化物糟阴离父子自野由基柄（O2·-）的毒重要浮金属糠酶类SO余D和过活氧化据氢酶(c习at景al殿as崖e)、过能氧化餐物酶(p面er拥ox庄id老as忌e，PO缓D)一起迈构成训了生劫物体害内重裙要的哥酶促淋反应柜防御桃体系染，从避而维益护生壤物体跟内细泼胞正浊常的续生理倾代谢学和生血化反齿应产酶旷实例——大蒜泪细胞抖培养停产SO底D大蒜节愈伤傅组织赵的诱述导选取今结实欲、饱诱满、皂无病给虫害常的大茫蒜蒜介瓣，童去除秘外皮先用70无%乙醇证消毒20奴s，再火用0.泪1%升汞旧消毒10猴m阅in，然筛后无编菌水联漂洗3次在无苍菌条抚件下妙，切详成0.练5屑cm3的小茂块，驱植入委含有3何mg第/L疗2观,4疯-D和1.某2驳mg类/L论6续-B饺A的半昏固体MS培养梁基中25oC，60棚0藏lu嘉x，12迷h换/d光照络条件灵下培邻养18天，麻诱导揭得到机愈伤匆组织旷，每18天继呆代一吸次产酶伐实例——大蒜窜细胞必培养软产SO叉D大蒜住细胞点悬浮性培养将上宏述在执半固得体MS培养剃基上懂培养18天的瓶愈伤肃组织谅，在鼓无菌堵条件击下转赶入含卡有3颤mg已/L胁2绵,4票-D和1.药2煤mg企/L丈6膛-B黎A的液他体MS培养侄基中占，加职入灭炎菌的贤玻璃厉珠，25oC，60歉0毙lu图x，12即h击/d光照便条件肿下振这荡培速养10～12天，权使愈渐伤组矩织分章散成敢为小肯细胞书团或狠单细之胞无菌龟条件滤下，萝经过碰筛网热将小嫂细胞抗团或雀单细静胞转扑入含污有3泥mg凡/L钻2建,4药-D和1.仿2节mg遗/L离6凝-B仍A的液拳体MS培养寻基中症，25oC，60疑0晓lu快x，12待h迁/d光照句条件腐下振饲荡培谁养18天SO产D分离牌纯化收集阵细胞怎，破乞碎，卷用pH意7犯.8磷酸厘盐缓取冲液艳提取19葛07年，Ha障rr瞧is合on开创淹了动楼物组荐织培叶养的宅先河从蝌汤蚪的色脊索狗中分墓离出亩神经猴组织退，放刑在青墙蛙的佩凝固交的淋隐巴液获中培寨养，腿蝌蚪国的神管经组械织存虏活了查数周坝，并覆且从纸神经轻细胞徐中长可出了秒神经休纤维19回50诵s，Ea灭rl筐e用动相物细枯胞培捎养制驾取病超毒疫艘苗19盏67年，尚动物严细胞瘦贴壁愧培养夹微载梅体开血发19圣75年，装杂交钳瘤技捏术动物吊细胞商可产蹄生较妇高价竞值的传物质激素藏、疫烫苗、弱单克不隆抗贴体、杜酶动物昆细胞帽培养需产酶动物张细胞负结构动物勾细胞格特性没有属细胞叙壁，锡细胞寸脆弱桌（区仙别于吓植物冻和微少生物亭）体积昼比微筛生物闸细胞揉大几机千倍虾，但乞稍小根于植钓物细睬胞在肌丸体内衣相互置粘连称，以欠群体咳形式辆存在在培侧养时粒具有蛇群体肾效应涂、贴嗓壁依徐赖性配、接信触抑矛制性先、功具能全营能性营养睛要求事复杂厌（血仓清培聋养基两）动物惠细胞滴培养雨的特堡点主要容用于罩生产康蛋白溪质生长叹缓慢容易托受污译染（闷细菌析、支碧原体鹊），咱培养习过程趴中需旺添加屋抗生搭素对剪袭切力叫特别东敏感布（胞厌外缺滚少保纵护结际构）大部犁分具识有贴提壁依垃赖性——贴壁气培养培养鉴基成贴分复俘杂，宪价格传高昂细胞爹生命引有限暂，一屯般最误多继袍代培生养50代即撕退化绝死亡动物药细胞醋培养盟方式——悬浮是培养适用摘于非纲贴壁蔬依赖催型细佩胞杂交添瘤细涝胞、拍肿瘤智细胞维、体恩液（起血液挽、淋巷巴液季）细潜胞类似软于微抖生物馒细胞扇的深番层发殊酵，俭但工宇艺条汪件有赌较大蓬差别对通搂气、登搅拌齐耐受俯性差对氧宣气的吩要求违较微滩生物拿低，鱼培养闹时需惭通入渐一定编比例CO2优点要（相惹对于雹贴壁逃培养密）细胞缴在培宇养液皇中均阀匀分塞散，杂生长始情况劲良好传代趁培养减容易骗，无愈需消衡化分六散细歉胞培养逢基中水营养顶成分森利用普率高动物静细胞钓培养辨方式——贴壁鼓培养适用粮于贴情壁依沾赖型鬼细胞上皮蜘细胞纤、成图纤维各细胞细胞输在培辟养容稀器表兔面迅享速铺殿展并巴分裂滚瓶谣培养锈系统结构艘简单稻，但洁比表词面积劲小微载尿体培奖养系毅统由葡舱聚糖际凝胶这等聚称合物化制得院的微写球兼具孩单层蕉培养艳和悬受浮培讯养的留优势细胞遭生长榨环境志均一动物贵细胞创培养嚼方式——固定活化培妹养贴壁价或非袭贴壁近依赖妹型细赢胞均知适用吸附孔法载体悔为多腊孔性钱颗粒侍，如络陶瓷饱颗粒浮、玻凤璃珠用及硅很胶颗格粒贴壁参型细芦胞的肾微载鹿体培撕养即隔属此置类包埋喜法将细乒胞包圾埋于裁琼脂鬼、琼抹脂糖仁、胶膀原及沉血纤讨维等丘海绵恰状基萝质中细胞拒不易担脱落固定挤化培跳养优扭点细胞裳损伤固程度访低，驻可重槽复使泼用产物棚分离湖容易动物指细胞枣培养尘过程种质急细胞体细鼓胞（相动物任体内新组织威取出茫）杂交俊瘤细昆胞基本劈燕工艺舅过程动物征细胞繁培养苹基氨基鞠酸：榜各种动必需时氨基坑酸，Gl霸n等，浸作为权碳源岗和能旦源利恭用维生虾素：B族和渗维C，可姓由血第清提梦供无机架盐：澡调节寨渗透推压微量苏元素瓦：Fe、Cu、Zn等，键可由六血清敬提供葡萄耀糖：游作为脏碳源樱和能两源（崇易产健生乳息酸）激素州：胰梳岛素造、生较长激质素、灯氢化捎可的咱松等旅，可亲由血饮清提吹供生长凡因子匀：如己表皮及生长友因子肢、神瘦经生祖长因掠子、先成纤忌维细值胞生池长因烤子等驰，一榴般来联源于梦血清培养钢基配设制配制很母液税，使库用前窗过滤栗除菌之、稀摊释；Gl睬n单独疼配制凉，冷需冻保衣存动物咬细胞碑培养逃的工版艺条食件及忠其控岗制温度哺乳片动物贩细胞室培养倘一般聋控制毁在36风.5吸±0助.2上5oC温度传也影夸响CO2溶解僚度，弓从而尖影响屋培养胁液pH值渗透张压保持编细胞百内外捐等渗雀状态另，一呜般70念0～85备0渣kP斧a溶解泼氧供氧俭不足潜：细喘胞生假长受讲抑制过量娇供氧由：容露易产差生较呼多氧延自由躲基，心杀伤牺细胞用混仙合气娘代替命空气热（空颜气、O2、N2、CO2）动物助细胞好培养霞的工热艺条信件及持其控杆制pH值与CO2浓度动物崇细胞未培养杂液pH在7.职0～7.俘6之间袄，以pH阴7脏.4为最虫佳最常冲用的婶缓冲铺体系届为CO2/境HC洽O3-动物统细胞芳培养涝时缺棚少CO2，培复养液园中的HC凶O3-会被庭耗尽词；CO2保持榴了HC负O3-的浓鼻度，公以提颂供稳芝定的秤缓冲窜环境通常CO2浓度尺维持柴在2～10咐%之间指示怕剂：虏酚红动物倘细胞移培养犁的工内艺条岩件及勇其控叼制pH值——娃H合EP字ES缓冲民体系HE葱PE恒S：4-羟乙周基哌者嗪乙粘磺酸4-股(2浙-h环yd厨ro榨xy周et永hy缘瑞l)泊-1衬-p测ip扭er洒az勺ine-1晒-e厌th这an览es茎ul桑fo景ni摊c赞ac仆idHE鹅PE畅S悔is秆a者z他wi挠tt某er梯io啦ni搭c光or叶ga乌ni制c缎ch修em起ic振al杨b梯uf傍fe努ri坡ng通a皆ge略nt帆.狡HE睡PE鹿S测is肢w贵id舟el掀y粪us鱼ed酸i敌n拼ce梳ll约c资ul政tu克re插,愧la笋rg遭el务y不be逝ca产us掀e翼it丹i茎s萍be摸tt受er究a精t禽ma慰in求ta屠in恩in稠g掩ph习ys必io递lo踏gi逼ca干l笔pH读d筹es挖pi检te雷c洞ha原ng搁es唱i踪蝶n弄ca悲rb色on恋d侮io检xi功de克c竹on隐ce舍nt谊ra进ti盼on企(霉pr腐od源uc翼ed的b倚y饰ce推ll依ul肺ar按r男es伍pi饶ra隐ti欧on丹)佣wh言en孩c毯om唱pa仓re姿d泽to桐b脱ic皱ar呈bo两na蹲te验b器uf逆fe聚rs监,菜wh棋ic林h事ar等e讯al跌so吩c勾om巷mo缝nl笨y夜us学ed茂i泥n疑ce酸ll典c围ul毁tu所re莫.紫HE躲PE隆S括is贞l忽ik趁e角wa胸te党r华in消t妥ha稳t辣it族s辆di璃ss景oc临ia稼ti陪on广d歼ec猴re塞as桥es淡a忆s创th谊e唯te驴mp买er室at茧ur忆e扇de悔cr蒜ea判se刘s.冷T幼hi求s绪ma幻玉ke哪s壤HE闯PE润S林a仗mo墙re倾e刑ff跳ec亲ti债ve两b链uf开fe抢ri要ng管a草ge枣nt巧f肿or峡m堆ai见nt帐ai演ni汗ng椒e夜nz新ym与e巧st窗ru立ct惧ur睛e饺an枪d臭fu券nc桃ti刷on都a派t欠lo弦w文te伴mp靠er傍at字ur植es肃.相关泰问题——为什方么培连养的钳细胞惭要及器时传趣代传代福培养榨：将仍原代珠培养捕的细桥胞分奥离、时稀释创并接虽种到勒新培妨养基趣上继灶续扩换大培猾养的毒阶段体外资培养采的细毫胞大越多具盘有生捷长接琴触抑惧制的坏特性纠，也番就是从说当情一个映细胞牧被其超他细传胞包污围的哭时候姓，它逢就会煌停止键生长当细剪胞铺侮满培慢养器自皿的样表面姐时，待正常俗的细坏胞停葬止生炉长，碗但是陵转化恳（即轧发生悬遗传独物质狮突变甘）的征、对谦接触炮抑制那不敏闪感的鸡细胞着会继泡续生未长如果兵不及或时传凶代，牺这些序转化株的细友胞就肃会逐镇步取尊代正绑常的委细胞忘，导策致正跟常细己胞的李退化?产酶恨实例——人黑盒色素辣瘤细展胞培霞养生棵产tP大ATi凡ss浸ue喂p勾la脾sm纱in世og侦en银a永ct危iv牛at盯or安(ab本br.产tP拦A)训i雹s道a驾pr已ot柿ei榜n米in弄vo突lv册ed尿i鸟n惨th称e斤br欲ea葡kd姥ow际n黑of柴b体lo婆od把c杂lo泽ts筐.告It畅i乖s伤a营se究ri肉ne旬p稳ro煎te车as诉e絮(E贫C璃3.驳4.择21蚀.6劈燕8)厅f功ou艇nd拐o享n挂en路do疫th狡el积ia叼l纪ce谢ll乏s,宁t膊he缎c争el端ls圆t销ha晃t挡li矛ne痛t惜he估b故lo录od掠v播es建se患ls她.肿As液a驶n午en餐zy得me筋,煮it唐c结at窗al萄yz州es吩t淹he胡c劝on灰ve狗rs嫌io血n陕of舱p悬la牲sm阅in产og孟en鸟t腔o诸pl请as复mi阅n,宵t典he俭m等aj妈or址e雁nz冈ym靠e锣re岛sp死on泰si川bl蛇e颜fo舰r税cl匹ot喂b见re黎ak执do悉wn神.苦Be窃ca备us陷e答it廉w交or防ks觉o逗n朋th瞒e困cl腐ot刘ti动ng再s耍ys兽te驻m,果t甲PA危i移s厌us她ed缘瑞i浆n萄cl铅in聋ic丽al搁m妥ed龄ic谊in净e呢to虫t螺re乐at漆o艺nl建y抵em广bo征li遣c骗or堆t群hr俩om彼bo证ti农c吩st供ro难ke穿.笑Us爪e客is剑c疑on催tr则ai闭nd凝ic示a