非小细胞肺癌文献一篇

1

LiquidChromatography/MassSpectrometryMethodsforMeasuringDipeptideAbundanceinNon-SmallCellLungCancer褚晓芳使用液相色谱-质谱技术分析非小细胞肺癌患者组织中二肽丰度的变化主要内容肺癌简介实验流程样品处理LC/MS分析MS/MS分析MS数据分析质量控制统计分析主要内容实验结果肺癌相关二肽数据库产生肺癌组织中二肽的识别MS/MS二肽谱图不同分析条件下二肽的识别肺癌组织中二肽的靶标分析结论验证研究意义及不足肺癌简介在美国，肺癌死亡率在所有癌症中最高，2012年共有165000死于肺癌。在全世界范围内，估计肺癌影响超过100万人。肺癌中80%是非小细胞肺癌目前，肺癌早期及进展阶段仍没有灵敏度高的诊断手段肺癌相关的代谢组学研究较少肺癌相关研究肺癌早期的代谢组学研究表明在肿瘤样本中有许多代谢物发生表达的改变在不同化疗耐药性的肺癌细胞系中，胆碱、脂肪、乳酸、甘氨酸水平有明显的改变在埃罗替尼治疗或进行切除手术的患者中，同侧细支气管肺泡癌发生病变在肺癌患者血清和组织样本的混合物中，有48种代谢物在组织和肺癌不同进展阶段有明显改变二肽对真核生物的作用二肽在蛋白质营养、增长及发展中其重要作用二肽水平通过肽转运体中的膜蛋白调节肽转运体广泛存在于大脑、胰腺、肠、肾脏等器官中主要内容实验流程样品处理LC/MS分析MS/MS分析MS数据分析质量控制统计分析样品处理Testingset:9名确诊为肺癌恶性腺瘤的男性样本:

①有代表性的肺癌组织切片

②与肿瘤组织相邻的正常组织切片

③距原发肿瘤＞3cm处的正常组织切片样品处理Validationset10名确诊为肺癌恶性腺瘤的男性样本:

①有代表性的肺癌组织切片②距原发肿瘤＞3cm处的正常组织切片样品处理Validationset6名确诊为肝癌的患者目的:

证明在非小细胞肺癌患者中找到的代谢物标

志物具有特异性所有样品在分离后快速冷冻30-60min，处理前在-80℃保存样品处理组织提取①将分离的组织称重后用不锈钢珠同质化，频率为20次/s，持续30s②加入标准溶剂混合物重复4次同质化过程③用蒸汽离心蒸发浓缩器干燥氯仿-甲醇-水层中的极性代谢物④将干燥后的样品复溶于水样品处理⑤衍生化：50μL极性代谢提取物+25μL0.1M的四硼酸钠缓冲液+50μL20mM丹磺酰氯(乙腈为溶剂)，涡旋混匀丹酰衍生化目的:提高代谢物检测敏感性10-1000倍提高极性代谢物在液相色谱柱上的保留和分离⑥室温孵育30min，加入50μL0.5%甲酸停止反应⑦将反应混合液上层清液转移至自动采样瓶主要内容实验流程样品处理LC/MS分析MS/MS分析MS数据分析质量控制统计分析LS/MS工作原理：通过液相色谱分离化合物(主要是沸点高、极性强、热稳定性差的化合物)，再通过电喷雾电离产生样品离子，进入质谱仪后按质荷比分离，然后测定各种离子谱峰的强度而实现分析目的。梯度匆洗脱稳装置:利用祖两种掏或两拥种以赵上溶态剂，俯按照尊一定洽的时裳间顺狠序连挺续或求阶段啊改变寄溶剂肢比例狡，从衡而改尸变流拦动相液的极衔性、辟离子换强度第和PH值，樱使样捧品的旱各组肚分在抗最佳阿容量疗因子姜值范衔围内调流出县色谱狡柱，隐改善展分离垒效果质谱解析味一般淘步骤:核对基获得闯的谱辆图，各扣除速本底掘等因圆素引供起的礼失真尽可屋能判岸断分侄子离践子，稍即确揭定分贩子质洲量;谱图顺中往券往有圆很多贵碎片愿离子俯，这蹦些碎迈片离围子是魔由准驱分子茧离子经裂解墙产生假设和排交列可握能的炮结构卖归属素，高举质量做离子恋显示娇的M-路1，M-援15，M-尖18隐……即表示泳失去H、CH3、H2O…蛛…推出开可能超的分遮子结难构，衫以标穴准谱蛇图对偿比，左确定仍分子窜结构LC大/M如S分析仪器绑：安踪蝶捷伦65估20系列竞四极悉杆飞价行时念间串餐联质耻谱仪(带有安捷锯伦12添90超高宅效液讨相色饰谱系群统)方法A：Zo超rb姜ax疼C18液相拥分析做柱流动薄相流失动速肚率5μL/m园in洗脱葡液B:济5%呈-9袖5%浓度狗梯度洗脱翁时间:3匙0m程in，95挠%B时维塑持5m粱inLC涛/M象S分析溶剂A:蛮HP次LC水+0共.1旗%水溶剂B:颠LC药/M似S级乙之腈+0匠.1烘%甲酸毛细各管温霞度:3饱25℃m/歇z1不0-浴10棵00之间骗进行讯全谱歇扫描常用花固定说相:硅胶谊、氨津基、雾二醇巴基等常用吗流动往相:水、详乙腈很、异共丙醇LC物/M隔S分析方法B:Ph抱en杠om野en浅ex孟K谨in兵et谅ex能C18液相宁分析剑柱流动要速率0.此5m淡l/其mi畅n进行蜡洗脱洗脱方液B:薯5%孔-9或5%浓度绵梯度T(min)B(%)0.5520.5602595309555LC辜/M坑S分析方法C:Ki垦ne争te否x液相岩分析古柱流动萝速率0.鲜5m融l/径mi谊n进行碧洗脱洗脱疏液B:垦10剃%-线95务%浓度灿梯度T(min)B(%)0.5102.52017.560189555主要搭内容实验邀流程样品异处理LC宰/M烧S分析MS岁/M挥S分析MS数据轧分析质量消控制统计板分析MS版/M主S分析仪器蕉：安快捷伦65趟20系列慰四极膝杆飞注行时中间串膨联质识谱仪靶向MS侧/M少S分析:保留健时间:0级.6逼mi答n离子钞碰撞代能量:2京6V势(质量趋大的惧分子:3摩2V筹)分离啊宽度:4流m/虎z为何浴在用LS值/M钢S分析命后，现还要农采用MS趟/M谨S分析彻？LS捡/M瘦S谱图督中样械品的洒准分沟子离沟子峰炼丰度谣较高塔，碎繁片峰杆则少凶而弱肤，因纵此主扫要给险出与用样品乌的分够子质预量相午关的祥信息矛，而搂很少杀给出形与样爽品结粗构有短关的窝信息遇，采嘴用多让级质唯谱MS表/M辽S可以拔弥补脂这一绿缺陷凉。主要味内容实验荐流程样品润处理LC温/M券S分析MS刊/M我S分析MS数据锐分析质量吴控制统计踪蝶分析MS数据疯分析非靶耐向数城据分余析:使用乎代谢晶组学烈分析盈软件轧提取魂保留施时间觉一致陶的峰榨，用遵最小沾二乘钱法检雕测非赛靶向锹代谢去物的巷特征尊，比梦对特系征分伪析数腔据库轿识别银评估话的结蛮果。靶向榜二肽主数据捡分析:使用却二肽分数据姿库和般特征炼分析孔数据邻库进啄行比堵对MS数据魂分析为什戚么要李进行亚峰对败齐？为了舱利用键色谱累图中比所有响可以皇识别疗的峰淘的信驶息，桨必须木对谱欲图进五行峰剥匹配脂，不尖同样秋本中仪同一辛代谢刷产物盖在生趴成的汪数据踢矩阵聪中必司须由勿同一械变量寇来表荣示，镰这样严各个练样本驻间的替数据掉才可想以比擦较。对数域据的全要求师：①瓜有相惰同数嗽目的赛变量孩描述饱②每参个变失量在重样本仅中均谁出现过③所早有样兔本中曲的变小量代季表的娘意义柱相同主要余内容实验谢流程样品糊处理LC担/M统S分析MS搞/M凑S分析MS数据笛分析质量旗控制统计订分析质量子控制进样秧前后吃分析耻经过胆衍生寄化的26种氨果基酸沉标准酸混合脉物目的:保证故衍生恶化作锅用有挺效进搬行检验甲仪器融性能痰状态纲的良刺好保证竖能够朽获得言连续例的保况留时努间主要容内容实验梅流程样品缓处理LC超/M痛S分析MS刷/M图S分析MS数据渗分析质量酬控制统计斧分析统计笋分析非参数哭秩和理检验:评估团肿瘤俱组织期与两吹种正抬常组才织中世检测摄的二茎肽水叹平有获无明帜显变详化结果:没有幸相关锹的二衡肽有贵显著刻性差亏别二项肺分布:在检己测的33兼4种二艘肽中阶有10送5种有介统计浴学意详义因3个样晶本来说自同陵一个般体，丈故需夕分析辰样本孟大小惊对代冰谢物姓检测丝式结果户的影衰响主要煮内容实验汗结果肺癌尸相关温二肽稻数据圣库产爆生肺癌缝组织脸中二究肽的赌识别MS畅/M恶S二肽度谱图不同券分析姜条件曲下二只肽的姥识别肺癌爱组织榴中二含肽的蔑靶标津分析结论捆验证研究例意义伤及不斜足肺癌洲相关厨二肽商数据继库标准榨品二兔肽合峰成:基于醋组合源合成羽法的菊阵列企及包许含组飞氨酸体的二拐肽，掘不能抵合成合的二廉肽通摧过Aa宏ns叔pe烛c惊In淘t公司谜获得混合互物配脉置:将7-默30毫微随升具帝有相刷同C羧基与端的18种二埋肽混浙合并坐用50疾%乙腈箭和水非稀释幻玉成10μM，丹罪酰衍堪生化禽后，驼采用LC方法B及MS全谱雪扫描肺癌激相关夹二肽功数据设库氨基焦酸是腰生物餐样本苏中唯剖一分阻析物比，故君用氨汗基酸作为标准介品氨基写酸保超留时山间的止多项剑对齐过是对危齐二狗肽保坏留时兄间最厨好的而方法肺癌印组织茶中二票肽的击识别36盘1种二旧肽中花只有16污1种有业独特斜的化椅学分哥子式嚼，只田有17种是右单一愿的异化构体(A仍A)同分宰异构挽体二危肽的浓识别影需要帖仔细辅比较笔其滞蜡留特索性合并膀肿瘤捐样本鸣再分崇析得注到27毛9种二懒肽，治其中23蛾4种二柱肽的愚质量携精度仆＜5p烧pm，45种＜10塌pp沟m，将27晨9种二鄙肽保竭留时死间与激数据煌库比六对，预大部趁分二吓肽保消留时浑间在0.固1m洽in内，轨但有咳精氨森酸的杯二肽盯标准领品和辜样品应有明分显不痒同MS士/M含S二肽工谱图丹酰剑化二标肽的MS讽/M就S谱图岁通常补不提声供信叮息，线而主铁要以倚丹酰怎离子筹为主由丹锐酰分扁离出狐来的C12H12N阳离生子在遵大部五分丹暂酰化疫二肽侨谱图凶中产般生基舱峰，m/顶z为17限0.板09造6495煮%测量皆值与舒真实夸值相虚比降婚低(精度乐误差竿小于13叙pp字m)根据盗测量惠值得大到的及化学按分子租式精闲度误稍差都辅在13盐pp症m以内MS默/M愤S二肽失谱图MS耳/M见S二肽堂谱图其他时丹酰阀特征术的离猪子还抚包括:m/右z参23明4.铲05酬9否(C12H12NS借O2)在单君一带酿电离锻子中柜普遍谱存在佣且变伙异较智大；m/邀z惜25鼻2.蒜06算9郊(C12H14NS季O3)在含种氧二染肽中辈普遍疏存在战；m/木z洪18铅6.搬09驳2队(C12H12NO援)离子钥也很脏普遍MS涨/M迅S二肽啊谱图丹酰咳化二闹肽分柜裂处(经典梨离子)MS峡/M双S二肽峡谱图丹酰控化二只肽分说裂特眠征碎栋片MS爹/M鼓S二肽裙谱图MS基/M财S二肽植谱图动其他烫明显誉特征尸：由氨辛基酸I/狭L/挺V/嫩A组成劫的二叠肽在排位1或位2有经思典的I离子色氨胀酸的I离子民会发吓生中修性分智子的我丧失峡，产绩生m/果z1关44和13恶0的特坚征性宁碎片二肽宴通过搭中性悄丢失(焦谷篇氨酸呜盐)使c离子女增加带有朱氨基萌酸R、K、H的二纺肽有财复杂谅的特烟征二肽XR、RX使m/兴z为15免6/帮15巴7碎片筹增多MS惹/M社S二肽袖谱图赖氨构酸二画肽经目常带祖双电怜荷，m/例z3款17碎片紧显著迎，还谎有m/票z8惜4经典丹碎片组氨捏酸二象肽也哗经常犹带双悄电荷届，I1和I2碎片壳离子出较多HX双电展荷二督肽与NX、MX有相糟同的m/鹊z2清61的碎跑片离屈子蛋氨酸二蝇肽在m/清z3获37发生舍多次闪分裂举，产迫生不钥同碎躺片离毕子不同踏分析追条件炸下二谊肽的蔬识别氨基鞋酸作缝为内规标可甜以使孕来自款不同燃实验真室的构代谢警组数滑据具溜有可西比性本地勿散点里平滑肥估计(L崭OE蓄SS吸)是最提好的芳校准盛二肽钞保留趋时间芦的方菜法肺癌克组织攀中二筋肽的斤靶标考分析采用慈最小太二乘清法比拼较肿密瘤组炸织与逆正常菌组织唯中丰遮度变哨化明贯显的臂二肽有25艰7种二师肽至蚕少在呢一种彼组织妇中被乳检测裙到，肯其中25矮3种在某肿瘤杯组织纲中检孙测到在肿幼瘤组福织中鞭检测拐到90种二不肽丰肯度与丽正常狱组织认相比殊有明满显的脚增加(倍数蝴＞2,口P＜0.伪05住)成倍片增加处的倍穷数在2.赞1-序23涨.1不等签，