培训一各种引物设计

培训大纲一引物设计1.

普通基因或者片段扩增引物2.荧光定量PCR引物3.适用于酶切载体构建和Gateway载体构建的引物设计4.RNAi载体构建的引物5.亚细胞定位的载体构建二基因克隆1.普通PCR2.长片段及短片段克隆3.平末端，黏性末端克隆三TA克隆，Ecoil转化四质粒提取五载体构建1.酶切载体构建及验证2.Gateway载体构建及验证3.农杆菌转化（发根，根癌）六转基因及功能验证七苜蓿毛状根转化八菌根染色观察，显微镜使用当前第1页\共有27页\编于星期三\22点基因定义基因组DNAcDNARNA提取当前第2页\共有27页\编于星期三\22点1.家族基因。是指具有相同功能的，不同基因。2.转录本。是指一个基因有两个不同的转录结果。都来自于一个基因，由于选择性剪切导致的。当前第3页\共有27页\编于星期三\22点基因扩增PCR体系：酶，缓冲液Buffer,dNTP,MgCl2,引物F，R。Forward,ReF引物R引物当前第4页\共有27页\编于星期三\22点流程1.模板准备，引物准备2.PCR扩增3.片段回收4.连接TA克隆5.转化大肠杆菌6.测序，确定序列7.提质粒，保存菌液（15%-30%甘油）当前第5页\共有27页\编于星期三\22点序列寻找参考基因组网站：甜橙（Citrussinensis）。柑橘菌根模式：枳壳（Poncirustrif.），做为砧木，使用范围最广，抗寒。苜蓿基因组：/cgi-bin/medicago/overview.cgi。基因研究情况。当前第6页\共有27页\编于星期三\22点1.枳壳中基因，做亚细胞定位克隆启动子（用DNA）ATG前2kb，基因序列（用RNA反转录的cDNA）。2.对应到苜蓿中基因，做RNAi功能验证，荧光定量PCR验证。（用cDNA克隆）当前第7页\共有27页\编于星期三\22点引物设计原则1、长度：15—30bp，其有效长度[Ln=2(G十C)十(A十T)]一般不大于38，否则PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最佳作用温度(74度)，从而降低产物的特异性。2、G十c含量：应在40%一60%之间，PCR扩增中的复性温度一般是较低Tm值引物的Tm值减去5—10度。引物长度小于20时，其Tm恒等于4×(G十C)十2×(A十T)。3.Tm53-603、碱基分布的随机性：应避免连续出现4个以上的单一碱基。尤其是不应在其3’端出现超过3个的连续G或C，否则会使引物在G十C富集序列区错误引发。4、引物自身：不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构。5、引物之间：两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。6、上下游引物的互补性：一个引物的3‘末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上。7、3’末端：如果可能的话，每个引物的3‘末端碱基应为G或C。8、引物应当超出限制性内切酶识别位点至少3个核苷酸。示范。。。最普通的PCR引物设计。。。当前第8页\共有27页\编于星期三\22点当前第9页\共有27页\编于星期三\22点荧光定量PCR引物设计1.Tm60度。2.片段特异性。在基因组上，仅存在这一条片段，只能扩出这一条片段。选取3‘UTR区域。3.片段长度在60-100bp左右。当前第10页\共有27页\编于星期三\22点酶切法构建载体当前第11页\共有27页\编于星期三\22点1.选择载体上的酶切位点。保证所需要的基因片段中不包含此酶切位点。2.添加酶切位点和保护碱基。都添加到引物的5’端。当前第12页\共有27页\编于星期三\22点Topo克隆当前第13页\共有27页\编于星期三\22点当前第14页\共有27页\编于星期三\22点当前第15页\共有27页\编于星期三\22点当前第16页\共有27页\编于星期三\22点Gateway反应当前第17页\共有27页\编于星期三\22点当前第18页\共有27页\编于星期三\22点RNAi当前第19页\共有27页\编于星期三\22点当前第20页\共有27页\编于星期三\22点当前第21页\共有27页\编于星期三\22点超表达载体当前第22页\共有27页\编于星期三\22点RNAi引物设计1.片段长度：在300-500bp比较好。2.序列必须特异。特异到，20-21bp都没有和其它基因匹配上的。当前第23页\共有27页\编于星期三\22点当前第24页\共有27页\编于星期三\22点当前第25页\共有27页\编于星期三\22点亚细胞定位的