羊胰酶制备工艺优化

羊胰酶制备工艺优化李君兰;余群力;张丽淳B兆斌;刘亮亮【摘要】以研究羊胰脏提取胰酶工艺参数为目的。用低浓度异丙醇做提取剂，高浓度异丙醇做沉淀剂，在单因素基础上，运用均匀设计法研究激活时间、沉淀剂浓度、提取pH值和CaCl2对羊胰酶提取工艺的影响。胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶活力和胰酶提取率为响应指标，通过偏最小二乘回归（PLS）分析法对胰酶制备工艺的影响因素进行优化组合，并建立了具有制备条件的数学模型。试验结果表明，羊胰酶制备最适条件为：激活时间12h、沉淀剂浓度41%、提取pH值6.34和CaCl20.08%。此条件下验证实测值胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶的活力和胰酶提取率分别为3062.78u/g、30.06ku/g、32.37ku/g和6.16%,与理论预测值的相对误差分别为8.11%、1.28%、3.55%和5.29%。进一步验证了数学二次多项式回归模型的适合性,PLS优化结果的合理性。%Thepurposeofthispaperistooptimizetheconditionsforextractionofpancreaticenzymefromtheovinepancreas.Withlowconcentrationofisopropanolforextractionandhighconcentrationofisopropanolforprecipitant,theeffectsofactivatingtime,precipitantconcentration,extractingpHandamountofCaCl2onpancreatinpreparationwerestudiedbythemeansofuniformdesignonthebasisofasinglefactorexperiment.Withtheextractingratesoftrypsin,amylaseandlipaseasrespondingresults,thefactorsforpancreatinpreparationwereoptimizedbypartialleastsquare（PLS）regressionanalysis.Theresultsshowedthattheoptimalprocessingconditionsforpreparationofsheeppancreaticenzymes:activatingtime12h,precipitantconcentration41%,extractingpH6.34andCaCl20.08%.Undertheconditions,activitiesoftrypsin,amylaseandlipasewere3062.781u/g,30.06ku/g,32.37ku/grespectivelyandtheextractratewas6.16%.Therelativeerrorsofthemodelvalueswere8.11%,1.28%,3.55%,5.30%,respectively.TheseshowedthesuitabilityofthemathematicalquadraticpolynomialregressionmodelandtherationalityofPLSoptimizationresults.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷)，期】2011(037)006【总页数】6页(P120-125)【关键词】均匀设计;偏最小二乘回归;羊胰腺;胰酶;工艺优化【作者】李君兰;余群力;张丽;郭兆斌;刘亮亮【作者单位】河西学院绿洲农业研究所，甘肃张掖734000;甘肃农业大学食品工程学院，甘肃兰州730070;甘肃农业大学食品工程学院，甘肃兰州730070;甘肃农业大学食品工程学院，甘肃兰州730070;甘肃农业大学食品工程学院，甘肃兰州I730070;甘肃农业大学食品工程学院，甘肃兰州I730070【正文语种】中文【中图分类】TS201.25中国是畜牧业生产大国，2006年肉类总产量达到8.051x107t[1]，屠宰加工中约有2.236x105t不可食用的胰脏废弃物产生，其中羊胰脏占10%~15%。因羊肉本身特殊的营养价值和无宗教禁忌的食品特点，市场销量逐年递增，相应产生的废弃物对环境造成极大的污染。胰脏富含多种酶资源，主要成分有胰蛋白酶(EC)、胰淀粉酶(EC3)、胰脂肪酶(EC)、弹性酶(EC6)、胰激肽释放酶(EC5)、胰凝乳蛋白酶(EC)，羧肽酶(EC)［2-4］等多种酶类，导致胰腺组织降解速度快而不易保存［5-6］。但它是生化药物制备很重要的生物资源，胰酶在医药、食品、纺织、皮革、洗涤工业中具有广泛的用途。年产量已逾1000t,其中一半出口到日、欧、美等国［7］。胰酶制备的原料都是采用猪胰脏［8-10］,而用羊胰脏做为原料研究胰酶制备工艺的尚未见报道。均匀设计适用于多因素，多水平的实验设计，具有〃均匀分散，试验次数少”等优点［11］，近年来广泛用于科学研究。回归分析是均匀设计数据分析的主要手段，而偏最小二乘回归分析法(PartialLeast-SquaresRegression，简称PLS)是一种由数据样本进行建模的新型统计回归方法，集多元线性回归、主成分分析和典型相关分析的基本功能为一体，可以较好地解决自变量之间多重相关性、样本点容量不宜太少以及多个因变量对多个自变量同时回归分析等一般回归分析方法无法解决的问题［12］。本文用羊胰脏为原料，异丙醇作胰酶制备提取剂和沉淀剂，采用均匀设计和偏最小二乘回归分析相结合的方法对羊胰酶制备工艺参数进行优化研究，旨在为羊胰脏废弃物的利用提供科学理论依据。1材料与方法1.1试验材料新鲜藏绵羊及肉羊胰脏，由甘肃临夏清河源清真食品公司提供。胰脏从腹腔取出后立即送入-20°C的冰箱中冷冻保存。试验时剔除羊胰脏周围的脂肪与结蹄组织。1.2试验设备与试剂D-37520高速冷冻离心机，美国Sigma公司;UV-2550型紫外分光光度计，日本岛津;pHS-酸度计，上海精密科学仪器有限公司；Briton真空冷冻干燥箱，韩a；HH-8水浴锅，上海精密科学仪器有限公司。异丙醇、CaCl2、CH3COCH3、H3BO3、Na2B407、TCA（三氯乙酸）、Na2S2O3等均为AR级;酪氨酸、马铃薯淀粉、麦芽糖、橄榄油、牛胆盐、酪蛋白均为生化试剂。1.3实验方法1.3.1羊胰酶制备工艺步骤胰酶制备工艺参考HansSchultze［4］、吴晓英［8］等的方法，并对工艺做出改进，具体如下：胰浆-加马铃薯淀粉、麦芽糖-CaCl2激活―提取［m（原料）：m（异丙醇）=1:2）］-过滤-胰乳滤液-沉淀一离心（4000r/min,15min,4。0一脱脂（冷丙酮洗涤）-真空干燥-胰酶粉。1.3.2单因素实验胰酶属于混合酶制剂，是多国药典受载的助消化类药物，在胰腺中以无活性的酶原形式存在，提取前须激活。胰蛋白酶在消化中起关键作用，是一个触发酶，可以激活胰液中许多其他的酶原，也是药典规定的重要鉴定指标之一。且工业化生产还要注重胰酶提取率，所以单因素实验中以胰蛋白酶活力和提取率为考察指标。在制备工艺中设定激活温度5。、提取时间3h、沉淀温度5。不变，通过改变激活时间、提取剂浓度、沉淀剂浓度、激活剂（CaCl2）用量、提取pH等条件，考察这些因素对羊胰酶提取率和胰蛋白酶活力的影响。试验结果为3次重复的平均值，数据分析采用orgin7.5处理。1.3.3羊胰酶制备工艺参数优化设计在单因素实验基础上，选取激活时间x1、沉淀剂浓度x2、提取pH值x3、CaCl2x44个关键因子作为自变量，分析它们对因变量胰蛋白酶y1、胰淀粉酶y2、胰脂肪酶活力y3和提取率y4的影响。每个自变量的取值范围及水平分别为:激活时间3h<x1<17h(15水平)、沉淀剂浓度40%<x2<68%(15水平)、提取pH5.5<x3<7.5(5水平)、CaCl20.08%<x4<0.14%(5水平)，选取混合均匀试验设计表U15(152x52)。试验结果为3次重复的平均值，数据分析及PLS回归方程的建立采用DPS(version6.55)数据处理系统［12-13］。混合均匀设计因素水平见表1。1.4胰酶活力测定［14］1.4.1胰蛋白酶活力(U/g)式中:m1，每毫升酪氨酸对照品溶液中含酪氨酸的量(pg);m,取样量(g);n，供试品的稀释倍数;As,在275nm的波长处酪氨酸对照品溶液的吸光度;A,供试品溶液与酪蛋白反应后产物在275nm下的吸光度;A0，空白液在275nm下的吸光度。1.4.2胰淀粉酶活力(ku/g)式中:A,供试品消耗Na2S2O3的容量(mL);B，空白消耗Na2S2O3的容量(mL);F,Na2S2O3滴定液的浓度(mol/L)换算值;m,n，同1.4.1。1.4.3胰脂肪酶活力(ku/g)式中:A,样品消耗NaOH的容积(mL);B，空白消耗NaOH的容积(mL);M，滴定NaOH的浓度(mol/L);m,n，同1.4.1。1.5胰酶提取率计算2结果与分析2.1单因素实验数据分析2.1.1提取剂浓度对羊胰酶提取率和胰蛋白酶活力的影响用低浓度异丙醇作提取剂，考察其浓度为7.5、10、12.5、15、17.5%时异丙醇对胰酶提取效果的影响。其它工艺参数为提取pH6.5、激活时间6h、沉淀剂浓度60%、CaCl20.2%。结果见图1所示，随着异丙醇浓度的增加，胰蛋白酶活力、胰酶提取率二者同时先增加后降低，在异丙醇浓度分别为12.5、15%时，胰蛋白酶活力及提取率也分别达到最高。为了减少异丙醇的消耗，节省成本，综合考虑提取剂异丙醇浓度确定为12.5%。且低浓度异丙醇对胰脂肪酶有激活作用［15］。故在以下的单因素和混合均匀实验中，该浓度取值均采用12.5%。图1低浓度异丙醇对羊胰酶提取率和胰蛋白酶活力的影响2.1.2激活时间对羊胰酶提取率和胰蛋白酶活力的影响在提取pH值为6.5、沉淀剂浓度60%、CaCl20.2%，激活时间设置为5、7、9、11、13h时考察此因素对胰酶提取效果的影响，结果见图2。胰酶提取率随激活时间的延长而下降;胰蛋白酶活力在激活9h内，随激活时间的延长而增加，9h时达到最高。当激活时间大于9h,胰蛋白酶活力随时间增加而下降。所以选择最佳激活时间，既能使胰蛋白酶充分激活，又能避免活化后的胰蛋白酶自身降解，是把握激活时间的关键。图2激活时间对羊胰酶提取率和胰蛋白酶活力的影响2.1.3激活剂浓度对羊胰酶提取率和胰蛋白酶活力的影响在激活时间为6h，提取pH值6.5，沉淀剂浓度60%，激活剂CaCl2浓度分别设置为0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%时考察此因素对胰酶提取效果的影响。结果如图3所示，随着CaCl2浓度的增加，提取率和胰蛋。白酶活力二者同时先增加后又降低，在CaCl2为0.1%、0.15%时分别达到最高值;而当CaCl2浓度大于0.1%、0.15%时，胰酶提取率和胰蛋白酶活力两曲线则都呈下降趋势。图3CaCl2浓度对羊胰酶提取率和胰蛋白酶活力的影响2.1.4沉淀剂浓度对羊胰酶提取率和胰蛋白酶活力的影响用高浓度异丙醇做沉淀剂，考察其浓度为50%、55%、60%、65、70%时对胰酶提取效果的影响。其它因素为激活时间6h、提取pH值6.5、CaCl20.2%。结果见图4,胰蛋白酶活力随异丙醇浓度的增加而降低;相反，胰酶提取率则随异丙醇浓度的增加而升高。图4高浓度异丙醇对羊胰酶提取率和胰蛋白酶活力的影响2.1.5提取pH值对羊胰酶提取率和胰蛋白酶活力的影响在激活时间为6h、沉淀剂浓度60%、CaCl20.2%，设置提取液pH值分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5时，考察不同pH值对羊胰酶提取效果的影响。结果如图5所示，胰酶提取率随pH增加而降低;而胰蛋白酶活力则随提取pH的增加而增加。图5提取pH值对羊胰酶提取率和胰蛋白酶活力的影响2.2胰酶制备工艺参数优化2.2.1均匀设计及其回归方程的建立均匀设计试验方案及其响应值见表1。使用二次多项式回归模型为：式中邛0、印、网、网为回归系数，£为随机误差。根据偏最小二乘法(PLS)回归基本原理，利用DPS数据处理软件对本实验4自变量4个因变量进行回归建模，得到以下4个回归方程及回归结果，见表2、表3。表1均匀设计U15(152x52)方案及其响应值？表2影响因素对3种酶活力和提取率作用的标准回归系数？胰酶属于混合酶，各种酶不仅具有不同的最适pH，且动物胰腺内除胰淀粉酶、脂肪酶和核糖核酸酶为活性酶外，其余酶均以无活性酶原形式存在，须经激活后才具有水解消化蛋白质、淀粉和脂肪的能力。当蛋白酶大量激活后，会随之水解破坏同一体系内的胰淀粉酶、脂肪酶等酶类，使活力下降，且淀粉酶的降解速度比脂肪酶和蛋白酶快很多。从表2的回归系数可以看出4个影响因素对胰酶活力和提取率主效应值的影响。激活时间x1对胰蛋白酶y1活力的影响呈正效应，对胰淀粉酶y2、胰脂肪酶y3和胰酶提取率y4的影响呈负效应;沉淀剂浓度x2对3种酶活力的影响均呈负效应，因为高浓度异丙醇能引起酶活力降低，所以最好用冷至4°C以下的异丙醇沉淀，以加快沉淀速度，缩短沉淀时间，减少酶活的损失［8］。对胰酶提取率的影响则呈正效应；提取pH值x3对3种酶活力的影响均呈正效应，说明提取pH值是改善胰酶活力主要考虑的因素;但对胰酶提取率则呈负效应;CaCl2(x4)对胰酶提取率y4的影响呈负效应外，对其它指标均呈正效应，说明CaCl2是提高胰酶活力的主要添加成分，是胰蛋白酶原的有效激活剂。研究表明，Ca2+不仅可以激活胰蛋白酶原而且能抑制副反应发生，对胰蛋白酶活力起到稳定作用［3］;同时Ca2+对胰淀粉酶也有激活作用，本实验和文献［16］都已得到了证明。另外，交互项回归系数可以看出因素间交互作用对胰酶活力和提取率的影响。例如，x1x2的交互对3种酶活力和提取率的影响都呈正效应;且对胰脂肪酶活力影响也最大;对胰淀粉酶、胰蛋白酶活力影响最大的交互项回归系数则是x2x4;x1x3的交互项回归系数则对胰酶提取率的影响最大，说明它们的交互作用有利于提高胰酶活力和提取率。表3数据标准化后模型方程的误差平方和、决定系数R2及预测残差平方统计量？从表3能看出，4个方程的误差平方和、决定系数R2、预测参差平方3个统计量的变化，当潜变量个数(提取组分)为4时，每个回归方程的误差平方和、预测参差平方逐渐减小，而决定系数R2逐渐增大，分别为y1=0.9337、y2=0.8439、y3=0.9738、y4=0.9350,说明4个二次多项式回归方程模型的拟合结果良好，具有统计学意义。因而，选取方程y1、y2、y3、y4分别为胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶活力和胰酶提取率优化所用方程。2.4.2胰酶提取最优工艺条件确定设定各响应值的权重为1,通过DPS软件对回归方程进行优化得到各工艺参数的优化值为:激活时间x1=11.59h、沉淀剂x2=40.63%、提取pHx3=6.34、CaCl2x4=0.08%，将优化参数代入上述的4个回归方程中，可以得到最优目标函数值为:胰蛋白酶y1、胰淀粉酶y2、胰脂肪酶y3的活力和胰酶提取率y4各因变量的理论预测值分别为2833.08u/g、29.68ku/g、31.26ku/g和5.85%。2.5试验验证为便于指导实际生产，将优化工艺参数确定为激活时间12h、沉淀剂浓度41%、提取pH值6.34、CaCl20.08%，其他各工艺参数为:激活温度5°C、提取时间3h、沉淀温度5°C、提取剂12.5%下进行试验验证，其结果为，胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶的活力和胰酶提取率分别3062.78、30.06、32.37和6.16%，与理论预测值的相对误差分别为8.11、1.28、3.55%和5.29%。即进一步验证了数学二次多项式回归模型的适合性，PLS优化结果的合理性。国家药典[14]（2005年版），3种酶的最低酶限量指标蛋白酶600u/g、淀粉酶7000u/g、脂肪酶4000u/g）规定胰酶活力用胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶的比活力做为评价指标。经过试验验证3种酶活力比国家药典规定的活力分别提高了5.1倍、4.29倍、8.09倍。胰酶粉的感官性状为灰白色粉末，具有特殊的肉臭味和吸湿性。产品感官指标、理化指标符合国家药典规定。3结论在单因素试验基础上，运用混合均匀设计法研究激活时间、沉淀剂浓度、提取pH值和CaCl2对羊胰酶制备工艺的影响，通过偏最小二乘回归分析法对影响羊胰酶制备工艺参数进行优化组合，并建立了具有制备条件的数学模型。结果表明:羊胰酶制备工艺参数为激活时间12h、CaCl20.08%、异丙醇浓度41%、提取pH为6.34。此条件下胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶的活力和胰酶提取率分别3062.78、30.06、32.37和6.16%，与理论预测值的相对误差分别为8.11、1.28、3.55和5.29%，进一步验证了数学二次多项式回归模型的适合性，PLS优化结果的合理性。羊胰酶产品感官指标、理化指标均符合国家药典规定。参考文献杨华，刘玉花，马俪珍，等.羊骨蛋白酶解物免疫活性及酶解条件的研究[J] .中国农业科学，2008,41(10):3214-3221.[2]BerdutinaAV,NeklyudovAD,IvankinAI,etal.ComparisonofProteolyticActivitiesoftheEnzymeComplexfromMammalianpancreasandpancreatin[J],AppliedBiochemistryandMicrobiology,2000,36(4):363-367.[3]KlomklaoS,BenjakulS,VisessanguanW,etal,Purificationandcharacterizationoftrypsinfromthespleenofskipjacktuna(Katsuwonuspelamis)[J],FoodChem,2007,100:1580-1589.[4]HansSchultze.Isolationofpancreatin[P],1986US:4623624.[5]党军强，陈勇，窦科峰，等,胰腺组织总蛋白分步提取法的建立[J]