抗菌药物筛选的实验方法与技术

陈桂庭08333035 抗菌药物筛选的试验方法与技术一、试验原理药物对细菌有无抗菌作用，或抗菌范围。培育基是指利用人工方法将适合微生物生长生殖成积存代谢产物的各种养分物质混合配制而成的养分基质。主要用于微生物的分别、培育、鉴定以及菌种保藏等方面般应含有微生物生长生殖所需要的碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水等养分成分。此外，为了满有微生物生长生殖或积存代谢产物的要求，还必需把握培育基的pH。培育基是指在液体培育基中参与确定量的凝固剂(常加1.5%-2%的琼脂)经溶化冷凝而成。半固体培育这是指在液体培育基中参与0.8％-1％左右的琼脂，经溶化冷凝而成。液体培育基是指培育基中不加凝固剂琼脂，培育基呈液体状态。正确把握培育基的配制方法是从事微生物学试验工作的重要根底的制作，培育基的灭菌，斜面与平板的制作以及接菌等根本环节大致一样。微量稀释法常用于测定细菌对药物敏感性或药对细菌的抗菌活性试验。一般应用96孔微量稀释板，孔底呈U型，每孔容量为0.20-0.30ml。本法操作较便，用培育基量少，可作大批量药敏试验。二、材料与方法1，药品牛肉膏、蛋白胨、NaCl、胰蛋白胨、琼脂等。1mol/LNaOH、1mol/LHCl溶液。2，材料与仪器天平、高压蒸汽灭菌锅、生化培育箱、超净工作台、酒精灯、移液器、试管、烧杯、量筒、锥形瓶、培育皿、玻璃漏斗、药匙、称量纸、pH试纸、记号笔、棉花、纱布、线绳、塑料试管、报纸、96孔板等。3，试验方法123棉塞的制作及试管、锥形瓶的包扎；4培育基的灭菌；56无菌水的制备；78液体培育基接种法；9微量稀释法体外抗菌试验：一般常用MH培育基，将已配制药液在试管中作二倍递减浓度稀释，分装于微量稀释板孔内或用微量加液器直接在稀释板孔内作二倍稀释，然后接种稀释菌液，其中留一列孔作为药液比照，另一孔仅加培育基和菌液作为菌比照，试验3718-22h630nm侧吸光度。〔1〕试验菌的预备。选取大肠杆菌(Escherichiacoli)(Staphylicoccusaureus)、白色葡萄球菌(Staphylococcusalbus)、蜡状芽孢杆菌三种在养分琼脂斜面培育基上传代培育一次后，再将其接种至养分肉汤培育基中376-12h，冰箱备用。〔2〕抗菌化合物的初步筛选，按下表取96孔培育板一块，进展编号，将44种化合物〔由有机化学争论所其他教师和争论生供给〕用O或蒸馏水配制成〔也可用无菌过滤器过滤后〕放置在灭菌的小离心管中。在超净工作台内，酒精灯下，将液体培育的细菌菌种用培育液进展稀释，稀释度为1：500或1:100。用无菌的连续移液器〔吸咀经过灭菌处理〕200l参与到除了1l〔O配置1加，A1,B1,C1,D1200l3712h-18h,630nm侧吸光度。DMSO1%。每个样品设两个平行孔。14496孔板加样表123456789101112A200l1234567891011B200l1234567891011C200l1213141516171819202122D200l1213141516171819202122E菌比照(2lDMSO)2324252627282930313233F菌比照(2lDMSO)2324252627282930313233G菌比照(2lDMSO)343536338394041424344H菌比照(2lDMSO)3435363738394041424344筛选数据分析：试验中，以培育基为空白0%，以带菌培育液为比照100%。假设酶标仪630nm测试的结果中，空白为-0.2+0.1-0.2。假设测试样品的值也同样到达-0.2，说明样品在200mol/L具有较好的抗菌活性。假设测试样品的值在比照孔和空白之间，说明样品在高浓度有抗菌作用，可请选取11个抗菌效果较好的样品做下面的最小抑菌浓度试验。(3)EC的测试50从上述筛选的对每种细菌抑制作用最好的化合物中选出11菌种用培育液进展稀释，稀释度为1:5001:100。培育板样品的参与方法：11196孔板加样稀释表A培育液200l1，200M2 3 4 5 6 7 8 9 10 11B培育液200l1，100MC培育液200l1，50M200l菌比照(2lDMSO)1，25M1，12.5MF菌比照(2lDMSO)1，6.25MG菌比照(2lDMSO)1，3.13MH菌比照(2lDMSO)1，1.56M2l样品，200l100l加到下一行。其它各100l含菌的稀释培育液，2lDMSO。100l100l加到下一行。100l100l加到下一行。100l100l加到下一行。100l100l加到下一行。100l100l加到下一行。100l100l加到下一行。100l100l倒掉。100l含菌的稀释培育液，将培育板在3712-20h，用630nm侧吸光度。三、数据处理与争论数据处理44种化合物中选出11种化合物进展最小杀菌浓度或IC50在对大肠杆菌的抑制争论中，1号、3号、6OD值无相应规律性，无法计算最IC50。2号、4号、5号、7号、8号、9号、10号、11号化合物随浓度下降，OD值上升，为抑菌作用。图1 2号化合物对大肠杆菌抑制率-样品浓度曲线2IC

值在此试验浓度下难以估量，需要降低化合物浓度再次测定。50图2 4号化合物对大肠杆菌抑制率-样品浓度曲线由图可得4号化合物IC 值约为18.2mol/L。50图3 5号化合物对大肠杆菌抑制率-样品浓度曲线由图可得5号化合物IC 值约为10.3mol/L。50图4 7号化合物对大肠杆菌抑制率-样品浓度曲线由图可得7号化合物IC 值约为9.03mol/L。50图5 8号化合物对大肠杆菌抑制率-样品浓度曲线由图可得8号化合物IC 值约为3.98mol/L。50图6 9号化合物对大肠杆菌抑制率-样品浓度曲线由图可得9号化合物IC 值约为2.60mol/L。50图7 10号化合物对大肠杆菌抑制率-样品浓度曲线由图可得10号化合物IC50值约为2.21mol/L。图8 11号化合物对大肠杆菌抑制率-样品浓度曲线11IC4.90mol/L。50在对金黄色葡萄球菌的抑制争论中，1OD值均为负值，故需配制浓度较低的溶液进一步争论，2、3、4、6、7号化合物数据无规律性，无法分析；11号数据均为正值，样品浓度偏低，需进一步争论；5号为抑菌作用，8、9、10号化合物为杀菌作用，最3