肉制品中牛源性成分PCR检测方法的建立及其应用

肉制品中牛源性成分PCR检测方法的建立及其应用熊蕊淳B凤柳浏晓慧;赵同欣;王娜;颜红【摘要】根据牛特异性线粒体DNA片段，设计合成1对引物，以生、熟牛肉为材料,建立了肉制品中牛源性成分的PCR检测方法，并用该法对市售的67份牛肉制品进行检测.结果显示，所检牛源性成分在271bp处出现预期的条带，扩增片段经Sau3AI酶切分析确认，获得的214和57bp片段与预期一致;运用该引物均可扩增出水牛肉、耗牛肉、奶牛肉、黄牛肉单一的相同大小的DNA条带,而对羊、马、狗、驴、兔和鸭等14种动物肉的DNA扩增则呈阴性，其检测灵敏度达到53.2fg/pLDNA;利用该法对67份牛肉制品进行检测，检出率为100%.结果表明，该法快速简便，且具有较高的特异性和敏感性，可用于市售牛肉制品中牛源性成分的鉴定.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷)，期】2014(041)005【总页数】4页(P99-102)【关键词】PCR方法;检测;牛源性成分;特异性;灵敏度【作者】熊蕊;郭凤柳浏晓慧;赵同欣;王娜;颜红【作者单位】保定出入境检验检疫局，河北保定071051;保定出入境检验检疫局，河北保定071051;保定出入境检验检疫局，河北保定071051;保定出入境检验检疫局,河北保定071051;保定出入境检验检疫局，河北保定071051;保定出入境检验检疫局河北保定071051【正文语种】中文【中图分类】TS251.5伴随着中国食品工业的飞速发展，食品安全问题已成为当今社会的热点问题，尤其是肉与肉制品市场上掺杂掺假现象屡见不鲜。近期据媒体报道，许多不法企业和个人使用廉价的猪肉、鸭肉等肉类原料，冒充牛肉、羊肉生产食品进行销售，严重侵犯了消费者的合法权益（何玮玲等，2012）。然而，目前食品监管部门所采用肉类形态学的鉴别手段比较落后，掺假手段又越来越具有隐蔽性，且猪肉、牛肉和羊肉等在中国肉制品市场上的占有率较高。因此，相对于食品监管部门来说，建立一种快速有效的食品中各类源性成分的检验方法，从而对这些不法行为进行监管已非常必要。目前，质监部门主要是通过肉制品的色泽、味道、肉的纹理等对肉类来源进行判别，这些传统的鉴别方法对于市场上的假冒生肉鉴别起到了十分重要的作用（林世武等，2002），但对于那些经热加工处理的肉类，由于破坏了其中的蛋白质成分而无法对肉类的来源进行准确鉴定。因此，建立一种能快速、灵敏、特异的检测生、熟牛肉的检测方法一直是有待解决的难题。随着研究技术的发展，以PCR技术为基础的种属检测技术已是食品中肉源性成分鉴别的主流技术，该方法快捷、简便，特异性和灵敏性高。故本研究根据牛特异性线粒体DNA片段，设计合成1对引物，利用引物建立一种运用PCR技术鉴定真假牛肉的方法，并对大量市售牛肉制品进行牛源性成分检测，以期为保护广大消费者的利益和进一步落实食品质量安全市场准入制度提供技术保障，也更好地为食品监管部门提供强有力的技术支持。1.1材料1.1.1样品来源试验用牛、羊、马、狗、驴、兔、鸭等15种动物生鲜肉均为市售。熟牛肉、高压牛肉（121°C高压30min）均由河北检验检疫技术中心保定分中心加工。1.1.2主要试剂与仪器蛋白酶K、RNA酶、dNTPs、MgCl2、10xPCR缓冲液、TaqDNA聚合酶、Sau3AI限制性内切酶、DL2000DNAMarker、血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒等均购自天根生化科技(北京)有限公司；其余试剂均为分析纯。梯度PCR扩增仪、凝胶成像仪及电泳系统、台式离心机。1.2方法1.2.1引物设计与合成根据GenBank中登录的牛源性特异性DNA引物序列，利用PrimerPremier5.0软件设计合成1对特异性牛源性引物。引物用高压灭菌的超纯水溶解并配成100mol/L储备液。引物序列为：上游引物：5'-GCCATATACTCTCCTTGGTGACA-3'；下游引物：5'-GTAGGCTTGGGAATAGTACGA-3'。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。1.2.2样品DNA的提取取绞碎的牛、羊、马、狗、驴、兔、鸭等15种动物生鲜肉及熟牛肉和高压牛肉，按血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒说明书提取模板DNA。取适量模板DNA，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260和280nm处的吸光值。当A260nm/A280nm比值在1.7~1.9之间时，适宜于PCR扩增。PCR扩增PCR反应体系50pL:10xPCR缓冲液5pL,MgCl2(25mmol/L)4pL,4xdNTPs(2.5mmol/L)4pL,上、下游引物(25pmol/L)各1pL,DNA模板1pL,TaqDNA聚合酶(5U/")1",无菌超纯水33"。PCR反应程序：95°C预变性3min;95°C变性60s,56°C退火60s,72°C延伸60s,30个循环；72°C延伸5min;4C保存。PCR产物鉴定1.2.4.1电泳鉴定取扩增产物8pL，在2.0%琼脂糖凝胶中电泳，采用TAE电泳缓冲系统，9V/cm恒压电泳。电泳后，GoldView染色，于凝胶成像仪下观察电泳结果。Sau3AI酶切鉴定取PCR产物电泳，回收其中的DNA片段，进行Sau3AI酶切，于2.5%琼脂糖凝胶中电泳鉴定。PCR扩增产物测序将PCR扩增产物经凝胶回收纯化试剂盒回收纯化后送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。序列校对后，在GenBank中进行BLAST比对分析，验证所得片段是否为目的片段。1.2.6特异性试验取已制备的牛、羊、马、狗、驴、兔、鸭等15种动物肉的DNA各0.却g作为模板，加入体系中进行PCR扩增，同时设阴、阳性对照，电泳鉴定。1.2.7敏感性试验将制备的生牛肉、熟牛肉和高压牛肉的DNA模板依次做10倍递增稀释，每个稀释度各取2pL作为模板进行PCR扩增，同时设阴、阳性对照，电泳鉴定。1.2.8弓物的通用性试验取已制备的水牛肉、耗牛肉、奶牛肉、黄牛肉DNA各0.却g作为模板，加入PCR反应体系中，另设阴、阳性对照，进行PCR扩增，电泳鉴定。1.2.9市售肉制品的牛源性成分检测购置市售生牛肉30份、熟牛肉37份，提取其总DNA，用建立的PCR方法检测其牛源性成分。PCR方法的建立以生鲜牛肉、熟牛肉、高压牛肉所提取的DNA为模板进行PCR，均能扩增出大小约为271bp的目的条带（图1）,与预期片段大小一致。PCR产物的酶切鉴定结果取PCR产物电泳，回收其中的DNA片段，进行Sau3AI酶切，获得大小为214和57bp的片段（图2）,与预期结果一致。PCR扩增产物测序结果将所得片段回收、克隆、测序、校对后，在GenBank中经BLAST比对，牛源性成分DNA片段的核苷酸序列与Gen-Bank中已登记的Bostaurus基因（登录号：KF163093.1和KF163094.1）序列的同源性均大于99%，证明所得片段为目的片段（图3）。2.4特异性试验结果以建立的肉制品中牛源性成分的PCR检测方法分别对牛、羊、马、狗、驴、兔、鸭等15种动物肉的DNA进行扩增，结果发现，运用该弓物对羊、马、狗、驴、兔和鸭等14种动物肉的DNA扩增均呈阴性（图4）。2.5敏感性试验结果将制备的生鲜牛肉、熟牛肉和高压牛肉的DNA模板依次做10倍递增稀释，进行PCR扩增，结果发现，当反应体系中含牛源性成分全基因组DNA53.2fg/pL时，经30个循环的扩增，电泳后可在紫外灯下观察到明显的目的条带（图5）。2.6弓物的通用性试验结果运用该弓物对水牛肉、耗牛肉、奶牛肉、黄牛肉DNA模板进行扩增，均可得到271bp的目的条带（图6）。2.7市售肉制品的牛源性成分检测结果使用本研究建立的PCR方法对市售的67份牛肉制品中牛源性成分进行检测，结果发现，牛源性阳性数量为67份，阳性检出率为100%。Ebbeh®等（1990）研究结果表明，宰后放置1、2、9、16d肉中的DNA片段会由30000bp降解到16000bp，加热到80°C时，DNA片段长度不会受到影响，但达到100C时DNA长度会锐减至1100bp淫U120C时减至600bp以下。因此，本试验在选择扩增长度上刻意选择了271bp的短片段，即使经过了高压处理，肉中的模板DNA也不至于被破坏而出现假阴性的结果。通过对15种动物肉种属的鉴别发现，只有牛DNA可以扩增出271bp的特异性目的条带。经2.0%琼脂糖凝胶电泳，该PCR产物与Marker相比，所扩增的片段确为271bp的目的片段。产物经Sau3AI酶切，切成了214和57bp的2个小片段，经2.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定确与Marker相应片段大小一致。在Gen-Bank中经BLAST比对分析，核苷酸序列的同源性均大于99%。用建立的PCR方法检测牛源性成分的灵敏度达到53.2fg/pLDNA,其敏感度比DNA杂交检测肉种类的敏感度至少高出106倍（Chikuni等，1990）。用建立的肉制品中牛源性成分PCR检测方法对市售的67份生、熟牛肉制品进行鉴定应用，检测准确率达100%，说明这67份市售牛肉均含有牛源性成分。本试验建立的肉制品中牛源性成分PCR检测方法着重解决了肉类尤其是经热加工处理后的熟肉制品种类鉴定问题，由于所用的传统方法是依靠感官与经验的肉类形态学鉴别手段对肉制品掺假进行鉴定，已不能满足当前市场需要，所以急需一种快捷、简便、特异性和敏感度高的检测手段来对肉制品市场上掺杂掺假现象进行有效监管。本方法为市场肉类的管理、刑侦提供了快速、可靠、方便的手段(韩敏义等，2009)。使用本试验中的弓物对肉制品进行定性分析可满足市场检测的要求，同时该法也为将来对肉制品中各源性成分含量进行定量检测奠定了基础，实现检测的定量化(孙艳华等，2010)。因此，本方法填补了以往单凭感官检验的缺陷，为食品监管部门加强食品安全管理、打击肉制品市场上掺杂掺假现象提供了强有力的技术支持，更好地保护人们的健康和合法利益(巩红霞等，2006)。1巩红霞，任永宏，巩强.用多重PCR方法鉴别生羊肉的真假[J].中国畜牧兽医.2006,33(8):38-39.2孙'艳华，张智禹，牛晋阳，等.PCR法快速检测熟肉制品中肉类来源[J].食品研究与开发，2010,31(5):139-142.3何玮玲，张驰，杨静，等.食品中4种肉类成分多重PCR的快速鉴别方法[J].中国农业科学，2012,45(9):1873-1880.4林世武，李学花.羊肉和猪肉的快速鉴定方法[J].肉品卫生，2002(9):36.5韩敏义，康明丽.PCR在肉类科学中的应用[J].畜牧与饲料科学，2009,30(9):57-60.6ChikuniK,OzutsumiK,KoishikawaT,etal.Spee