水稻分子聚合育种技术规程

PAGE3水稻分子聚合育种技术规程1范围本标准规定了水稻分子聚合育种技术的术语和定义、基本要求、育种技术流程和操作步骤。本标准适用于水稻分子聚合育种技术。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19489实验室生物安全通用要求GB/T17316水稻原种生产技术操作规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1基因编辑对目的基因进行特定DNA片段的敲除、突变和插入等操作的技术。3.2CRISPR/Cas系统clusteredregularlyinterspacedpalindromicrepeats/CRISPR-associatedproteins成簇的规律间隔的短回文重复序列/成簇的规律间隔的短回文重复序列关联蛋白系统，广泛存在于细菌及古生菌中，是机体长期进化形成的RNA指导的降解入侵病毒或噬菌体DNA的适应性免疫统。3.3sgRNAsingleguideRNA向导RNA，能够引导Cas9蛋白在目的基因处定向切割并形成双链断裂。3.4PAMprotospaceradjacentmotif原型间隔序列毗邻基序。参与CRISPR/Cas系统与靶位点的识别，PAM的序列特征一般为NGG。4基本要求4.1设施和设备实验室设施、设备和试验场所符合GB/T19489相应的生物安全等级要求。4.2操作人员操作人员应通过必要的实验技术和生物安全管理规范的培训。4.3试验记录应包括但不限于试验开始和结束的时间，试验材料名称、来源、编号、保存信息，目的基因序列信息，载体结构，表型鉴定，转化后代的检测结果等。4.4其他水稻基因编辑育种的过程应符合相应法律法规的规定。5育种技术流程技术流程见图1：图1育种技术流程图6操作步骤6.1目标基因靶位点设计比对全基因组序列，根据目标性状基因的来源和载体启动子的种类选择适合的软件设计基因上的靶位点。注：PAM位点前20bp左右为sgRNA靶序列引Cas9蛋白作用于基因组。在全基因组范围内比对序列同源性，避开SNP突变位点和保守性较差的区域，选择17bp~20bp匹配数量少的靶点以降低sgRNA脱靶效应。6.2打靶载体的构建对基因成熟蛋白编码区进行靶位点预测，设计相应引物。根据基因编辑的方式和对象选择适宜的载体，经酶切线性化、T4连接酶进行连接、转化大肠杆菌感受态细胞和测序鉴定，构建CRISPR/Cas9表达载体。6.3遗传转化正确连接的重组载体转化至农杆菌，利用农杆菌介导的方法转化受体水稻的愈伤组织，潮霉素筛选获得再生的水稻植株。6.4突变体的筛选和鉴定6.4.1筛选鉴定引物的设计根据潮霉素抗性基因、载体特异序列、目的基因序列和靶点位置，利用专业软件设计检测引物。6.4.2转化植株的鉴定提取转化T0代水稻的基因组DNA，利用潮霉素抗性基因和载体特征引物对转化后代进行PCR扩增，均能扩增出目的条带的为转化阳性植株。6.4.3靶位点突变分析对转化阳性植株的基因靶位点区域进行测序，验证靶位点的突变类型，根据靶位点特性对脱靶效应和移码突变进行预测和分析。选择靶位点突变类型导致基因阅读框移码的突变株（T0）进行收获并继续种植。6.4.4无选择标记突变体的鉴定T1代植株中潮霉素抗性基因和载体特征引物均无扩增条带，靶位点测序为纯合突变的单株为无选择标记基因纯合突变株，收获并建立株系。6.4.5突变体表型分析对T2代纯合株系进行靶位点表型测定和主要农艺性状调查，田间记载项目参考GB/T17316执行，