荧光蛋白表达课件

荧光蛋白表达课件第一页，共六十页，编辑于2023年，星期二第二页，共六十页，编辑于2023年，星期二0103020405背景介绍实验流程实验设计实验结果参考文献目录第三页，共六十页，编辑于2023年，星期二背景介绍第四页，共六十页，编辑于2023年，星期二绿色荧光蛋白GFP第五页，共六十页，编辑于2023年，星期二第六页，共六十页，编辑于2023年，星期二增强型GFP（EGFP）

野生型GFP折叠易受温度影响，发光较弱，并且在某些细胞中不表达，因此人们运用定点突变等技术对野生型GFP进行了改造。目前应用较为广泛的是增强型GFP（EGFP），它是将Ser65用Thr替代，Phe64用Leu替代，使GFP的荧光强度提高了35倍，而且激发后16~24h后仍可稳定地检测到荧光。第七页，共六十页，编辑于2023年，星期二GFP的荧光性质及应用优点(1)易于检测，灵敏度高。(2)荧光性质稳定。(3)对细胞无毒害。(4)构建载体方便。(5)可直接用于活细胞测定。(6)不受假阳性干扰。(7)广谱性。(8)易于得到突变体。第八页，共六十页，编辑于2023年，星期二第九页，共六十页，编辑于2023年，星期二EGFP氨基酸序列由Prasher等成功克隆出了GFP基因的cDNA，并分析了GFP的一级结构。氨基酸序列：MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK。第十页，共六十页，编辑于2023年，星期二绿色荧光蛋白(GFP)的发现极大地推动了现代生物学的发展，应用前景广阔。GFP及其突变体已被广泛应用于基因表达调控、蛋白质空间定位、生物分子之间相互作用、转基因动物等方面。基于新型功能荧光蛋白(如光激活荧光蛋白和光转换荧光蛋白和氧化还原敏感的GFP等)的光学分子成像技术的发展，为在活细胞乃至活体动物内研究基因表达和蛋白质功能提供了更多的选择空间。第十一页，共六十页，编辑于2023年，星期二GFP用途1、作为转基因植物和动物的筛选标记2、GFP在分子生物学研究中的应用2.1在生物学研究中的应用2.2在生态学上的应用2.3在医学研究中的应用第十二页，共六十页，编辑于2023年，星期二1、作为转基因植物和动物的筛选标记分子标记：作为一种新型的报告基因，GFP已在生物学的许多研究领域得到应用。利用绿色荧光蛋白独特的发光机制，可将GFP作为蛋白质标签(proteintagging)，即利用DNA重组术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染合适的细胞进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察。第十三页，共六十页，编辑于2023年，星期二GFP的相对分子质量小，能与多种不同的蛋白质N端或C端融合而保持其天然蛋白质的特性，可特异地进行蛋白质及细胞器的地位研究。大量实验表明，GFP可定位到细胞核、细胞骨架、叶绿体、线粒体等细胞器中。另外、将GFP作为活细胞内蛋白质的标记分子，利用荧光共振能量转移显微技术可以研究细胞内的蛋白质之间的相互作用。第十四页，共六十页，编辑于2023年，星期二2.1在生物学研究中的应用GFP可以作为标记分子，目前已被广泛应用于基因标记、蛋白质标记、环境微生物研究、寄生虫学研究以及发育生物学研究中基因表达模式的探索等方面，成为活细胞分子水平研究的工具。目前生物农药的杀虫效果往往得不到准确评估，而利用GFP标记，通过荧光观察可以避免评估杀虫剂杀虫效果时仅仅记录有典型感染症状的害虫个体，而忽视无明显感染症状但确实已经感染或正在感染的害虫个体，同时无需进行分子生物学鉴定即可方便地区分杀虫剂致死和天然病原致死，从而客观准确地评价杀虫剂的毒力。第十五页，共六十页，编辑于2023年，星期二2.2在生态学上的应用GFP在生态学中的应用将GFP基因直接导入目标生物或将GFP基因克隆到病毒、细菌或质粒上，通过它们的介导而间接标记目标生物，进行生态学规律研究。用GFP基因标记遗传工程微生物以监测其在水环境中的存活和去向。朱应等构建了带GFP基因的重组棉铃虫病毒。该病毒一次感染棉铃虫后不再重复感染，室内饲养3代，各代均可见典型的发绿色荧光的棉铃虫，表明病毒可以介导GFP标记其宿主，预计将为研究棉铃虫的迁飞和暴发规律提供强有力的手段。跟踪观察微生物。传统方法中，一般用荧光染料标记微生物，由于微生物的分裂，燃料被稀释，因此长期以来未能观察到微生物侵入活细胞的实时动态过程。GFP基因能克服上述的缺点，且在活细胞中能直接观察到无需破坏原有细胞而阻止感染的继续进行。第十六页，共六十页，编辑于2023年，星期二2.3在医学研究中的应用在组织工程的种子细胞研究中，有学者利用GFP示踪证实了脂肪来源的干细胞的分化方向和分化能力；利用增强型GFP筛选合适的生物材料，如发现最合适的构建气管软骨的细胞来源是肋软骨细胞。GFP还用于细胞因子作用的研究，如发现血小板衍生生长因子的持续表达可以延缓成牙骨质细胞的钙化过程；以及活体动态观察的研究，为脊柱和椎间盘等部位的细胞治疗或基因治疗后的随访建立了新研究方法。在药学研究中，用GFP对目的物进行标记，分析目的物在细胞中的变化情况，如酶分子分布状态、生物活性、受体、离子通道等变化，从而从众多的化合物中筛选出与体内信号分子功能相似“潜力”化合物，这样的方法简便易行。因此，GFP成为了药物筛选及药物作用机制研究中的有力工具。第十七页，共六十页，编辑于2023年，星期二在眼科中，许多视网膜疾病如视网膜色素变性、年龄相关性黄斑变性、增生性玻璃体视网膜病变、糖尿病视网膜病变等由于遗传缺陷或基因表达异常等导致视网膜神经细胞某些蛋白质结构异常、代谢紊乱或促进与抑制新生血管形成因子表达，从而严重危害视力。GFP也广泛应用于视网膜的基因转移系统、目的基因的调控及感光细胞凋亡保护的研究。在免疫学治疗方面，应用GFP作为表皮生长因子受体研究的工具，并对第二信使蛋白进行亚细胞定位，这不仅可以揭示其在活细胞内作用，还可以观察一些抗体和小分子酪氨酸激酶抑制剂等信号传导抑制药物的作用效应。第十八页，共六十页，编辑于2023年，星期二红色荧光蛋白RFP第十九页，共六十页，编辑于2023年，星期二红色荧光蛋白的来源

1999年,Matz等从印度洋2太平洋地区的珊瑚虫中分离出6种与绿色荧光蛋白(greenfluorescentproteins,GFP)同源的荧光蛋白,并鉴定了它们的光谱性质。其中来源于Discosomasp.红色荧光蛋白(drFP583)在紫外线的照射下可发射红色荧光,其最大吸收波长为558nm,最大发射波长为583nm。其发射波长较长,灵敏度与信噪比均比GFP高,为基于GFP的体内研究提供了一个很好的互补工具。第二十页，共六十页，编辑于2023年，星期二红色荧光蛋白的演变drFP583具有自身的缺点,如寡聚化、成熟过程缓慢和对细胞有毒性等限制了它的应用。因此,人们对其进行各种修饰和改进,以得到不同发光特性、不同聚集状态及适于不同细胞的突变体。最先进行突变实验的是drFP583,而Clontech公司已将它的一个低毒、低寡聚化及成熟快的突变体E572NA商业化,商品名为DsRed。第二代DsRed，即大家所熟知的DsRed2，它的多肽氨基末端已经进行了一些突变改造，这样就可以使组织蛋白凝

集和降低毒性。

在第三代DsRed的突变体中，成熟时间

更短，荧光强度也增强。第二十一页，共六十页，编辑于2023年，星期二第二十二页，共六十页，编辑于2023年，星期二红色荧光蛋白序列第二十三页，共六十页，编辑于2023年，星期二红色荧光蛋白的应用

红色荧光蛋白极大的丰富了细胞内或体内光学成像的荧光探针，使其能够与生物体内多种物质联合，实现对生物体内生命物质活动的监视，红色荧光蛋白在继绿色荧光蛋白后，在某种定义下可以说是革新了生物学研究——运用红色荧光蛋白可以检测到细胞的活动，可以标记表达蛋白，可以进行深入的蛋白质组学实验等。特别是在癌症的研究过程中，由于红色荧光蛋白的出现使得科学家们能够观测到肿瘤细胞的具体活动，比如肿瘤细胞的成长、入侵、转移和新生等，应用前景广泛。第二十四页，共六十页，编辑于2023年，星期二红色荧光蛋白的应用

在活细胞及动物全身成像中需要表现较好的红色荧光蛋白，主要是由于在多种颜色成像实验中需要红色探针，另外基于较长的激发波长产生的光毒性较小，可以用来探测较深的生物组织。第二十五页，共六十页，编辑于2023年，星期二黄色荧光蛋白YFP第二十六页，共六十页，编辑于2023年，星期二

黄色荧光蛋白（YellowFluorescentProtein，YFP）可以看做GFP一种突变体，最初来源于维多利亚多管水母（Aequoreavictoria）。相对于绿色荧光蛋白，其荧光向红色光谱偏移，而这主要是由于蛋白203位苏氨酸变为酪氨酸。其最大激发波长为514nm，最大发射波长为527nm。第二十七页，共六十页，编辑于2023年，星期二第二十八页，共六十页，编辑于2023年，星期二YFP序列1atgaagttcgttgtacgggccctgaccgcgaccgccgtggcggcggcggtcgccgccctc61gccggatgctcggcgacctcgccggcccccggctccgccgagggctcctcagcggggacg121aagctcgtcgtctacacgccgcagggcgaccccgtgcgcgggggctacatcaccaagcac181gccaaatcggacctcggcctggacgtaaagctggtcaacggggcgggcggagatctcgcc241acccgcctcatcgccgagaagaacaacccgcaggcggacgtcgtcgtcgtcctcggggca301ccgcagctcaaccggatcgaccaggcgggtgtgctccagcctttcgctccagactgggcc361ggcaagatcccgtccgccttcgcgtccggaagcaaggacttcacactgctgacgcagacc421ccgatcgcgatcgcctacaacgcgtccacgatgacggcggcccaggcgccgagcagttgg481acggacctggccaagccggagtacaaggacaagttcgccttcccggccctcaccagccag541acgggccaggcggcagccgtgggaatcctgtggcgctacgccgatcacacgaccggcacg601gtgtcgcagaaaggctgggacacgctcgccgcgatcctccacaacgccaagcagaccgcc661gccggcgcgccgttcgactgggcacaggtgaggtccggcgttcagccgatcgtggtgagc721tggctgggcggcattcaaaccggcacctccgacaacaccatcgacctcaggatcgtcgac781gccgtcggcgggagcccgttcgtcaacggcggcgtcggcatggtcaaggacacgaagaac841gcagccgcggcccgcaagttcatcgactggttcggctccgacagcttccaggtcgggttc901gtcaccgcgacgaagaacgatacccccctcaacccggatgcggtcaagcggctccccggg961gccgagcagggactgcgccaggtcaccccgcagaagatcgactggggcgtggtgtcccag1021cgcctctcggactggttgcagaagatccagctcgatgtgcagggctga第二十九页，共六十页，编辑于2023年，星期二

像绿色荧光蛋白一样，YFP是细胞生物学和分子生物学中一种非常常用的报告基因。目前，有三种改良的黄色荧光蛋白：Citrine,Venus,andYpet。这三种改良的蛋白荧光更亮，更稳定，而且成熟更快，因此应用广泛。黄色荧光蛋白最常用于荧光共振能量转移，作为荧光能量的接受体（acceptor）。第三十页，共六十页，编辑于2023年，星期二2.所用质粒介绍PUC19质粒

大肠杆菌克隆用质粒pUC19,简称pUC19，是质粒载体的一种。在由限制性核酸内切酶修饰过的质粒DNA序列中插入外源的目的基因，以质粒为载体，将目的基因通过转化或转导的方法导进宿主细胞，pUC19常用于DNA片段克隆、DNA测序、外源基因表达等。

pUC19大小只有2686bp，是最常用的质粒载体，其结构组成紧凑，几乎不含多余的DNA片段，GenBank注册号为L08752(pUC18)和X02514(pUC19)。由pBR322改造而来，其中lacZ(MSC)来自M13mp18/19图3-4是其质粒图谱。pUC系列载体含有一段lacZ蛋白氨基末端的部分编码序列，在特定的受体细胞中可表现α-互补作用。因此在多克隆位点中插入了外源片段后，可通过α-互补作用形成的蓝色和白色菌落筛选重组质粒。

第三十一页，共六十页，编辑于2023年，星期二第三十二页，共六十页，编辑于2023年，星期二pET-28a载体

pET-28a-c(+)载体带有一个N端的His/Thrombin/T7蛋白标签，同时含有一个可以选择的C端His标签。pET28a载体的单一的多克隆位点见上面的环状质粒图谱。注意：载体序列是以pBR322质粒的编码规矩进行编码的，所以T7蛋白表达区在质粒图谱上面是反向的。

T7RNA聚合酶启动的克隆和表达区域在质粒图谱中也被标注了出来。质粒的F1复制子是被定向的，所以在T7噬菌体聚合酶的作用下，包含有蛋白编码序列的病毒粒子能够产生，并启动蛋白表达，同时蛋白表达将被T7终止子序列(Cat.No.69337-3)的作用下终止蛋白翻译。第三十三页，共六十页，编辑于2023年，星期二第三十四页，共六十页，编辑于2023年，星期二两种菌株差异

克隆宿主：E.coliDH5α缺少目的基因表达相关的酶，

不能够表达出目的基因，转入的载体在其中大量复制；表达宿主：E.coliBL21（DE3）则可以表达出目的基因，即得到绿色、黄色、红色的荧光蛋白。第三十五页，共六十页，编辑于2023年，星期二两种载体差异克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。表达载体：就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。克隆载体目的在于复制足够多的目标质粒，所以常带有较强的自我复制元件，如复制起始位点等，往往在菌体内存在多拷贝，所以抽质粒会抽出一大堆，但不具备表达元件。而表达质粒有复杂的构成，为的是控制目标蛋白的表达，如各种启动子（T7），调节子（LacZ）等，而且以pET为代表的表达载体在菌体内都是低拷贝的，防止渗漏表达。

是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。第三十六页，共六十页，编辑于2023年，星期二3.大肠杆菌表达载体及表达系统

大肠杆菌表达系统是基因工程中常用的工具。虽然它不能像真核系统一样进行翻译后加工，但由于其遗传背景相对比较清楚，使用安全、操作简便、周期短、经济，因此仍然是使用最广泛的、也是不可被替代的系统。表达系统的核心是表达载体。用来在大肠杆菌中表达外源基因的载体有很多种。构建有效的表达载体是表达目的基因的基本要求，同时也是影响基因表达水平以及蛋白活性的总要因素。标准的大肠杆菌表达载体的主要组成包括：启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始区、多克隆位点、终止子、复制起点以及抗性筛选因子等。第三十七页，共六十页，编辑于2023年，星期二3.大肠杆菌表达载体及表达系统一般来说,这些载体应满足以下要求:重组质粒拷贝数高，表达量高适用范围广表达产物容易纯化在菌体内稳定性好目前已知的应用较广的大肠杆菌表达载体有非融合表达载体、融合表达载体、分泌型表达载体和表面呈现表达载体等。第三十八页，共六十页，编辑于2023年，星期二

pET表达系统简介pET系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统,它是最初由Studier等利用与启动子配套能高效转录特定基因的外源RNA聚合酶构建的T7RNA聚合酶/启动子系统,可以从各种基因(包括原核、真核细胞)生产大量的目的蛋白,pET表达系统的优势主要表现在以下几个方面:

※优化靶蛋白表达:pET系统以其独特的优势和载体、宿主之间重组的“协调”而优化特异靶蛋白表达。

※严格控制基础表达水平:

pET表达系统能严格控制诱导剂缺失时的基础表达水平,许多难用其他E1coli表达系统表达的基因可在pET系统中高效稳定地克隆和表达。

※宿主菌的最佳背景:pET系统有11种不同DE3溶原化宿主菌,其中使用最广泛的为BL21及其衍生菌株,它的优点在于缺失lon和ompT蛋白酶。

第三十九页，共六十页，编辑于2023年，星期二4.SDS原理及蛋白分离与检测

采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS，polyacrylamidegelelectrophoresis）方法可对蛋白质的组分进行分离，并可精确测得蛋白质的分子量。常用的方法为SDS不连续系统。第四十页，共六十页，编辑于2023年，星期二

SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。第四十一页，共六十页，编辑于2023年，星期二

SDS首次由Shapiro等提出后,已成为广泛应用于蛋白质分离的一种方法。由于SDS是一种阴离子去污剂,在还原剂(β-巯基乙醇或二硫苏糖醇,DTT)存在下,能破坏蛋白质亚基之间的非共价键,使其解离成单个的亚基,能按照一定比例与蛋白质分子结合成带负电荷的复合物,其负电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷,也就消除或降低不同蛋白质之间原有的电荷差别,这样就使电泳迁移率只取决于相对分子量大小这一因素。由于SDS仪器简单、操作方便、重复性好、可靠性强,除了测定蛋白质分子量外,还可以作为一种分离、纯化的工具,此方法对于其他方法难溶的复合酶、病毒、及膜蛋白都可通过其解离作用而进行分析,而且对于某些变性蛋白质也能很方便直观的分离出来。第四十二页，共六十页，编辑于2023年，星期二实验设计第四十三页，共六十页，编辑于2023年，星期二6.重组蛋白的SDS检测1.获得目的基因5.EGFP基因的原核表达及检测3.质粒转化克隆宿主E.coliDH5α2.将目的基因插入到载体pET-28a(+)上4.质粒转化表达宿主E.coliBL21第四十四页，共六十页，编辑于2023年，星期二详细实验流程第四十五页，共六十页，编辑于2023年，星期二一、实验试剂上、下游引物,ddH2O,10XBuffer,dNTP,质粒pEGFP-N3&pET-28a(+),TaqDNA聚合酶,限制性核酸内切酶HindⅢ&EcoRⅠ,T4DNA连接酶,CaCl2溶液,胶回收试剂盒(BindingBuffer,洗脱缓冲液,SPWWashbuffer),质粒小提试剂盒(含有RnaseA的溶液I,溶液II,溶液III,HBbuffer,DNAwashingbuffer,elutionbuffer),LB培养基(LP0042TRYRTONE1%,LP0021YEASTEXTRACT0.5%,NaCl1%),麦康凯培养基(蛋白胨17g,脙胨3g,猪胆盐5g,NaCl5g,琼脂17g,ddH2O1000mL,乳糖10g,0.01%结晶紫水溶液10mL,0.5%中性红水溶液5mL),卡那霉素,TAE,EB溶液;30%丙烯酰胺(Acr);10%SDS;1.5mol/LTris-HCl缓冲液(pH8.9);1.0mol/LTris-HCl缓冲液(pH6.8);0.05mol/LTris-HCl缓冲液(pH8.0);TEMED;样品溶解液;固定液;染色液;脱色液。第四十六页，共六十页，编辑于2023年，星期二二、实验仪器PCR仪、1.5ml离心管、PCR管、移液枪、酒精灯、枪尖、Ep管、培养皿、牙签、试管、恒温振荡培养箱、离心机、旋涡振荡器、微波炉、电泳仪、制胶槽、电泳槽、梳子、锥形瓶、电子天平、手套、接种环、玻璃板、制胶板、模具、电吹风、SDS电泳仪第四十七页，共六十页，编辑于2023年，星期二1.获得目的基因第四十八页，共六十页，编辑于2023年，星期二第四十九页，共六十页，编辑于2023年，星期二2.将目的基因插入到载体pET-28a(+)上第五十页，共六十页，编辑于2023年，星期二3.质粒转化克隆宿主E.coliDH5α第五十一页，共六十页，编辑于2023年，星期二4.质粒转化表达宿主E.coliBL21第五十二页，共六十页，编辑于2023年，星期二5.EGFP基因的原核表达及检测第五十三页，共六十页，编辑于2023年，星期二6.重组蛋白的SDS检测第五十四页，共六十页，编辑于2023年，星期二预期实验结果第五十五页，共六十页，编辑于2023年，星期二pET-28a：5369bp左右EGFP：6.1kb左右ERFP：6kb左右EYFP：6.5kb1.目的基因和pET-28a质粒双酶切电泳结果：第五十六页，共六十页，编辑于2023年，星期二SDS：样品在26KD存在条带，对照1和对照2没有；自然光下菌落呈绿色可说明pET28a-EGFP能够在原核系统中得到高效表达,并且表达效果较好。2.荧光蛋白诱导表达与检测：第五十七页，共六十页，编辑于2023年，星期二参考文献第五十八页，共六十页，编辑于2023年，星期二[1]ShimomuraO,JohnsonFH,SaigaY.Extraction,purificationandpropertiesofaequorin,abioluminescentproteinfromtheluminoushydromedusan,Aequorea[J].J.Cell.Comp.Physiol.,1962,59(3):223239.[2]吴沛桥,巴晓革,胡海,等.绿色荧光蛋白GFP的研究进展及应用[J].生物医学工程研究,