蛋白组学二维电泳

蛋白组学二维电泳第一页，共二十五页，编辑于2023年，星期二第二章二维电泳与蛋白质分离一、蛋白质的提取与样品制备二、二维等电聚焦-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳维等电聚焦电泳三、胶上蛋白质检测技术第二页，共二十五页，编辑于2023年，星期二蛋白质染色方法胶内：考马斯亮蓝R-250(CBBR-250)、CBBG-250、银染、负染、荧光染料染色以及放射性同位素标记等转移到膜（PVDF、硝酸纤维素膜）上：酰胺黑(AmidoBlack)、丽春红S(PonceauS)第三页，共二十五页，编辑于2023年，星期二（一）考染（考马氏亮蓝染色）1、考马氏亮蓝与蛋白质反应机理

考马氏亮蓝（Coomassiebrilliantblue）是一类三苯基甲烷衍生物。分为R-250（红兰色）、R-350（红兰色）、G-250（蓝绿色），它们与蛋白质结合生成深蓝色复合物，在464-595nm有吸收峰（595nm最大），且在比较宽的范围内（15-20μg

）扫描峰的面积与蛋白质量成线性关系，因此可在595nm对蛋白质进行定量检测，而且在一定pH条件下，这种染料-蛋白质复合物被完全解聚。

2、考染机理

胶体内染料和溶液中自由扩散染料间形成平衡后，溶液中少量自由染料穿透凝胶基质，有选择性地对蛋白质进行染色，而胶体态的染料排阻在胶外，阻止了背景的生成。胶内蛋白质染色的关键是让蛋白质染色，而胶体不染色。第四页，共二十五页，编辑于2023年，星期二CoommassieBrilliantBlueG-250第五页，共二十五页，编辑于2023年，星期二3、考染程序考染程序至少600多种，主要变换是将以下程序中的醋酸换成三氯乙酸、磷酸或高氯酸，但三氯乙酸易使谷氨酸羧基侧链不可逆酯化，造成肽谱数据复杂化。

（1）固定：凝胶浸泡于50%乙醇+10%冰醋酸水溶液中，至少1h，可过夜。

（2）染色：凝胶浸泡于染色液中至少2h。染色液组成：45%甲醇+10%冰醋酸+0.25%考马氏亮蓝G-250，混均过滤。

（3）脱色：多次更换脱色液，直至背景脱净，稍稍提高温度可加快脱色。脱色液组成：25%乙醇+8%冰醋酸。

（4）保存：凝胶脱色后水洗扫描备份，用保鲜膜包裹，一个月内进行质谱鉴定；长时间保存需将蛋白点切下，进一步脱色后贮于-80℃。第六页，共二十五页，编辑于2023年，星期二4、考染特点

（1）可以获得无背景或低背景的图谱；

（2）染色过程需24-48h，所需时间较长；

（3）灵敏度不高，为100-10ng，只能检测10-100ng的蛋白质，低丰度的蛋白质难以显色。第七页，共二十五页，编辑于2023年，星期二（二）银染1、原理：碱性银氨（Ag(NH3)2+）染色法和酸性硝酸银（AgNO3）染色法。

酸性硝酸银染色法的原理是一个照相的过程，凝胶在酸性环境下与硝酸银温育，银离子附与蛋白质表面，然后在碱性环境下里用福尔马林还原成金属银。

碱性银氨染色法的原理是用氨水来形成银氨复合物，银氨复合物与胶内SDS-蛋白质复合物结合，然后在酸性条件下用福尔马林将银氨还原成金属银。第八页，共二十五页，编辑于2023年，星期二2、特点（1）酸性银染染色背景浅、容易控制，对酸性蛋白质的染色灵敏度稍高，碱性银染灵敏度稍高，但背景深、不容易控制。

（2）相对于考染，灵敏度高，可达200pg。

（3）但由于存在戊二醛的特异性反应，对下一步的酶切肽谱提取存在困难；增敏过程蛋白质被部分提取至胶外。第九页，共二十五页，编辑于2023年，星期二3、程序1.分析型银染（不能用于质谱鉴定）

(1)水洗胶5min；

(2)40%乙醇，10%乙酸固定1hr；

(3)5%乙醇，5%乙酸固定过夜；

(4)水洗20min两遍；

(5)5%戊二醛

1hr；

(6)水洗30min四遍；

(7)250mL新鲜配制的银氨液(1mLNaOH与5mL饱和氨水混合再加10mL20%AgNO3)/胶45min；

(8)水洗3min三遍；

(9)1.5mL1%柠檬酸、125μL37%甲醛/胶显色；

(10)5%乙酸停显10min；

(11)水洗10min三遍。第十页，共二十五页，编辑于2023年，星期二2.快速银染（和质谱鉴定相匹配）第十一页，共二十五页，编辑于2023年，星期二（三）负染1、特点

（1）负染能提高SDS胶上蛋白质的回收率，常用有铜染、锌-咪唑染等。负染色结果在凝胶表面产生半透明背景，而凝胶显示黑色背景或相应底色，蛋白质以透明形式被检测出来，而且蛋白质被很好地保存下来。

（2）显色过程仅需5-15min

（3）蛋白质易从胶上取出，一般用EDTA络合金属离子就可转移出蛋白质。

（4）灵敏度15ng

2、原理（锌-咪唑染料）

咪唑存在时，自由或弱结合的锌离子以锌-咪唑形式沉淀下来，而大部分锌离子因与蛋白质结合牢固而留在胶上，从而导致半透明背景上的空白区域，这就是负染过程。第十二页，共二十五页，编辑于2023年，星期二人肝癌细胞系MHCC97的部分双向凝胶电泳锌染图谱第十三页，共二十五页，编辑于2023年，星期二锌染程序(1)水洗1min；(2)0.2mol/L咪唑、0.1%SDS溶液10min；(3)0.2mol/L氯化锌1min；(4)水洗5sec三遍；第十四页，共二十五页，编辑于2023年，星期二（四）荧光染色（Cy3和Cy5）1、原理：利用荧光染料对蛋白质进行标记，在光激发下产生荧光，通过扫描得到图象。比如用甲基Cy3与甲基Cy5两种染料分别对两个不同蛋白样品进行荧光标记，并在一块2-DE胶上进行运行，由于两种染料激发波长不同，扫描时可得到两张有差异的图象，因此可用于差异蛋白质组学研究。

2、特点

（1）灵敏度250pg与银染相近，但线性范围高于银染。

（2）蛋白质被荧光共价修饰，改变了移动性能，降低了溶解性，导致质谱鉴定出现偏差。

（3）不同样品由于所含蛋白质可被荧光修饰的功能基团数不一样，灵敏度变化不一样。第十五页，共二十五页，编辑于2023年，星期二二维电泳荧光检测RedCy3GreenCy5第十六页，共二十五页，编辑于2023年，星期二（五）SYPRORuby荧光染色基于钌的金属螯合染料检测灵敏度0.5－1ng染色速度快，15min可完成线性动态范围广需要紫外或激光检测系统和质谱检测兼容第十七页，共二十五页，编辑于2023年，星期二总结染色方法灵敏度线性范围与质谱兼容性费用硬件要求考染10ng3++++银染200pg7+++负染15ng3++++荧光标记250pg104

+++++++++++第十八页，共二十五页，编辑于2023年，星期二二维电泳的图象分析第十九页，共二十五页，编辑于2023年，星期二图象分析对双向电泳图谱上的这些蛋白质点进行检测、定量、比较、分析和归类主要包括：图象采集图象分析：蛋白质点检测、背景消除、蛋白点匹配、归一化处理、数据输出数据库的建立第二十页，共二十五页，编辑于2023年，星期二图象采集（imagecollection）透射扫描方式光密度扫描：考染、银染、负染激光诱导荧光扫描：荧光染色第二十一页，共二十五页，编辑于2023年，星期二蛋白点检测（spotdetection）蛋白点定位、点形状、点丰度参数设定：最模糊的点、最小的点、最大的点和胶的背景第二十二页，共二十五页，编辑于2023年，星期二背景消减（backgroundsubtraction）凝胶染色（银染和考染）很难保证没有背景需要将背景去除，才能得到真正的蛋白质点的丰度人工消除边界最低强度消减（沿检测点边界，取强度最低的点为背景）边界平均象素值消减（取被检测点边界的平均强度为背景）非点模式第二十三页，共二十五页，编辑于2023年，星期二归一化处理（normal