蛋白酶与溶解酶

蛋白酶与溶解酶第一页，共七十二页，编辑于2023年，星期一蛋白酶水解示意图：第二页，共七十二页，编辑于2023年，星期一1.1蛋白质的特异性要求

1、R1和R2基团的性质：胰凝乳蛋白酶仅能水解R1是酪氨酸、苯丙氨酸或色氨酸残基的侧链的肽键；胰蛋白酶仅能水解R1是精氨酸或赖氨酸残基的侧链的肽键。胃蛋白酶和羧肽酶对R2基团具有特异性要求，如R2是苯丙氨酸残基的侧链，那么这两种酶能以最高速度水解肽键。第三页，共七十二页，编辑于2023年，星期一第四页，共七十二页，编辑于2023年，星期一第五页，共七十二页，编辑于2023年，星期一第六页，共七十二页，编辑于2023年，星期一5、对肽键的要求：大多数蛋白酶不仅限于水解肽键，尚能作用于酰胺（-NH2）、酯（-COOR）、硫羟酸酯（-COSR）和异羟污酸（-CONHOH）

第七页，共七十二页，编辑于2023年，星期一胃蛋白酶和其它一些酸性蛋白酶对水解键有较高识别能力。如肽键→脂键，即使R2满足要求也不能作为底物。第八页，共七十二页，编辑于2023年，星期一5.1.2蛋白酶分类：1、来源：（1）植物：菠萝、木瓜、无花果（2）动物：胃、胰蛋白酶、凝乳酶（胃）（3）微生物：1398枯草杆菌、3942栖土曲霉蛋白酶、放线菌蛋白酶第九页，共七十二页，编辑于2023年，星期一2、最适作用条件：（1）中性蛋白酶：pH6~81398枯草杆菌、3942栖土曲霉蛋白酶（2）碱性蛋白酶：pH9~112709枯草杆菌蛋白酶（3）酸性蛋白酶：pH1~3胃蛋白酶第十页，共七十二页，编辑于2023年，星期一3、对底物作用方式：（1）内肽酶：产物为脲、胨、多肽、低肽（2）外肽酶：羧肽酶：从以羧基末端氨肽酶：从氨基末端第十一页，共七十二页，编辑于2023年，星期一4、根据酶活性部位：（1）丝氨酸蛋白酶（2）巯基蛋白酶（木瓜蛋白酶）（3）金属蛋白酶（4）酸性蛋白酶（凝乳蛋白酶）第十二页，共七十二页，编辑于2023年，星期一1.3木瓜蛋白酶：其酶活性部位中含有巯基，属巯基蛋白酶。木瓜蛋白酶存在于木瓜汁液中，分子量23900，至少有3个氨基酸残基存在于酶的活性部位，它们是Cys25（半胱）、His159（组）和Asp158（天冬）。第十三页，共七十二页，编辑于2023年，星期一当Cys25被氧化剂氧化或与重金属离子结合时，酶活力被抑制，而还原剂半胱氨酸（或亚硫酸盐）或EDTA能恢复酶的活力。还原剂作用：从-S-S——-SH，EDTA螯合重金属离子。第十四页，共七十二页，编辑于2023年，星期一木瓜蛋白酶在pH5时，有良好稳定性，如pH<3或>11时酶很快失活，最适pH随底物改变。第十五页，共七十二页，编辑于2023年，星期一木瓜蛋白酶具有较高的耐热性，酶液在pH7和70度下加热30分钟，而使牛乳凝结的活力仅下降20%。木瓜蛋白酶对酯和酰胺类底物表现出很高的活力。第十六页，共七十二页，编辑于2023年，星期一1.4酸性蛋白酶：（重点介绍凝乳蛋白酶）酸性蛋白酶是指蛋白酶具有较低的最适pH，而不是指酸性基团存在于酶的活性部位。酶的活性部位含有一个或更多的羧基。第十七页，共七十二页，编辑于2023年，星期一有胃蛋白酶、凝乳酶凝乳酶是存在于哺乳期小牛第四胃中的蛋白酶，以无活性的酶原形式被分泌出来。随着小牛的长大，由摄取母乳改变成青草和谷物时，凝乳酶的数量下降，而胃蛋白酶的数量增加。第十八页，共七十二页，编辑于2023年，星期一凝乳酶从无活性酶原转变成活性酶时经受了部分水解，分子量从36000下降到31000，pH5时酶原主要通过自身催化作用激活，而在pH2时，激活过程进行得非常快。第十九页，共七十二页，编辑于2023年，星期一凝乳酶在pH5.3~6.3最稳定，在pH3.5~4.5由于自我消化而失活。在中性和碱性范围，无凝乳活力。第二十页，共七十二页，编辑于2023年，星期一凝乳酶催化酪蛋白沉淀是干酪制造中非常重要的一步。原料乳杀菌——添加发酵剂、凝乳酶、色素——凝块形成——排除乳清——切块、搅拌、加热第二十一页，共七十二页，编辑于2023年，星期一（CaCl20.01%）——成型压榨——腌渍——发酵成熟——上色挂蜡——成品第二十二页，共七十二页，编辑于2023年，星期一1.5蛋白酶水解蛋白质的苦味来源：水解蛋白酶的苦味和蛋白质原有的氨基酸组成有关。特别是蛋白质中的疏水性氨基酸是导致蛋白质经水解后产生苦肽的重要原因。当蛋白质处于天然状态时，这些氨基酸埋藏在蛋白质结构的内部，因而对蛋白质的味道不会产生明显的影响。第二十三页，共七十二页，编辑于2023年，星期一在酶水解过程中，小肽的数量将增加，从而暴露了这些疏水性氨基酸，当它们同味蕾相作用时就产生了苦味。

第二十四页，共七十二页，编辑于2023年，星期一如果采取有控制的酶水解，使蛋白质的水解反应停止在某一个阶段，使肽键具有足够的长度将疏水性氨基酸埋藏在它的结构内部，就能减少水解蛋白质的苦味。第二十五页，共七十二页，编辑于2023年，星期一1.6蛋白酶作为食品添加剂的应用：1、作为肉类嫩化剂多使用木瓜蛋白酶。从宰杀老龄的动物得到的肉类，经烧煮后口感粗糟和坚硬。肉类中存在一定数量的胶原蛋白质，胶原蛋白质中的交联数目和强度随动物年龄的增加而提高。木瓜蛋白酶作用效果从肉类感官评定和剪切力测定中可以看出。第二十六页，共七十二页，编辑于2023年，星期一适合于配制肉类嫩化剂的蛋白酶必须具有较高的耐热性。这是因为嫩化剂的作用主要发生在当肉类被烧煮，温度逐渐升高，而酶尚未失活之前的这个阶段。第二十七页，共七十二页，编辑于2023年，星期一烧煮导致肉类结缔组织中胶原蛋白质和强性蛋白质变性，而蛋白酶较易作用于变性的胶原蛋白质和弹性蛋白质。木瓜蛋白酶在60~65度时使胶原蛋白质增溶的速度最快。第二十八页，共七十二页，编辑于2023年，星期一2、绿茶饮料浑浊：浑浊物质主要是由蛋白质（15~65%）和多酚类化合物（10~35%），通称茶乳酪（creamy）,是绿茶饮料生产中的关键，添加木瓜蛋白酶除去绿茶浸提液中的蛋白质，对稳定绿茶饮料十分有利。第二十九页，共七十二页，编辑于2023年，星期一2溶菌酶溶菌酶（N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，EC3.2.1.17）又称为胞壁质酶，是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶。溶菌酶是由129个氨基酸构成的单纯碱性球蛋白，化学性质非常稳定。第三十页，共七十二页，编辑于2023年，星期一在自然界中，溶菌酶普遍存在于鸟类、家禽的蛋清和哺乳动物的眼泪、唾液、血液、鼻涕、尿液、乳汁和组织细胞中(如肝、肾、淋巴组织、肠道等)，从木瓜、芜青、大麦、无花果和卷心菜、萝卜等植物中也能分离出溶菌酶，其中以蛋清含量最高。第三十一页，共七十二页，编辑于2023年，星期一在生物体内溶菌酶具有抗菌消炎，抗病毒，增强机体免疫力的生理功能，还可激活血小板，改善组织局部血液循环障碍，分泌脓液，增强局部防卫功能，具有止血、消肿等作用。它还可以作为一种宿主抵抗因子，对组织局部起保护作用。第三十二页，共七十二页，编辑于2023年，星期一2.1溶菌酶的种类溶菌酶的研究最早是从尼科尔(Nicoile)1907年发表枯草杆菌溶解因子的报告开始的。两年后，Laschtschenko指出：鸡卵白强烈抑菌作用是酶作用的结果。1922年英国细菌学家弗莱明(Fleming)发现人的唾液、眼泪中存在这种能溶解细菌细胞壁的酶，因其具有溶菌作用，故命名为溶菌酶。第三十三页，共七十二页，编辑于2023年，星期一1937年由Abraham与Robinson从卵蛋白中最先分离出晶体溶菌酶，此后人们在人和动物的多种组织、分泌液及某些植物、微生物中也发现了溶菌酶的存在，根据来源不同，将溶菌酶分为以下三类。第三十四页，共七十二页，编辑于2023年，星期一2.1.1动物源溶菌酶动物源溶菌酶包括鸡蛋清溶菌酶及人和哺乳动物溶菌酶。。第三十五页，共七十二页，编辑于2023年，星期一鸡蛋清溶菌酶是目前研究和应用最多的，在鸡蛋清中约含有3.5%左右的酶，分子量为14000，其等电点在pH10.8左右，最适效应温度在50℃，化学性质稳定，pH在1.2～11.3之间改变时对酶结构影响很小，pH在4～7范围内100℃处理1min仍有近100%的活力，在210℃条件下加热1.5h仍具有活性第三十六页，共七十二页，编辑于2023年，星期一鸡蛋清溶菌酶在碱性环境条件下稳定性较差，分解G+细菌，但对G-细菌不起作用。研究表明其它鸟类蛋清溶菌酶也是由129个氨基酸残基组成，但其排列顺序和鸡蛋清溶菌酶不同，并且活性部位也不相同。第三十七页，共七十二页，编辑于2023年，星期一人溶菌酶分子量为14600单位，对人的溶菌酶研究发现它是由130个氨基酸残基组成，也有4个S-S键，其一级结构氨基酸顺序及组成与鸡蛋清溶菌酶相比有极大的差异，但三级结构有相似性，其溶菌活性比鸡蛋清溶菌酶高2倍。对于哺乳动物溶菌酶，目前仅从牛、马、羊等动物的乳汁中分离出溶菌酶，其化学性质与人溶菌酶相似，但结构尚不清楚，其溶菌活性远低于人溶菌酶。第三十八页，共七十二页，编辑于2023年，星期一5.2.1.2植物源溶菌酶目前发现含溶菌酶的植物有近170种，在木瓜、无花果、大麦等植物中均已分离出溶菌酶。植物源溶菌酶分子量较大，约为24000～29000单位，其对溶壁小球菌的溶菌活性不超过鸡蛋清溶菌酶的1/3，但其对胶体状甲壳质的分解活性则是鸡蛋清溶菌酶的10倍。第三十九页，共七十二页，编辑于2023年，星期一2.1.3微生物源溶菌酶上世纪60年代从微生物中分离出溶菌酶，根据其作用对象分为细菌细胞壁溶菌酶和真菌细胞壁溶菌酶。第四十页，共七十二页，编辑于2023年，星期一细菌细胞壁溶菌酶可分为三大类：N-乙酰氨基己糖苷酶，它破坏细菌细胞壁肽聚糖中β-(1，4)糖苷键；酰胺酶，它催化裂解细菌细胞壁肽聚糖中N-乙酰胞壁酸与肽“尾”之间的N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸键；内肽酶，它催化裂解肽聚糖肽桥中的肽键。第四十一页，共七十二页，编辑于2023年，星期一现在研究发现，细菌细胞壁溶菌酶的抗菌活性不仅表现在其分解细菌细胞壁方面，当酶受到不可逆抑制后，它仍然显示出抗菌效应；不同来源的细菌细胞壁溶菌酶有不同的抗菌范围，并对不同类型的肽聚糖有特异性。第四十二页，共七十二页，编辑于2023年，星期一真菌细胞壁溶菌酶包括几丁质酶和β-葡聚糖酶。抗真菌的几丁质酶主要是内几丁质酶，首先是在植物中发现，这类几丁质酶可以对抗侵入植物体的真菌病原体，后来人们在链霉菌属、杆菌和大多数真菌也发现该酶，真菌几丁质酶与植物几丁质酶相似。第四十三页，共七十二页，编辑于2023年，星期一几丁质酶主要用于真菌细胞壁的降解和重组，但在大多数产几丁质酶的真菌中，此酶主要用于真菌细胞壁的成型过程，由于肽聚糖和甲壳质的糖骨架具有相似的结构，一些几丁质酶也具有溶菌酶活性。第四十四页，共七十二页，编辑于2023年，星期一β-葡聚糖酶(β-glucanases)是另一类真菌细胞壁溶菌酶，包括β-(1，3)葡聚糖酶，β-(1，6)葡聚糖酶和甘露聚糖酶等，主要用于分解酵母细胞的细胞壁。第四十五页，共七十二页，编辑于2023年，星期一如β-(1，3)葡聚糖酶主要作用是它能水解β-(1，3)糖苷键，还可以对几丁质降解真菌细胞壁起到显著的协同作用，将纯化的几丁质酶和β-葡聚糖酶合用，其抗灰色葡萄孢(Botrytiscinera)的作用能够提高10倍。

第四十六页，共七十二页，编辑于2023年，星期一2.2溶菌酶的性质及作用机理

溶菌酶纯品为白色或微黄、黄色的结晶体或无定型粉末，无异味，微甜，易溶于水，遇碱易被破坏，不溶于乙醚。其活性受以下因素影响。第四十七页，共七十二页，编辑于2023年，星期一2.2.1温度对溶菌酶活性的影响Weaver等发现在60℃以上牛乳中的溶菌酶活性下降。Hayase等发现溶菌酶通过二硫键聚合，180℃时聚合和降解同时进行，当>200℃时肽键的断裂和重组发生，聚合和降解变得更为剧烈。第四十八页，共七十二页，编辑于2023年，星期一Frasco等用红外光谱研究了溶菌酶的热变性机理，发现它是和水结构密切相关的。其它外侧非极性氨基酸残基对变性无重要影响，从外侧极性氨基酸游离出的水在其始变性过程中起重要作用，水进入内部肽-肽键中，使蛋白质膨胀和伸展。第四十九页，共七十二页，编辑于2023年，星期一2.2.2pH对溶菌酶活性的影响

溶菌酶在酸性pH下是稳定的，此时100℃的加热对溶菌酶仅有很小的活性损失。Matsuoka等报道pH4.5(100℃、3min)、pH5.29(100℃，30min)的加热对溶菌酶是稳定的。Beychok等报道溶菌酶在pH5.5最为稳定。第五十页，共七十二页，编辑于2023年，星期一2.2.3化学物质对溶菌酶的影响Back等研究表明糖和聚烯烃类能增加溶菌酶的热稳定性，Hidaka等发现NaCl对溶菌酶也有抗热变性作用。第五十一页，共七十二页，编辑于2023年，星期一同时Kravchenko等发现盐溶液的存在对溶菌酶的活性是十分必要的，Chang的研究也发现溶菌酶的活性在低盐浓度时和离子强度密切相关的，在高盐浓度时溶菌酶的活性受到抑制，阳离子的价态越高则其抑制作用越强。Yashitake等发现具有-COOH和-SH3OH基的多糖对溶菌酶活性有抑制作用。第五十二页，共七十二页，编辑于2023年，星期一2.2.4加工过程对溶菌酶活性的影响在一个冷冻干燥的模拟体系中溶菌酶有聚合、生物活性损失和其它化学变化。溶菌酶和过氧亚油酸的反应生成了二聚和高聚体；多聚是因为随水活性增加共价键交联度、蛋白质不溶性和酶活性损失增加引起的。第五十三页，共七十二页，编辑于2023年，星期一2.2.5络合作用对溶菌酶活性的影响溶菌酶可和许多物质形成络合物导致其活性丧失。等量蛋清和蛋黄的混合物其溶菌酶无活性，脱水整蛋仅保留部分溶菌酶活性，蛋黄在pH6.2磷酸盐缓冲液中使纯溶菌酶失活。研究者认为抑制机理是在溶菌酶和蛋黄化合物间形成静电相互作用的络合物所致。第五十四页，共七十二页，编辑于2023年，星期一N-乙酰葡萄糖胺的β(1-4)键多聚物是溶菌酶的底物。它们间形成一聚、二聚、三聚、四聚体，是溶菌酶的抑制剂。第五十五页，共七十二页，编辑于2023年，星期一SDS结合到活性位上强烈抑制了溶菌酶活性，除此之外其它和溶菌酶形成络合物的物质有：胸腺泡核、酵母泡核、甲状腺素、甲状腺球蛋白、α-La、咪唑核吲哚衍生物。阳离子如Co2+、Mg2+

、Hg2+、Cu2+等均可抑制溶菌酶的活性(10-3～10-2mol/L)。第五十六页，共七十二页，编辑于2023年，星期一2.3溶菌酶的抗菌机理细菌的细胞壁由胞壁质组成，胞壁质是由N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine)及N-乙酰胞壁酸(N-acetylmuramicacid)交替组成的多聚物，胞壁酸残基上可以连接多肽，称为肽聚糖(Peptidoycan)。第五十七页，共七十二页，编辑于2023年，星期一肽聚糖是细菌细胞壁的主要成分，它是由NAM、NAG和肽“尾”(一般是4个氨基酸)组成，NAM与NAG通过β-l，4糖苷键相连，肽“尾”则是通过D-乳酰羧基连在NAM的第3位碳原子上，肽尾之间通过肽“桥”(肽键或少数几个氨基酸)连接，NAM、NAG、肽“尾”与肽“桥”共同组成了肽聚糖的多层网状结构，作为细胞壁的骨架，上述结构中的任何化学键断裂，皆能导致细菌细胞壁的损伤。第五十八页，共七十二页，编辑于2023年，星期一溶菌酶能有效地水解细菌细胞壁的肽聚糖，其水解位点是N-乙酰胞壁酸(NAM)的l位碳原子和N-乙酰葡萄糖胺(NAG)的4位碳原子间的β-l，4糖苷键，结果使细菌细胞壁变得松弛，失去对细胞的保护作用，最后细胞溶解死亡。第五十九页，共七十二页，编辑于2023年，星期一对于G+细菌与G-细菌，其细胞壁中肽聚糖含量不同，G+细菌细胞壁几乎全部由肽聚糖组成，而G-细菌只有内壁层为肽聚糖，因此，溶菌酶只能破坏G+细菌的细胞壁，而对G-细菌作用不大。第六十页，共七十二页，编辑于2023年，星期一2.4溶菌酶在食品上的应用第六十一页，共七十二页，编辑于2023年，星期一2.4.1溶菌酶用于水产类熟制品、肉类制品的防腐和保鲜溶菌酶可作为鱼丸等水产类熟制品和香肠、红肠等肉类熟制品的防腐剂。只要将一定浓度(通常为0.05%)的溶菌酶溶液喷洒在水产品或肉类上，就可起到防腐保鲜的作用。第六十二页，共七十二页，编辑于2023年，星期一2.4.2用于新鲜海产品