南京医科大学博导论坛细胞与分子实验周建伟

基因的结构和功能关系

理论与实践周建伟当前第1页\共有127页\编于星期日\20点认识基因的结构和功能

理论基础当前第2页\共有127页\编于星期日\20点真核和原核细胞的基因转录与翻译当前第3页\共有127页\编于星期日\20点当前第4页\共有127页\编于星期日\20点15Feb2001

TheSangerCentre,WellcomeTrustGenomeCampus,Hinxton,CambridgeCB101SA,UK

16Feb2001CeleraGenomics,45

WestGudeDrive,Rockville,MD20850,

USA

值得纪念的里程碑，人类首次解密自身的基因密码当前第5页\共有127页\编于星期日\20点科学家对DNA含义的理解当前第6页\共有127页\编于星期日\20点科学家对DNA含义的理解当前第7页\共有127页\编于星期日\20点科学家对DNA含义的理解当前第8页\共有127页\编于星期日\20点科学家对DNA含义的理解当前第9页\共有127页\编于星期日\20点蛋白质的相互作用当前第10页\共有127页\编于星期日\20点HGP的完成为探索基因功能打下了坚实的基础当前第11页\共有127页\编于星期日\20点候选基因

（CandidateGenes）全基因组关联学研究

（Genome-wideAssociationStudy）生物学通路研究

（Pathway-basedGenes）当前第12页\共有127页\编于星期日\20点

机体易感性对环境因素致癌的影响当前第13页\共有127页\编于星期日\20点基因——表型联系的复杂性当前第14页\共有127页\编于星期日\20点当前第15页\共有127页\编于星期日\20点当前第16页\共有127页\编于星期日\20点当前第17页\共有127页\编于星期日\20点当前第18页\共有127页\编于星期日\20点当前第19页\共有127页\编于星期日\20点当前第20页\共有127页\编于星期日\20点JWA基因的结构和功能关系研究：实践探索

当前第21页\共有127页\编于星期日\20点

建立诱导细胞分化模型，克隆调节细胞分化的关键基因，解析基因结构－功能关系，发展基于机制研究的基因干预手段科研思路当前第22页\共有127页\编于星期日\20点

恶性肿瘤是危害人类健康最主要的疾病之一，大多数恶性肿瘤是由环境因素和基因交互作用所致恶性肿瘤的生物学特征包括无限增殖、分化和凋亡障碍、浸润以及转移当前第23页\共有127页\编于星期日\20点

肿瘤转移是恶性肿瘤威胁生命的最主要原因细胞迁移是肿瘤浸润和转移的必备条件对肿瘤细胞迁移及其调控机制的研究已成为肿瘤预防和治疗领域的热点

RidleyAJ.,etal.Science.2003;302(5651):1704-1709CondeelisandPollard.Cell.2006;124:263-266当前第24页\共有127页\编于星期日\20点

细胞的各种生物学行为是由细胞内相应分子按信号通路执行完成的丝裂原活化的蛋白激酶（MAPK）信号通路是细胞内最主要的信号通路之一，可介导多种细胞生物学行为在细胞迁移过程中,MAPK信号通路起重要调节作用

RaftopoulouM.NatureCellBiology.2006;8,654HuangC,etal.JorunalofCellScicence.2004;117(20):4619-4628HashiramotoA.etal.Oncogene.2006;25,3948–3955当前第25页\共有127页\编于星期日\20点MAPKSignalPathway环境因素刺激细胞信号转导通路如MAPK磷酸化激活下游靶分子生物学效应增殖分化凋亡迁移当前第26页\共有127页\编于星期日\20点细胞信号转导的一般规律当前第27页\共有127页\编于星期日\20点JWA基因

由我本人1997年发现和克隆，1998年获GenBank新基因号：AF0705232002年HUGO把JWA正式命名为ARL6IP5；GenBank中的其它别名：GTRAP3-18;PRAF3;jmx等

JWA在人染色体定位是3p14;cDNA全长为2.1kb,其编码蛋白定位于细胞浆，含188个氨基酸

JWA在生物进化中保守当前第28页\共有127页\编于星期日\20点JWA基因库文件大鼠JWA基因库文件课题组登录在GenBank的人和大鼠JWA基因序列当前第29页\共有127页\编于星期日\20点JWA↓HUGO正式批准JWA及其同源基因的基因名为ARL6IP5当前第30页\共有127页\编于星期日\20点

JWA基因的染色体定位当前第31页\共有127页\编于星期日\20点

人类3号染色体的基因构成和特点当前第32页\共有127页\编于星期日\20点

人、小鼠、大鼠JWA基因染色体定位对应关系当前第33页\共有127页\编于星期日\20点JWA同源基因DNA和蛋白质相似性人>黑猩猩>犬>小鼠>大鼠>鸡>斑马鱼>果蝇>蚊>线虫当前第34页\共有127页\编于星期日\20点LOCUSAAC64360188aaDEFINITIONJWAprotein[Homosapiens].AUTHORSZhou,J.W.,Di,Y.P.andWu,R.TITLEAnoveldifferentiallydisplayedvitaminAresponsivegenethatiscytoskeletonrelated

JOURNALSubmitted(02-JUN-1998)InternalMedicine,UCatDavis,Rm1121,SurgeI,CCRBM,UCDavis,Davis,CA95616,USAMDVNIAPLRAWDDFFPGSDRFARPDFRDISKWNNRVVSNLLYYQTNYLVV50AAMMISIVGFLSPFNMILGGIVVVLVFTGFVWAAHNKDVLRRMKKRYPTT100FVMVVMLASYFLISMFGGVMVFVFGITFPLLLMFIHASLRLRNLKNKLEN150KMEGIGLKRTPMGIVLDALEQQEEGINRLTDYISKVKE188

OpenReadingFrame(ORF)ofJWA

PKCphosphorylationsites:SDR,SLRThreetransmembranedomains

当前第35页\共有127页\编于星期日\20点氨基端在膜外侧，羧基端在膜内侧；第一个跨膜区为一级螺旋结构，第二和第三个跨膜区为二级螺旋结构；两个PKC磷酸化位点分别在膜两侧；第一个跨膜区为一级螺旋结构，第二和第三两个跨膜区为二级螺旋结构。

当前第36页\共有127页\编于星期日\20点JWA蛋白磷酸化基序预测当前第37页\共有127页\编于星期日\20点97年以来，课题组对JWA基因结构功能关系研究取得一系列创新性成果

围绕JWA应答环境理化因素（H2O2、热休克、UV），着重研究：

JWA应答细胞氧化应激调节DNA碱基切除修复（BER）调节细胞凋亡的作用和机制围绕JWA是细胞骨架相关蛋白，调节多种细胞分化，着重研究：

JWA调节细胞迁移/细胞恶性转化调节细胞粘附、浸润体内肿瘤转移的作用和机制1997？？当前第38页\共有127页\编于星期日\20点√√√√√√√当前第39页\共有127页\编于星期日\20点JWA基因与细胞凋亡当前第40页\共有127页\编于星期日\20点JWA表达是As2O3通过活性氧-线粒体信号通路诱导肿瘤细胞凋亡的必需分子

当前第41页\共有127页\编于星期日\20点As2O3

诱导HeLa和MCF-7细胞凋亡与JWA表达相平行HeLaCellMCF-7Cell当前第42页\共有127页\编于星期日\20点

JWA表达是As2O3抗增殖和促凋亡作用的必需条件HeLaCellMCF-7Cell当前第43页\共有127页\编于星期日\20点下调JWA表达

阻止

As2O3诱导肿瘤细胞凋亡的作用依赖于caspase-9表达当前第44页\共有127页\编于星期日\20点下调JWA表达抑制As2O3

对线粒体膜电位的影响

C1-HeLa

As-HeLa当前第45页\共有127页\编于星期日\20点As2O3

产生的ROS诱导JWA表达当前第46页\共有127页\编于星期日\20点JWA激活MEK–ERK1/2和JNK分子的磷酸化当前第47页\共有127页\编于星期日\20点JWA与肿瘤细胞凋亡—小结As2O3产生的H2O2通过诱导JWA表达触发一系列信号转导机制诱导HeLa和MCF-7细胞凋亡JWA为As2O3诱导活化MEK–ERK和JNK所必需，进一步影响线粒体膜电位并激活casepase-9，从而在As2O3诱导细胞凋亡中发挥中心作用As2O3诱导Bad活化与细胞凋亡有关，也受JWA调节，但与MEK–ERK/JNK机制无关当前第48页\共有127页\编于星期日\20点ZhouJ.,etal.ToxicolApplPharmacol,2008,230:33-40当前第49页\共有127页\编于星期日\20点JWA应答氧化应激的分子机制当前第50页\共有127页\编于星期日\20点XRCC1,PolAPE1,LigIII,PARP-1未修复DNA修复维护基因组稳定癌症SIRT6BER通路基因组不稳定DNA损伤DNA损伤Cell,2006Nature,2008衰老ROS损伤严重修复能力缺陷当前第51页\共有127页\编于星期日\20点问题的提出JWA应答细胞的氧化应激？——是否应答？如何应答？当前第52页\共有127页\编于星期日\20点SOD:catalase:O-2.

O-2.

H2O2

H2O2

O2O-2.

H2O2

H2OcatalaseSOD细胞中活性氧代谢规律当前第53页\共有127页\编于星期日\20点通过靶基因起效应ROS或自由基激活转录因子激活信号转导通路MAPK通路等NF-B、AP-1等清除ROS修复细胞损伤细胞凋亡氧化应激作用于细胞的过程和转归当前第54页\共有127页\编于星期日\20点JWA参与B(a)P诱导细胞DNA损伤与修复1.control2.DMSO3.10µM4.50µM5.100µMβ-actinJWAhsp701234550McontrolDMSO10M100M3h24h损伤修复当前第55页\共有127页\编于星期日\20点A3A2B1B2B3A2CtrlB(a)PnoenzymeFPGEndoIIIB(a)P代谢产物暴露使细胞形成8-OH-dG当前第56页\共有127页\编于星期日\20点H2O2H2O2+EndoⅢH2O2+FPG00.010.101.00H2O2(mmol/L)ABCEFGHJKLDIH2O2所致细胞DNA损伤和8-OH-dG的形成当前第57页\共有127页\编于星期日\20点

Lane

123456AJWAβ-actin1530606060minctrlH2O2SOD-

---+-catalase-

----+

Lane1234567Bβ-actinJWAB(a)Pctrl4812242424hrSOD-

---

-

+-catalase-

---

-

-+胞内H2O2自由基诱导JWA的表达当前第58页\共有127页\编于星期日\20点untreatedH2O2H2O2+SODH2O2+catalaseO-2.level(DE)H2O2level(DCFH-DA)H2O2处理后细胞内O-2.和H2O2变化(活性氧染色实验)当前第59页\共有127页\编于星期日\20点untreatedB(a)PB(a)P+SODB(a)P+catalaseO-2.level(DE)H2O2level(DCFH-DA)B(a)P处理后细胞内O-2.和H2O2变化(活性氧染色实验)当前第60页\共有127页\编于星期日\20点筛选转录活性最强的启动子区域(报告基因模型)

600bpS1S2S3S4S5S6M300bp100bp2143013646017021587ALUC(-194/+107)LUC(-257/+107)LUC(-494/+107)LUC(-595/+107)LUC(-1680/+107)LUC(+21/+107)LUC(-107/+107)relativeluciferaseactivity当前第61页\共有127页\编于星期日\20点B123456789ctrlH2O2B(a)Pprobe-107/-28wt核因子与转录活性最强的启动子区域结合(凝胶阻滞实验)

当前第62页\共有127页\编于星期日\20点证实该核因子的分子量为～47kD(Southwestern实验)

ctrlH2O2B(a)P-107/+107wtprobe47kDC当前第63页\共有127页\编于星期日\20点CBF?NF1?

CEBP?GATA-1?H2O2和B(a)P共同激活的转录因子当前第64页\共有127页\编于星期日\20点DctrlH2O2B(a)PNF1/CTFAb47kD证实该核因子可能为NF1(1)(Westernblot实验)

当前第65页\共有127页\编于星期日\20点核因子为NF1(2)(Supershift实验)

B(a)PH2O2-107/-28wtprobe--+-+NF1AbFreeprobeprobe+proteinprobe+protein+Abprobe+proteinprobe+protein+AbE当前第66页\共有127页\编于星期日\20点FctrlH2O2B(a)P-107/+107wtprobe65kDctrlH2O2B(a)PNF1/CTFAb65kD进一步证实该核因子为NF1(3)(免疫沉淀实验)

nuclearextractsNF1antibodyProteinADIG-labeled-107/+107ProbeWesternblot当前第67页\共有127页\编于星期日\20点干涉NF1可有效阻断H2O2和B(a)P诱导的JWA转录活性(1)

Grelativeluciferaseactivity当前第68页\共有127页\编于星期日\20点干涉NF1后阻断了H2O2和B(a)P诱导的JWA表达(2)(RNAi实验)

Lane

1234JWAβ-actinNF1H2O2

--+-NF1siRNA-+++B(a)P---+HWesternblot当前第69页\共有127页\编于星期日\20点-94/-90-53/-49CCAATboxCCAATbox-107-28CBF×NF1

CEBP×GATA-1×

??JWA启动子区有两个NF1结合元件当前第70页\共有127页\编于星期日\20点A制备CCAAT变异探针用于检测其与NF1结合

①××②③④当前第71页\共有127页\编于星期日\20点ctrlH2O2B(a)PCTF1(-107/-59)probeCTF2(-58/-9)CTF1+2(-97/-44)CTFm1+2(-97/-44)47kDBNF1与第二个CCAAT元件结合(1)(Southwestern实验)

①②③④当前第72页\共有127页\编于星期日\20点C-58/-9123456789ctrl

H2O2B(a)Pprobe-107/-59123456789ctrl

H2O2B(a)PprobeNF1与第二个CCAAT元件结合(2)(凝胶阻滞实验)

当前第73页\共有127页\编于星期日\20点NF1与第二个CCAAT元件结合(3)(定点突变实验)

LUCLUCLUCD当前第74页\共有127页\编于星期日\20点NormalKD-JWAβ-actinJWA12ABVector-ctrlHeLaKD-JWAHeLacontrolB(a)P3hRe-3h123456JWA保护氧化应激引起的DNA损伤

损伤修复当前第75页\共有127页\编于星期日\20点JWA通过调节BER信号通路参与DNA修复当前第76页\共有127页\编于星期日\20点JWA应答氧化应激--小结JWA应答氧化应激氧化应激产生的H2O2通过NF1与JWA启动子区CCAAT元件结合后激活JWA表达JWA进一步通过BER信号通路促进DNA修复当前第77页\共有127页\编于星期日\20点ChenR.,etal.FreeRadicBiolMed,2007,42:1704当前第78页\共有127页\编于星期日\20点作为细胞氧化应激条件下的应答基因，JWA如何保护细胞拮抗氧化损伤？作为还原性蛋白直接中和细胞内活性氧？作为DNA修复蛋白修复DNA损伤？进一步的问题当前第79页\共有127页\编于星期日\20点JWA作为还原性蛋白直接中和

细胞内活性氧？JWA缺陷细胞在氧化应激条件下细胞内活性氧含量增加？使细胞回复表达JWA后细胞内活性氧含量减少？当前第80页\共有127页\编于星期日\20点

实验结果：细胞内JWA表达水平不影响活性氧含量——JWA可能不是直接的还原性蛋白

JWA作为DNA修复蛋白修复DNA损伤？当前第81页\共有127页\编于星期日\20点实验模型NIH-3T3HELF氧化损伤模型：氧化损伤MMSH2O2损伤修复模型：氧化损伤除去氧化剂加入新鲜培养液修复H2O2：HydrogenPeroxide,过氧化氢MMS:methylmethanesulfonate,甲磺酸甲酯当前第82页\共有127页\编于星期日\20点JWA参与氧化应激诱导的DNA损伤修复当前第83页\共有127页\编于星期日\20点UntreatedplasmidH2O2damagedplasmid宿主细胞活性实验当前第84页\共有127页\编于星期日\20点细胞中JWA的表达增强DNA损伤修复能力

当前第85页\共有127页\编于星期日\20点JWA低表达的细胞对氧化剂造成的损伤更加敏感MTT实验当前第86页\共有127页\编于星期日\20点JWA低表达的细胞表现出氧化损伤更加严重检测细胞中NAD(P)H水平当前第87页\共有127页\编于星期日\20点免疫共沉淀AB当前第88页\共有127页\编于星期日\20点JWA作为BER复合物中新的修复分子CD当前第89页\共有127页\编于星期日\20点JWA调节XRCC1和LigIII的表达而不影响APE1的表达当前第90页\共有127页\编于星期日\20点ABC氧化损伤引起JWA的核移位当前第91页\共有127页\编于星期日\20点DE敲减JWA抑制XRCC1进核当前第92页\共有127页\编于星期日\20点氧化损伤诱导JWA浆核易位F当前第93页\共有127页\编于星期日\20点XRCC1对JWA的浆核易位起重要的作用AB当前第94页\共有127页\编于星期日\20点B12H2O2

通过E2F1调节XRCC1转录

JWA影响H2O2

对XRCC1的转录调节当前第95页\共有127页\编于星期日\20点DCProbe：5’-TAATTTTTTTCGCGCGTGCGCGCGCGCGTA-3’–biotinCompetitorProbe：5’-TAATTTTTTTCGCGCGTGCGCGCGCGCGTA-3’JWA通过E2F1调节XRCC1的转录水平MutatedCompetitorProbe：5’-TAATTTTCG

AGC

TGCGTA

GACTCACGCGTA-3’当前第96页\共有127页\编于星期日\20点BJWA通过调节MAPK信号通路影响E2F1的表达A当前第97页\共有127页\编于星期日\20点BA当前第98页\共有127页\编于星期日\20点JWA维持XRCC1的蛋白稳定当前第99页\共有127页\编于星期日\20点敲减JWA加速泛素化酶对XRCC1的降解当前第100页\共有127页\编于星期日\20点JWA抑制XRCC1通过泛素-蛋白酶体途径降解当前第101页\共有127页\编于星期日\20点GJWA表达不受泛素化影响当前第102页\共有127页\编于星期日\20点JWA与DNA碱基切除修复—小结氧化应激激活的JWA通过MAPK-E2F1转录调节XRCC1及其下游分子表达，启动细胞应答氧化应激机制JWA与XRCC1相互调节核内表达量，协调DNA氧化损伤后的BER修复过程JWA通过泛素化途径调控核内XRCC1的表达量当前第103页\共有127页\编于星期日\20点①②③④H2O2H2O2H2O2H2O2H2O2H2O2H2O2JWA应答氧化应激调节BER信号通路的机制当前第104页\共有127页\编于星期日\20点WangSY,etal.NucleicAcidsRes.2009,37(6):1936-1950当前第105页\共有127页\编于星期日\20点进一步的问题细胞JWA表达水平是否影响其抵抗环境因素的损伤作用？细胞JWA表达水平与肿瘤易感性关系？JWA与XRCC1的相互调节关系与肿瘤发生发展？当前第106页\共有127页\编于星期日\20点-76GG-76GC-76GC-76GG-76GC-76GGJWA基因-76GC多态性增加胃癌和食管癌易感性TangWY,JTEH,2007当前第107页\共有127页\编于星期日\20点JWASNP-76G>CJWA应答氧化应激能力

肿瘤危险性

JWA基因的SNPs与肿瘤易感性有关病例/对照=1096/814CombinedOR=1.85(1.15-2.81)BDC膀胱癌胃癌食管癌白血病A当前第108页\共有127页\编于星期日\20点当前第109页\共有127页\编于星期日\20点JWA和XRCC1用于预测胃癌患者术后预后以及指导个体化治疗当前第110页\共有127页\编于星期日\20点2023/6/8111JWA基因在人胃癌和癌旁组织中的表达JWAXRCC1当前第111页\共有127页\编于星期日\20点2023/6/8112胃癌组织中JWA和/或XRCC1表达与预后关系当前第112页\共有127页\编于星期日\20点2023/6/8113胃癌组织中JWA或XRCC1表达对化疗效果的影响当前第113页\共有127页\编于星期日\20点2023/6/8114配对癌旁组织中JWA/XRCC1表达与预后关系当前第114页\共有127页\编于星期日\20点ⅠⅡTNMI-II期单纯手术胃癌患者术后生存当前第115页\共有127页\编于星期日\20点TNMIII-IV期单纯手术胃癌患者术后生存ⅢⅣJWAhighJWAlowN=423,p<0.001020406080100Cum.Survival(%)020406080100120