酶的免疫化学测定课件整理

第五节酶的免疫化学测定

二十世纪70年代以来，随着免疫学技术的发展，酶的定量分析技术中出现了许多利用酶蛋白的抗原性，通过抗原抗体反应直接测定酶的免疫化学测定法。与经典的测定酶活性方法比较，这些方法不仅灵敏度高，而且能测定一些以前不易测定或测定条件不易掌握的酶。

(一)测定原理

放射免疫测定(RIA)分为直接法与间接法。

直接法是将放射性核素标记的酶分子与相应抗体作用产生沉淀，然后将沉淀分离并进行定量测定。

间接法是将样品中无放射性的酶蛋白与放射性标记的标准酶共同对有限量的抗体进行竞争，根据其竞争程度来定量样品中的酶蛋白量。以间接法为最常用。

另外还有免疫抑制法、化学发光免疫测定(CLIA)、酶免疫测定(EIA)、荧光酶免疫测定(FEIA)等。报告方式有两类：一类是用酶活性浓度单位，如免疫抑制法测定CK-MB酶活性(actiyity)，结果常以U／L报告；另一类是用质量浓度单位，如用免疫学方法测定CK-MB酶质量(mass)(即蛋白量)，结果常直接用ng／ml或6μg／L报告。(二)免疫化学测定的优缺点

血清酶活性变化分为酶蛋白质量和酶活性同步变化及酶蛋白质量未变而酶活性变化两种情况。酶在一些病理条件下或受操作条件等影响而失活，一些激活剂或抑制剂对酶活性也有影响，因而酶活性常不能正确反映酶的情况，出现酶活性与酶蛋白绝对量不一致，有时甚至出现两者变化完全相反的情况。与传统的酶活性测定法相比，免疫化学测定法的优点主要有：①灵敏度高，能测定其他方法不易测出的少量或痕量酶；②特异性高，不受体液中其他物质，如酶抑制剂、激活剂等的影响；③能用于一些不表现酶活性的酶蛋白，如各种酶原或去辅基酶蛋白，或因遗传变异而导致合成无活性的酶蛋白的酶测定；④特别适用于同工酶的测定。酶的免疫化学测定也有其局限性。主要有：①要制备足够量的提纯酶作为抗原和具有免疫化学性质的抗血清常常是很困难的，而且工作量很大；②测定步骤多，操作繁琐；③测定成本高。第六节同工酶及其亚型测定特别是纸片法简便快速，适用于急诊有机磷中毒的快速筛查。临床上习惯用U／L来表示体液中酶催化浓度。γ-GT4与胆红素增高密切相关。与传统的酶活性测定法相比，免疫化学测定法的优点主要有：ALT有两种不同活性的同工酶α(ALTs)、β(ALTm)，分别存在于细胞质及线粒体，后者的活性为前者的16倍。一般CK-MB2>1.酶是能催化生物体内化学反应的一类特殊蛋白质。血清中的γ-GT则主要来自肝胆，红细胞中几乎无γ-GT，因此溶血对其测定影响不大。LD同工酶都出现LDl／LD2>1，即所谓“反转比率”现象，且持续的时间长。但神经疾病引起的肌萎缩，CK活性一般正常。草酰乙酸+NADH+H+L-苹果酸+NAD+用电泳法进行同工酶分析时，如显示的区带数与同工酶数不一致时，要特别注意巨分子酶的存在。L-丙氨酸+α-酮戊二酸L-谷氨酸+L-丙酮酸另一大类以乳酸为底物的顺向反应(称LD-L法)。迄今测定LPS的方法可分为3类：测定产物(游离脂肪酸)的增加(如滴定法、比色法、分光光度法、荧光法和pH电极法等)；可在340nm波长下测定NADPH生成速率而计算CK活性浓度。电泳法的使用最为广泛。亚型指基因在编码过程中，由于翻译修饰差异所形成的多种形式的一类酶。我国多采用目前IFCC参考方法LD-L法，用连续监测法进行测定。与传统的酶活性测定法相比，免疫化学测定法的优点主要有：一、概念同工酶是同一种属中由不同基因或等位基因所编码的多肽链单体、纯聚体或杂化体，具有相同的催化功能，但其分子组成、空间构象、理化性质、生物学性质以及器官分布和细胞内定位不同的一类酶。亚型某些酶或同工酶从组织进入体液后，可进一步变化为数个不同类型即所谓“亚型，也称为同工型(isoform)”。即指基因在编码过程中由于翻译后修饰的差异所形成的多种形式的一类酶。亚型往往在基因编码产物从细胞内释入血浆时因肽酶作用降解而形成。三、分析方法

临床同工酶的分析大致可分为两步，即首先精确地分离出某酶的各同工酶组分，然后测定酶的总活性和各同工酶或亚型组分的活性。(一)电泳法

1．方法电泳法的使用最为广泛。此法简便、快速、分离效果良好，并且一般不会破坏酶的天然状态。目前国内外的一些自动化电泳分析系统则多采用分辨率更高的琼脂糖凝胶作为支持介质，采用高压或常压电泳进行各种同工酶及其亚型的分离与鉴定。此外还可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳及毛细管电泳等技术进行分析。测定步骤主要分为区带分离、活性显色和检测结果等。用电泳法进行区带分离的原理与其他蛋白电泳相似。

2．显色染料

常用显色染料有偶氮染料和四唑盐等。它们易溶于水，难溶于一般的有机溶剂。酶学中只是利用所进行的偶合反应，由所生成不同颜色的偶氮色素进行同工酶谱检测，四唑盐起着受氢体的作用，如将四唑盐及双四唑盐分别还原成紫红色的甲躜(formazan)和紫蓝色的双甲躜。常用的四唑盐有：硝基四唑蓝盐(NBT)，碘化硝基四唑盐(INT)、甲基噻唑四唑盐(MTT)等。其中NBT生成的色素难以溶解，在局部区域染色良好，使用最多。3．扫描定量

显色后的区带一般用光密度计或荧光计扫描定量分析。或将薄膜或凝胶切割成小条或小薄片，分别浸泡在含缓冲液的试管中，低温下将酶条带洗脱，再进行比色分析，亦可计算出各同工酶或亚型区带的活力。图6-6为琼脂糖凝胶电泳分离的血清LD同工酶谱(图谱中从左至右分别为LD1-LD5)。4．注意事项

用电泳法进行同工酶分析时，如显示的区带数与同工酶数不一致时，要特别注意巨分子酶的存在。巨分子酶形成的原因主要有：①酶与免疫球蛋白形成的复合物，如CK—BB-IgG、CK-MM-IgA、LD-IgA等；②酶与其他蛋白质形成的复合物，如LD-β-脂蛋白；③酶亚基或酶分子之间形成的聚合物，如CK—Mt聚合物、LD亚基自身聚合等。如患者临床症状不明显，血清酶活性不正常，同工酶图谱异常时要特别警惕血清中有无巨分子酶，以免造成对酶测定结果的错误判断和临床误诊。

(二)色谱法

常用色谱法是柱色谱，如离子交换色谱和亲和色谱等用于同工酶的提纯与制备，但方法费时繁琐，通常不适合临床同工酶常规检测。目前国外已有供临床同工酶分析用的商品化微型色谱柱。也有应用阴离子交换色谱结合免疫化学法、聚焦色谱结合电化学检测法进行CK亚型分析和研究的报道。(三)免疫分析法

由于同工酶的一级结构不同，因而免疫化学性质也不同。利用纯化的同工酶免疫动物制备特异性的抗血清，此抗体只与该同工酶产生特异性免疫反应。因此，抗原决定簇不同的同工酶可用特异的免疫反应来识别。应用较多的免疫分析法有免疫抑制法、免疫沉淀法等。酶活性浓度测定是临床酶学分析最为常用的方法。假如能同时测定AST，并计算AST／ALT之比，则对于急、慢性肝炎的诊断、鉴别诊断以及判断转归也特别有价值。CK极度升高(>3000U／L)主要见于全身疾病，特别是肌肉疾病，此时CK测定有助于肌萎缩病因的鉴别，如进行性肌萎缩时可见CK显著升高。临床常规中以电泳法最常用。血清中ALP主要来自肝脏和骨骼。其中底物浓度对酶促反应的影响可用米-曼氏方程表示。ALT速率法测定中酶偶联反应式为：由于ChE在肝脏合成后立即释放到血浆中，故是评价肝细胞合成功能的灵敏指标，与清蛋白生成有密切关系，故测定血清ChE一般用作肝功能试验。γ－谷氨酰转移酶(γ-GT或GGT)又称γ-谷氨酰转肽酶，是一种线粒体酶。ALT4为渗出液，反之为漏出液。ALT有两种不同活性的同工酶α(ALTs)、β(ALTm)，分别存在于细胞质及线粒体，后者的活性为前者的16倍。γ-GT的测定方法有数种，目前国内外多采用连续监测法测定血清γ-GT活性。用电泳法进行同工酶分析时，如显示的区带数与同工酶数不一致时，要特别注意巨分子酶的存在。4为渗出液，反之为漏出液。若同时测定一组性质不同的酶，比较各酶活性的变化，就能根据酶增高或减少的“谱型”做出诊断，此种同时检测一组酶，称为酶谱。测定步骤主要分为区带分离、活性显色和检测结果等。与传统的酶活性浓度测定法相比，这些免疫化学法具有灵敏度高、特异性强等特点，能用于一些不表现酶活性或无活性的酶测定，而且特别适用于同工酶的测定。急性尿潴留、变形性骨炎、癌肿骨转移及甲亢时ACP可轻度升高。碱性磷酸酶(ALP)广泛存在于各器官组织中，其含量以肝脏为最多，其次为肾脏、胎盘、小肠、骨骼等。酶是能催化生物体内化学反应的一类特殊蛋白质。(四)动力学分析法(五)蛋白酶水解法第七节临床常用血清酶、同工酶及其亚型分析

临床上可根据酶浓度的变化用以辅助诊断。若酶浓度变化由细胞坏死或细胞膜通透性变化引起，表示脏器或组织损伤；若为细胞内酶合成增加所致，提示组织再生、修复、成骨或异位分泌，或提示有恶性肿瘤的可能；若为酶排泄障碍引起者说明有梗阻存在。同工酶的分析与鉴定则能反应疾病的部位、性质和程度。由于酶广泛分布于全身各器官、组织，在血清中升高的机制又不尽相同，因此单凭某一酶的活性变化，很难做出独立诊断。若同时测定一组性质不同的酶，比较各酶活性的变化，就能根据酶增高或减少的“谱型”做出诊断，此种同时检测一组酶，称为酶谱。如：(1)心肌酶谱：传统的心肌酶谱由CK、AST、LD和α-HBD组成，这一组合在我国临床化学实验室一直应用至今。目前最简单而有效的心肌酶谱可由CK、CK-MB、CK-MB型或CK-MM型组成。近年来心肌酶谱在AMI的早期诊断中的应用价值受到了心肌肌钙蛋白的挑战。(2)肌酶谱：主要用于对骨骼肌疾病的诊断和监护。可供选择的酶有CK、LD、AST及其各自同工酶。若能再加CK-MM亚型则更为理想。(3)肝酶谱：主要是用来判断有无肝实质细胞损伤、肝内外胆汁淤积等肝胆疾病。(4)肿瘤酶谱：具有器官特异性的有ACP及其同工酶、ALP及其同工酶、γ-GT及其同工酶、AFU、AMY及其同工酶、LPS等；非器官特异性的有ALT、CK同工酶、ALD同工酶、LD同工酶等。(5)胰酶谱：主要用于急性胰腺炎的诊断和鉴别诊断。可供选择的有AMY及其同工酶、LPS、弹力蛋白酶-1、磷脂酶A2、尿胰蛋白酶原-2等。一、转氨酶及其同工酶(一)生物化学特性转氨酶是一组催化氨基在氨基酸与α-酮酸间转移的酶类，丙氨酸氨基转移酶(ALT)和(天)门冬氨酸氨基转移酶(AST)是其中最重要的两种。

AST广泛存在于多种器官中，按含量多少顺序为心、肝、骨骼肌和肾等，肝中70％存在于肝细胞线粒体中。AST有两种同工酶ASTs和ASTm，ASTs存在于可溶性的细胞质中,ASTm存在于线粒体中。细胞轻度损伤时ASTs升高显著，而严重损伤时，则ASTm大量出现于血清中。正常血清所含AST的同工酶主要为ASTs，但在病理状态下，如细胞坏死，则血清中以ASTm为主。血清AST活性升高，多来自心肌或肝脏损伤；肾脏或胰腺细胞损伤时，也可出现很高的AST活性。ALT大量存在于肝脏组织中，其次为肾、心、骨骼肌等。血清ALT活性升高，通常表示肝脏损伤。ALT有两种不同活性的同工酶α(ALTs)、β(ALTm)，分别存在于细胞质及线粒体，后者的活性为前者的16倍。肝细胞坏死血清中以ALTm为主。(二)测定方法

转氨酶的测定多用比色法，以赖氏法最常用。目前，国内外实验室多采用连续监测法进行测定。

ALT速率法测定中酶偶联反应式为：

ALTL-丙氨酸+α-酮戊二酸L-谷氨酸+L-丙酮酸LD丙酮酸+NADH+H+L-乳酸+NAD+

是否为抗酒石酸盐的非PAP增高为毛细胞性白血病的重要鉴别要点。而LPS升高者AMY不一定升高，约有2／3AMY正常的胰腺炎病人，其LPS正常；对于原因不明的高ALP血清水平，可测定同工酶以协助明确其器官来源。γ-GT的测定方法有数种，目前国内外多采用连续监测法测定血清γ-GT活性。与传统的酶活性测定法相比，免疫化学测定法的优点主要有：ALT有两种不同活性的同工酶α(ALTs)、β(ALTm)，分别存在于细胞质及线粒体，后者的活性为前者的16倍。若能再加CK-MM亚型则更为理想。酶活性单位有惯用单位、国际单位和Katal单位。AST主要存在于心肌，以往多用于AMI的诊断。由于酶广泛分布于全身各器官、组织，在血清中升高的机制又不尽相同，因此单凭某一酶的活性变化，很难做出独立诊断。非器官特异性的有ALT、CK同工酶、ALD同工酶、LD同工酶等。按检测方法分类主要方法有量气法、分光光度法、荧光法和放射性核素法、电极法等，以分光光度法最常用。此外，病毒、细菌、寄生虫感染引起的肌肉感染性疾病(如心肌炎、皮肌炎等)，都能引起CK升高。(2)肌酶谱：主要用于对骨骼肌疾病的诊断和监护。γ-GT的测定方法有数种，目前国内外多采用连续监测法测定血清γ-GT活性。γ-GT催化γ-谷氨酰基从谷胱甘肽(GSH)或其他含γ-谷氨酰基物质中转移到另一肽或氨基酸分子上。血清酶活性变化分为酶蛋白质量和酶活性同步变化及酶蛋白质量未变而酶活性变化若为细胞内酶合成增加所致，提示组织再生、修复、成骨或异位分泌，或提示有恶性肿瘤的可能；急性尿潴留、变形性骨炎、癌肿骨转移及甲亢时ACP可轻度升高。重度增加的有病毒性肝炎、中毒性肝炎等。二、γ-谷氨酰转移酶及其同工酶电泳法的使用最为广泛。酶活性单位有惯用单位、国际单位和Katal单位。脂肪酶(Lipase，LPS或LlP)是胰腺外分泌酶。一般CK-MB2>1.有助于相应组织病变的诊此外还可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳及毛细管电泳等技术进行分析。(一)生物化学特征在急性肝炎时，AST虽亦显著升高，但升高程度不及ALT，而在慢性肝炎，特别是肝硬化时，AST升高程度超过ALT。AST速率法测定中酶偶联反应式为：ALT速率法测定中酶偶联反应式为：②酶与其他蛋白质形成的复合物，如LD-β-脂蛋白；血清AST活性升高，多来自心肌或肝脏损伤；国内外目前测定AMY应用较多的是以麦芽多糖为底物的方法，如2-氯-对硝基苯麦芽三糖苷(CNP-G3)和亚乙基封闭的对硝基苯麦芽庚糖苷(4NP-C7)法(亦称EPS法)，以后者最常用，也是IFCC的推荐方法。用自动生物化学分析仪进行酶学测定时，要合理选择方法并进行参数的设置。酶是能催化生物体内化学反应的一类特殊蛋白质。酶活性浓度测定是临床酶学分析最为常用的方法。恶性肿瘤如转移到肝脏往往伴有LD4、LD5升高。④特别适用于同工酶的测定。即指基因在编码过程中由于翻译后修饰的差异所形成的多种形式的一类酶。第六节同工酶及其亚型测定胆碱酯酶(ChE)是一类催化酰基胆碱水解的酶类。AST速率法测定中酶偶联反应式为：ASTL-门冬氨酸+α-酮戊二酸草酰乙酸+L-谷氨酸MD

草酰乙酸+NADH+H+L-苹果酸+NAD+

上述偶联反应中，NADH的氧化速率与标本中酶活性呈正比，可在340nm检测吸光度下降速率。根据线性反应期吸光度下降速率(-△A／min)，计算出ALT、AST的活性浓度。(三)临床意义

ALT是反映肝损伤的一个很灵敏的指标，临床上主要用于肝脏疾病的诊断。各种急性病毒性肝炎、药物或酒精中毒引起的急性肝损害时，血清ALT水平可在临床症状(如黄疸)出现之前就急剧升高且ALT>AST。

急性肝炎时血清ALT高低与临床病情轻重相平行，且往往是肝炎恢复期最后降至正常的酶，是判断急性肝炎是否恢复的一个很好指标。假如能同时测定AST，并计算AST／ALT之比，则对于急、慢性肝炎的诊断、鉴别诊断以及判断转归也特别有价值。急性肝炎时比值<1，肝硬化时比值≥2，肝癌时比值≥30．重症肝炎时由于大量肝细胞坏死，血中ALT逐渐下降，而胆红素却进行性升高，出现所谓“酶胆分离”现象，常是肝坏死的前兆。AST主要存在于心肌，以往多用于AMI的诊断。AMI发病6～8h即升高，48～60h达到高峰，4～5d恢复正常。但由于AST在AMI时升高迟于CK，恢复早于LD，故诊断AMI价值不大。在急性肝炎时，AST虽亦显著升高，但升高程度不及ALT，而在慢性肝炎，特别是肝硬化时，AST升高程度超过ALT。胆道疾患时AST亦可升高。临床上血清ALT、AST表现为轻度增加的有胰腺炎、乙醇性脂肪肝、肝硬化、肉芽肿、肿瘤；中度增加的有传染性淋巴增多症、慢性活动性肝炎、肝外胆道梗塞、心肌梗死；重度增加的有病毒性肝炎、中毒性肝炎等。肝硬化、慢性活动性肝炎和心肌梗死常有AST>ALT。

二、γ-谷氨酰转移酶及其同工酶(一)生物化学特征γ－谷氨酰转移酶(γ-GT或GGT)又称γ-谷氨酰转肽酶，是一种线粒体酶。组织分布以肾脏含量最多，其次为胰、肺、肝等。血清中的γ-GT则主要来自肝胆，红细胞中几乎无γ-GT，因此溶血对其测定影响不大。γ-GT催化γ-谷氨酰基从谷胱甘肽(GSH)或其他含γ-谷氨酰基物质中转移到另一肽或氨基酸分子上。(二)测定方法

γ-GT的测定方法有数种，目前国内外多采用连续监测法测定血清γ-GT活性。IFCC参考方法采用L-γ-谷氨酰-3-羧基—对硝基苯胺作为底物，以甘氨酰甘氨酸(双甘肽)作为γ-谷氨酰基的受体。在pH7.7的条件下，γ-GT催化底物生成γ-谷氨酰双甘肽和黄色的2—硝基-5-氨基苯甲酸，在410nm波长处直接连续监测，吸光度的增高速率与γ-GT活性成正比关系。

(三)临床意义

γ-GT是肝胆疾病检出阳性率最高的酶。胆道疾病如胆石症、胆道炎症、肝外梗阻时，γ-GT不仅阳性率高，而且升高明显。肝实质疾病如肝炎、脂肪肝、肝硬化时γ-GT一般只是中度升高(ULN的2～5倍)，这点有助于肝胆疾病的鉴别诊断。若ALP升高而γ-GT正常可完全排除ALP的肝来源，若ALP和γ-GT均增加，则应先排除肝外引起γ-GT增加的原因，一旦排除，则γ-GT增高即为肝病所致。γ-GT还可用于判断恶性肿瘤有无肝转移，肿瘤患者如有γ-GT的升高，常说明有肝转移。γ-GT与乙醇的摄取量有关，饮酒时，由于乙醇对肝细胞线粒体的诱导导致γ-GT活性升高，故对乙醇性中毒的判定有相当的价值。长期接受巴比妥类药物、含雌激素的避孕药者常有γ-GT升高。

用醋纤膜电泳可将γ-GT同工酶分为γ-GTl、γ-GT2、γ-GT3和γ-GT4四种，正常人只见γ-GT2和γ-GT3。重症肝胆疾病和肝癌时常有γ-GTl出现，乙醇性肝坏死和胆总管结石时常有γ-GT2增加，胆总管结石及胰腺炎时γ-GT2也增加。γ-GT4与胆红素增高密切相关。三、肌酸激酶及其同工酶和亚型(一)生物化学特性

肌酸激酶(CK)催化肌酸和ATP或磷酸肌酸和ADP之间的磷酸转移的可逆性反应，所产生的磷酸肌酸含高能磷酸键，是肌肉收缩时能量的直接来源。CK广泛分布于全身，在骨骼肌含量最高，其次是心肌和脑。CK是由M和B两类亚基组成的二聚体。在细胞质内存在3种同工酶，即CK-BB(CK1)，CK-MB(CK2)和CK-MM(CK3)。在细胞线粒体内还存在另一CK同工酶，即所谓线粒体CK(CK-Mt)，也称CK4。各种CK同工酶还可进一步根据所带电荷和等电点不同分离数目不等的亚型。

(二)测定方法

CK的测定方法以酶偶联法最常用，是CK的参考方法.有两种工具酶及指示酶参与反应。原理如下：CK磷酸肌酸+ADP

肌酸+ATPHKATP+葡萄糖

6-磷酸葡萄糖+ADP

G6PD6-磷酸葡萄糖+NADP+

6-磷酸葡萄糖酸盐+NADPH+H+可在340nm波长下测定NADPH生成速率而计算CK活性浓度。

临床常规测定CK同工酶多用电泳和免疫抑制法，但两法均会受溶血和巨CK的干扰，免疫抑制法还会受到CK-BB的干扰。因此现在推荐用免疫化学方法直接测定CK—MBmass，可不受溶血和巨CK的干扰。CK同工酶亚型(CK-MM型和CK-MB型)多用琼脂糖凝胶高压电泳和等电聚焦电泳等。(三)临床意义

CK及其同工酶和亚型是目前临床上测定次数最多的酶之一，主要用于心肌、骨骼肌和脑疾患的诊断和鉴别诊断及预后判断。AMI时总CK活性升高显著，约在梗死后3～8h即升高，10～24h达峰值，3～4d恢复正常。CK极度升高(>3000U／L)主要见于全身疾病，特别是肌肉疾病，此时CK测定有助于肌萎缩病因的鉴别，如进行性肌萎缩时可见CK显著升高。此外，病毒、细菌、寄生虫感染引起的肌肉感染性疾病(如心肌炎、皮肌炎等)，都能引起CK升高。但神经疾病引起的肌萎缩，CK活性一般正常。CK-MM亚型测定对早期AMI的检出更为敏感，一般以CK-MM3／CK-MM1>1.0作为诊断AMI的标准，但必须排除急性骨骼肌损伤。AMI发病2～4hCK-MM3／CK-MM1即开始升高，8～12h达峰值。CK-MB2亚型在AMI早期诊断和判断有无再灌注上有很高的灵敏度和特异性。一般CK-MB2>1.9U／L或CK-MB2／CK-MBl>1.5可作为AMI的诊断标准之一。四、乳酸脱氢酶及其同工酶（一）生物化学特征乳酸脱氢酶(LD或LDH)催化乳酸氧化成丙酮酸，同时将氢转移给辅酶而成为NADH，依条件不同而有可逆性。反应式如下：L-乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+LD是一种含锌的糖酵解酶，广泛存在于人体各组织中，以肝、心肌、肾、肌肉、红细胞含量较多。第七节临床常用血清酶、同工酶及其AST主要存在于心肌，以往多用于AMI的诊断。0作为诊断AMI的标准，但必须排除急性骨骼肌损伤。另一类是用质量浓度单位，如用免疫学方法测定CK-MB酶质量(mass)(即蛋白量)，结果常直接用ng／ml或6μg／L报告。酶活性浓度测定是临床酶学分析最为常用的方法。LD同工酶都出现LDl／LD2>1，即所谓“反转比率”现象，且持续的时间长。AMI时，LD由于分子量较大，在常用心肌酶中升高最迟，通常在梗死8～18h升高，48～144h达峰值，可显著升高(>5ULN)，因其半寿期较长，增高持续时间可达5～10d，此时其他酶已恢复正常，在亚急性心肌梗死诊断上有一定价值。正常男性血清中ACP约主要来自前列腺，其余部分及女子血清中的ACP可能来自血小板、红细胞、白细胞及破骨细胞等。肝炎、休克、白血病、溶血性贫血及晚期恶性肿瘤等均可有中度或显著升高。①要制备足够量的提纯酶作为抗原和具有免疫化学性质的抗血清常常是很困难的，而且工作量很大；④特别适用于同工酶的测定。临床上以检测血清酶和同工酶应用最广，根据需要也可测定其他各种体液(如尿液、胸腔积液、腹水、脑脊液等)中的酶和同工酶或亚型。反应最后生成对硝基苯酚，其生成量在一定范围内与AMY活性成比，在405nm可以进行连续监测即可测出AMY的活性。草酰乙酸+NADH+H+L-苹果酸+NAD+碱性磷酸酶(ALP)广泛存在于各器官组织中，其含量以肝脏为最多，其次为肾脏、胎盘、小肠、骨骼等。酶活性浓度测定是临床酶学分析最为常用的方法。假如能同时测定AST，并计算AST／ALT之比，则对于急、慢性肝炎的诊断、鉴别诊断以及判断转归也特别有价值。分光光度法目前有两类比较常用：同工酶的分析与鉴定则能反应疾病的部位、性质和程度。性别、年龄、运动、妊娠、人种及环境因素等可引起人血清中某些酶的生理性变化。③酶亚基或酶分子之间形成的聚合物，如CK—Mt聚合物、LD亚基自身聚合等。酶可分为氧化还原酶类、转移酶类、水解酶类、裂解酶、异构酶类和合成酶类等六大类。LD是由两种不同亚基(M和H)组成的四聚体，形成5种结构不同的同工酶，即LD1(H4)，LD2(H3M)，LD3(H2M2)，LD4(HM3)和LD5(M4)。这5种同工酶大致可分为三类：一类以LD1为主，主要在心肌，可占总LD活性50％以上，也存在于红细胞内；另一类以LD5为主，以横纹肌为代表，肝脏中也有；第三类以LD3为主，存在于脾、肺。(二)测定方法

目前根据LD催化反应方向的不同，有两大类测LD方法，一大类为以丙酮酸为底物的逆向反应(称LD-P法)；另一大类以乳酸为底物的顺向反应(称LD-L法)。我国多采用目前IFCC参考方法LD-L法，用连续监测法进行测定。LD同工酶测定以琼脂糖凝胶电泳法更多用。一般成年人血中LD同工酶存在如下规律：LD2>LDl>LD3>LD4>LD5，部分正常儿童血中可见LDl>LD2。(三)临床意义

临床上测定LD及其同工酶常用于诊断和鉴别诊断心、肝和骨骼肌的疾病。AMI时，LD由于分子量较大，在常用心肌酶中升高最迟，通常在梗死8～18h升高，48～144h达峰值，可显著升高(>5ULN)，因其半寿期较长，增高持续时间可达5～10d，此时其他酶已恢复正常，在亚急性心肌梗死诊断上有一定价值。但其诊断AMI特异性差，运动后、肾病综合征等可呈现轻度升高(<3ULN)。肝炎、休克、白血病、溶血性贫血及晚期恶性肿瘤等均可有中度或显著升高。测定血清及胸腹水中LD含量常用来鉴别其为漏出液抑或渗出液，若胸水LD／血清LD>0.6、腹水LD／血清LD>0.4为渗出液，反之为漏出液。临床上测定LD同工酶有助于相应组织病变的诊断。心肌梗死和心肌炎时以LD1和LD2升高为主，且绝大多数的AMI患者血中LD同工酶都出现LDl／LD2>1，即所谓“反转比率”现象，且持续的时间长。

骨骼肌和肝细胞损伤时常出现LD5>LD4。肺、胰、脾、淋巴结坏死和炎症及各种恶性疾病时LD2、LD3、LD4升高；溶血性疾病时LD1和LD2升高，但仍为LD2>LD1；恶性肿瘤如转移到肝脏往往伴有LD4、LD5升高。五、碱性磷酸酶及其同工酶

(一)生物化学特征碱性磷酸酶(ALP)广泛存在于各器官组织中，其含量以肝脏为最多，其次为肾脏、胎盘、小肠、骨骼等。血清中ALP主要来自肝脏和骨骼。生长期儿童血清内ALP大多数来自成骨母细胞和生长中的骨软骨细胞，少量来自肝。尿中ALP并非来自血液，而是直接来自肾小管细胞。人体各组织ALP同工酶可分为3大类，即胎盘ALP、肠ALP和肝／骨／肾ALP同工酶。(二)测定方法

ALP的测定方法有多种，目前国内应用较多的方法为连续监测法，以磷酸对硝基酚(4-NPP)为底物，2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)或二乙醇胺(DEA)激活型缓冲液为磷酸酰基的受体。4-NPP在碱性溶液中为五色，在ALP催化下，4-NPP分裂出磷酸基团，生成游离的对硝基苯酚。后者在碱性溶液中转变成醌式结构，呈现较深的黄色。在波长405nm处连续监测吸光度增高速率，计算ALP活性。

(三)临床意义

在骨生长、妊娠、成长、成熟和脂肪餐后分泌等生理情况下，ALP活性可增高。除外上述生理性增高，临床上测定ALP主要用于骨骼、肝胆系统疾病等的诊断和鉴别诊断，尤其是黄疸的鉴别诊断。对于原因不明的高ALP血清水平，可测定同工酶以协助明确其器官来源。

急性肝炎包括病毒性肝炎和中毒性肝炎，ALP增高达2～5ULN，而肝硬化、胆石症和肿瘤引起的胆汁淤积，ALP增高达ULN的5～20倍。90％以上的肝外胆道阻塞患者血清ALP升高，升高的程度常和阻塞程度及病程成正比。如果血清中ALP持续低值，则阻塞性黄疸的可能性很小。若血清胆红素逐渐升高，而ALP不断下降表示病情恶化。肝外阻塞性黄疸、转移性肝癌、肝脓肿和胆石症时胆汁ALP检出率很高，并伴有肝ALP增加，而肝内胆汁淤积、急性肝炎、原发性肝癌等主要表现为肝ALP增多，大多数不出现胆汁ALP。各种疾病所致骨损伤等，均引起ALP活性升高，尤其是骨ALP同工酶增高。六、酸性磷酸酶及其同工酶

(一)生物化学特征酸性磷酸酶(ACP)存在于人体不同组织，如前列腺、红细胞等，主要存在于细胞的溶酶体中，以前列腺含量最多。正常男性血清中ACP约主要来自前列腺，其余部分及女子血清中的ACP可能来自血小板、红细胞、白细胞及破骨细胞等。ACP同工酶分前列腺ACP(PAP)和非前列腺ACP(如红细胞ACP、溶酶体ACP、破骨细胞或吞噬细胞ACP等)两大类，在前列腺中含有丰富的PAP，比其他组织约多100倍。测定标本应及时分离血清(浆)并尽早测定。(二)测定方法

ACP的测定底物、原理和方法与ALP相似，只是反应pH为酸性。国外多推荐使用磷酸百里酚酞为底物的比色法，因为PAP对此底物亲和力高，测定结果基本能反映ACP含量高低。此外还可通过用L-酒石酸这类抑制剂鉴别和估量PAP活性。由于ACP不稳定，酶活性测定困难，目前已发展一些免疫学方法特异而灵敏地测定ACP(特别是PAP)。(三)临床意义

ACP及其同工酶测定主要用于诊断前列腺癌。前列腺癌时血清ACP活性显著升高，前列腺癌患者血清PAP也明显增高，其中肿瘤分化较好者增高尤为显著。急性尿潴留、变形性骨炎、癌肿骨转移及甲亢时ACP可轻度升高。是否为抗酒石酸盐的非PAP增高为毛细胞性白血病的重要鉴别要点。

七、淀粉酶及其同工酶

(一)生物化学特征淀粉酶(AMY)：人和动物只含α-AMY。人体中胰腺含AMY最多，由胰泡细胞合成后通过胰管分泌人小肠，唾液腺也分泌大量AMY入口腔开始消化多糖化合物。AMY是一种需钙的金属酶，其最适pH在6.5～7.5之间，卤素和其他阴离子有激活作用。AMY分子量较小，易由肾脏排出，半寿期很短，约2h，所以病变时血清AMY增高持续时间很短。除肝素外，其他抗凝剂如枸橼酸、草酸盐及EDTA等都有抑制作用，故不宜用去钙血浆测定AMY。(二)测定方法

国内外目前测定AMY应用较多的是以麦芽多糖为底物的方法，如2-氯-对硝基苯麦芽三糖苷(CNP-G3)和亚乙基封闭的对硝基苯麦芽庚糖苷(4NP-C7)法(亦称EPS法)，以后者最常用，也是IFCC的推荐方法。反应最后生成对硝基苯酚，其生成量在一定范围内与AMY活性成比，在405nm可以进行连续监测即可测出AMY的活性。(三)临床意义

长时间以来，AMY水平一直作为评价胰腺外分泌功能的一种辅助诊断指标。人体胰腺和腮腺组织损伤时，血清和尿中的总AMY可显著增高，肾功能不全患者也有部分AMY增高。

在急性胰腺炎发病后2～3hAMY开始升高，多在12～24h达峰值，2～5d下降至正常。如持续性升高达数周，常提示胰腺炎有反复，或有并发症发生。而尿AMY约于发病后12～24h开始升高，下降也比血清AMY慢，因此在急性胰腺炎后期测定尿AMY更有价值。临床上检测AMY用于胰腺炎诊断时，应注意AMY增高幅度与病情不成比例，如原AMY已升高却发生与症状不相应的降低时，常为凶险的坏死性胰腺炎的预兆。AMY水平正常也不能完全排除急性胰腺炎。八、脂肪酶

(一)生物化学特征脂肪酶(Lipase，LPS或LlP)是胰腺外分泌酶。LPS可被巯基化合物、胆汁酸、Ca2+及辅脂肪酶等激活剂激活，而被重金属、丝氨酸所抑制。血清中LPS主要来自胰腺，少量来自胃肠粘膜。

(二)测定方法

迄今测定LPS的方法可分为3类：测定产物(游离脂肪酸)的增加(如滴定法、比色法、分光光度法、荧光法和pH电极法等)；测定底物的减少量(如比浊法、扩散法等)；测定LPS的实际质量(双抗体夹心免疫分析法、乳胶凝集法)。目前在国内大多实验室主要以滴定法、比浊法和分光光度法为主。

比浊法以橄榄油悬液为底物，其与水混合常呈乳糜状，血清中的LPS分解橄榄油乳剂生成水溶性的甘油和脂肪酸，浊度随之下降，根据浊度降低的程度，可计算出LPS活性浓度。此类方法可在400nm波长下比浊，测出因橄榄油乳剂的变化吸光度的变化。或者以340nm波长连续监测浊度的变化。以连续监测法为常用。分光光度法目前有两类比较常用：

一类为酶偶联显色比色法，多用1，2-甘油二酯为底物，在LPS和单酸甘油酯脂肪酶的催化下，水解生成甘油和脂肪酸，甘油通过甘油激酶作用生成3-磷酸甘油，再通过甘油磷酸氧化酶／过氧化物酶体系和4-AAP色素原体系产生紫红色。于550nm波长连续监测吸光度的变化即可计算LPS活性浓度。此类方法特异性高，通过双试剂也基本可解决内源性甘油的干扰问题。假如能同时测定AST，并计算AST／ALT之比，则对于急、慢性肝炎的诊断、鉴别诊断以及判断转归也特别有价值。于550nm波长连续监测吸光度的变化即可计算LPS活性浓度。三、肌酸激酶及其同工酶和亚型即指基因在编码过程中由于翻译后修饰的差异所形成的多种形式的一类酶。γ-GT是肝胆疾病检出阳性率最高的酶。绝大多数的AMI患者血中临床常规中以电泳法最常用。非器官特异性的有ALT、CK同工酶、ALD同工酶、LD同工酶等。4-NPP在碱性溶液中为五色，在ALP催化下，4-NPP分裂出磷酸基团，生成游离的对硝基苯酚。亚型指基因在编码过程中，由于翻译修饰差异所形成的多种形式的一类酶。测定LPS的实际质量(双抗体夹心免疫分析法、乳胶凝集法)。肝炎、休克、白血病、溶血性贫血及晚期恶性肿瘤等均可有中度或显著升高。酶活性浓度测定是临床酶学分析最为常用的方法。γ-GT是肝胆疾病检出阳性率最高的酶。有助于相应组织病变的诊长期接受巴比妥类药物、含雌激素的避孕药者常有γ-GT升高。碱性磷酸酶(ALP)广泛存在于各器官组织中，其含量以肝脏为最多，其次为肾脏、胎盘、小肠、骨骼等。非器官特异性的有ALT、CK同工酶、ALD同工酶、LD同工酶等。血清中的γ-GT则主要来自肝胆，红细胞中几乎无γ-GT，因此溶血对其测定影响不大。酶是能催化生物体内化学反应的一类特殊蛋白质。其中底物浓度对酶促反应的影响可用米-曼氏方程表示。另一类采用人工合成底物1,2-二月桂基-rac-丙三氧基-3-戊二酸试灵酯设计的连续监测法。该底物在碱性环境中，在LPS和辅脂肪酶作用下，水解生成1,2-二月桂基甘油和戊二酸-6’-甲基试卤灵。后者不稳定，可自发分解生成戊二酸和甲基试卤灵。甲基试卤灵在577nm波长附近有吸收峰，连续监测其吸光度变化可定量测定LPS活性浓度。此法具有简便、快速、灵敏、稳定和抗干扰能力强等特点。(三)临床意义

正常人血清LPS含量极少，但在急性胰腺炎时，2～12h血清LPS显著升高，24h至峰值，可达10ULN，甚至50～60ULN，至48-72h可能恢复正常，但随后又可持续升高8～15d。由于血清LPS在急性胰腺炎时活性升高的时间早，上升的幅度的大，持续的时间长，故其诊断价值优于AMY。临床观察发现，凡血清AMY升高的病例，其LPS均升高；而LPS升高者AMY不一定升高，约有2／3AMY正常的胰腺炎病人，其LPS正常；非胰腺炎的急腹症有血清AMY升高而LPS不升高。酗酒、乙醇性胰腺炎、慢性胰腺炎、胰腺癌、肝胆疾患等血清LPS可有不同程度的升高。

九、胆碱酯酶

(一)生物化学特征胆碱酯酶(ChE)是一类催化酰基胆碱水解的酶类。人体主要有两种，即乙酰胆碱酯酶(AChE)又称真性胆碱酯酶或胆碱酯酶Ⅰ、丁酰胆碱酯酶(BuChE)又称假性胆碱酯酶或称拟乙酰胆碱酯酶(PChE)或胆碱酯酶Ⅱ。临床常规检查的胆碱酯酶(SChE)即指后者，通常简称为ChE。

AChE主要分布于神经组织、肌肉、红细胞、肺等处，其生理功能是催化水解乙酰胆碱，能使神经细胞反复除极。ChE／BuChE主要在肝脏合成，也分布于胰脏、心脏、小肠粘膜、大脑灰质、血浆及淋巴液等处。ChE的真正生理功能至今尚未阐明。许多抑制剂对两种ChE有抑制作用，如生物碱(吗啡、毒扁豆碱)、枸橼酸盐、氟化物、有机磷杀虫剂等

(二)测定方法主要有两类方法用于临床常规ChE测定，一类以乙酰胆碱为底物，测定水解反应生成的酸。常用指示剂(如间-硝基酚或溴百里酚蓝)测pH法。特别是纸片法简便快速，适用于急诊有机磷中毒的快速筛查。但此类方法准确度较差。另一类以人工合成底物测定胆碱衍生物的生成。丁酰硫代胆碱法是目前测定血清ChE最常用的方法。测定原理如下：丁酰硫代胆碱+H2O

*又称Ellman试剂或简称DTNB

在405nm波长连续监测测定吸光度值的变化，即可计算血清ChE的活性浓度。本法简便、快速，易于自动化。但只能测定血清ChE，而不能测定红细胞AChE。