种鸡鸡毒支原体和滑液囊支原体病净化技术规范

种鸡鸡毒支原体和滑液囊支原体病净化技术规范范围本标准规定了种鸡群鸡毒支原体和滑液囊支原体病净化技术规范。本标准适用于曾祖代、祖代及非免疫父母代种鸡群鸡毒支原体和滑液囊支原体病的净化。本标准不适用于疫苗免疫鸡场。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T17999.4SPF鸡微生物学监测第4部分：SPF鸡血清平板凝集试验NY/T553禽支原体PCR检测方法NY/T1168畜禽粪便无害化处理技术规范NY/T5030无公害农产品兽药使用准则DB34/T2160鸡毒支原体感染防治技术DB63/T1652病害动物及病害动物产品无害化处理技术规程T/CVMA1禽白血病净化技术规范世界动物卫生组织（OIE）陆生动物诊断试验和疫苗标准手册术语与定义下列术语和定义适用于本文件。种鸡breedingchicken按照动物育种四系配套的原则，将鸡的遗传谱系分为曾祖代、祖代、父母代和商品代，只有曾祖代的鸡（原种鸡）可以自繁、自养和留种，而其他后代均必须按照四系配套的原则进行育种，且不能留做和它同级的种。种鸡（祖代和父母代）是经过不断地选种和选育，具有一定的生产、生长和遗传稳定性，能够提供子代，且按照育种组织制订的标准验收和鉴定并承认的鸡品种。按经济用途分为蛋用型、肉用型、肉蛋兼用型和观赏型。家禽疫病净化poultrydiseaseeradication在一个养禽场或指定的养殖区域内，通过持续不断的检测和监测，及时发现和淘汰患病禽群或带菌禽群，并通过及时淘汰感染禽群的方法，以实现根除某种家禽疾病的过程。诊断临床诊断鸡毒支原体病参照DB34/T2160的临床症状和病理变化。滑液囊支原体病流行特点感染通常见于4周～16周龄的鸡。鸡群的患病率一般为5%～10%，病死率不超过10%。临床症状引起的呼吸道症状不明显，受侵害部位在关节的滑液囊膜及腱鞘。出现关节肿胀、热痛、胸部龙骨上水疱、跛行甚至站不起来，从而造成雏鸡或青年鸡生长发育受阻，产蛋鸡生产性能下降，蛋壳质量变差、易碎。最初症状是鸡冠苍白、生长迟缓和关节肿胀，跗关节和爪垫是主要感染部位。随着病情的发展，出现鸡冠萎缩、羽毛粗乱、跛行甚至站立不起。呼吸系统感染滑液囊支原体症状轻微，但感染禽是带菌者。成年鸡群感染多表现为蛋壳质量变差、易碎。病理变化病禽主要表现为滑膜炎。在病情较轻时，在肿胀的关节部位可见到有多量黏稠的渗出液。严重时，可见到腱鞘处有黄白色囊状物，内有白色黏液，关节滑液囊或脚垫内有黏液性呈灰白色的乳酪样渗出物，有时关节软骨出现糜烂。趾关节和跗关节可见有异嗜性白细胞和纤维素浸润。病原分离培养对可疑鸡群进行支原体病原的分离培养，培养基配制、分离部位及培养条件等参照世界动物卫生组织（OIE）陆生动物诊断试验和疫苗标准手册相关内容进行。血清学检测对种鸡群鸡毒支原体和滑液囊支原体凝集抗体的检测，参照GB/T17999.4进行，在2min内出现凝集者为阳性；2min内不凝集者为阴性；介于上述两者之间为可疑，进行复核试验，如仍为可疑，判为阳性（见附录B）。核酸检测聚合酶链式反应（PCR）和环介导等温扩增技术（LAMP）方法可任选其一。试剂除非另有说明，仅使用分析纯试剂。实验室用水应符合GB/T6682的要求。2×TaqPCRMasterMixⅡ。10×LAMPAmplificationBuffer，-20℃保存。10mmol/LBetaine溶液：配制见附录A.1，-20℃保存。BstDNAPolymerase（6U/μL），-20℃保存，避免反复冻融。MgSO4（100mmol/L）：配制见附录A.2，-20℃保存。dNTP混合液（10mmol/L），-20℃保存，避免反复冻融。SYBRGreenⅠ核酸染料，4℃保存。DNAMarker2000，-20℃保存，避免反复冻融。开盖后于4℃保存不超过3个月。细菌基因组DNA提取试剂盒，4℃保存。标准菌株，采用的MG标准菌株为F-36株，采用的MS标准菌株为GX11-T株。仪器设备PCR扩增仪。台式高速冷冻离心机：转速≥12000r/min。微量移液器：2μL、10μL、100μL、200μL、1000μL。电子天平：精度0.01mg。恒温水浴锅或恒温金属浴。涡旋仪。生物安全柜。电泳仪。紫外透射反射分析仪。样品处理取咽喉棉拭子。将棉拭子样品悬浮于1mLPBS溶液中，混匀成悬浮液。DNA提取将棉拭子样品制成的混悬液4000r/min离心5min，将离心后的上清置于新的1.5mL离心管中，在4℃条件下，12000g离心20min，弃去上清液，并将沉淀物重新悬浮在25μL～50μL的0.1%焦碳酸二乙酯（DEP）水中。按细菌基因组DNA提取试剂盒说明书，提取DNA。聚合酶链式反应（PCR）方法鸡毒支原体和滑液囊支原体的PCR检测方法使用的引物及反应条件等参考NY/T553。环介导等温扩增技术（LAMP）方法引物依据鸡毒支原体（MG）的mgc2基因序列和滑液囊支原体（MS）的16SrRNA序列，分别设计LAMP引物，扩增长度约200bp。MG-F3：5’-ACACTTGTTTTACATGAAGGT-3’MG-B3：5’-CAACCATCTTTTGGTGTTCT-3’MG-FIP：5’-ACAATCAACCCAGCACCTGCGTTGGTCCAAGAAAGATTACCT-3’MG-BIP：5’-TGTTTCTTTACTCTTGGGTTTAGGGTCACGTTCTTGGATCATCA-3’MS-F3：5’-GCATTAAGCGGATCGGTT-3’MS-B3：5’-AACTGCTGCATCAAGAGC-3’MS-FIP：5’-TGTTGCTGCTGTGTATTTTTCTTCTGCAGTTAAAGATGATGCACAA-3’MS-BIP：5’-ACTAGAAGATGGAACAAAACTTGCAGCAGATTCTAGATCACTTTGAGT-3’LAMP反应条件所采用的试剂盒反应体系见表1。禽支原体LAMP反应体系反应组分体积10×AmplificationbufferⅡ2.5μLdNTP混合液（10mmol/L）4.0μLF3/B3（10μmol/L）0.5μL×2FIP/BIP（30μmol/L）1μL×2Betaine（10mmol/L）2μLDNA1μLBstDNAPolymerase（6U/μL）1μLMgSO4（100mmol/L）1μLddH2010.5μL取DNA模板1-5μL置于分别加入鸡毒支原体/鸡滑液囊支原体LAMP引物已配置好的上述试剂盒体系内，在管盖内壁加1mL1000×SYBRGreenⅠ，通过染料液滴本身的液体表面张力使得染料附着在管盖上，从而避免染料在反应过程中接触反应液抑制反应，关闭管盖时需注意避免用力过大防止染料滴入反应液。置于63℃水浴锅中，反应60min，80℃作用10min终止反应。结果判定瞬时离心LAMP反应管，使管盖内侧壁的SYBRGreenⅠ核酸染料与LAMP反应体系充分混匀。在自然光照下，阴性反应管不发生颜色变化，为橘红色，阳性反应管内液体变为黄色。反应管置于紫外透射反射分析仪下，阴性反应管不显现荧光，阳性反应管发出明亮的黄绿色荧光（见附录C）。净化检测规程曾祖代和祖代鸡出壳雏鸡的检测与处置雏鸡饲养管理参照T/CVMA1的方法，将种蛋隔离孵化，出壳后小批量隔离饲养，减少孵出的雏鸡相互之间的感染机会。样品的收集采集出壳后的雏鸡咽喉棉拭子，置于预先做好标记的1.5mL灭菌离心管，离心管中预先加入0.5mL样品稀释液，充分震荡摇均。每次对一只鸡采样后，应注意更换一次性手套或对双手进行消毒，方可进行另一只鸡采样，避免产生交叉的污染。核酸检测和病原鉴定将采集到的样品一分为二。一部分样品用于进行PCR或LAMP检测（二选其一）。PCR按照NY/T553禽支原体PCR检测方法进行。LAMP检测按照4.4.6方法进行。一旦发现样品的PCR或LAMP检测阳性，则立即对可疑样品的备份按照世界动物卫生组织（OIE）陆生动物诊断试验和疫苗标准手册进行病原分离和鉴定。检测鸡群处置淘汰所有PCR或LAMP检测阳性以及病原分离阳性的鸡，对于PCR或LAMP检测阳性但病原分离阴性的鸡也应淘汰，同时淘汰同居鸡。对检测为阴性的鸡群应维持小群饲养。育成期的检测和处置鸡群临床观察观察鸡群，对有4.1.1或4.1.2临床症状的可疑育成期鸡进行淘汰。抗体检测对全群100%采血，进行SPA血清学检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的抗体。淘汰所有的鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体阳性鸡。对可疑的鸡群进行下一步的病原核酸检测。对检测为阴性的鸡群应维持小群饲养。可疑鸡群病原核酸检测采集可疑鸡群的咽喉棉拭子样品进行PCR或LAMP，分别检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体。检测鸡群处置淘汰所有PCR或LAMP检测阳性的鸡。阴性鸡群应小群隔离饲养，作为后备育种鸡群。开产前鸡群的检测和处置鸡群临床观察观察开产前鸡群，对有4.1.1或4.1.2临床症状的可疑病鸡进行淘汰。抗体检测同5.1.2.2。可疑鸡群病原核酸检测同5.1.2.3。检测鸡群处置淘汰所有血清学检测阳性和PCR或LAMP检测阳性的鸡。对检测为阴性的鸡群应维持小群饲养，作为后备育种鸡群。留种前的预防用药和检测以及处置鸡群临床观察观察留种鸡群，对有4.1.1或4.1.2临床症状的可疑病鸡进行淘汰。鸡群检测在留种前，对全群100%采血。其余的检测按照5.1.2.2和5.2.2.3进行。淘汰所有PCR或LAMP检测阳性的鸡。对检测为阴性的鸡群作为育种鸡群。预防用药在留种前2周，按照7.2进行选择用药。种蛋的选留和孵化按照本标准5.1.1～5.1.4规定程序淘汰所有的阳性鸡后，每只母鸡仅选用1只检测为阴性公鸡的精液进行人工授精。按照育种规定的时间留足种蛋，对每只母鸡的种蛋进行标记。将每只母鸡的种蛋置于标记有该母鸡标号的专用孵化纸袋（纸盒）中，防止不同母鸡的种蛋直接接触，置于孵化器中的特定出雏箱中孵化出雏。种蛋上孵后，在孵化期内提升温度至45℃，维持14h，以消灭种蛋中可能的支原体，然后转入常规的孵化温度操作。父母代雏鸡的检测和处置采集进场后的雏鸡咽喉棉拭子，处理同5.1.1.2，分别进行PCR或LAMP，检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体。淘汰所有PCR或LAMP检测阳性的鸡。育成期鸡群的检测和处置同5.1.2。开产前鸡群的检测和处置同5.1.3。留种前的预防用药和检测以及处置同5.1.4。种蛋的选留和孵化按照本标准5.2.1～5.2.4规定程序淘汰所有的阳性鸡后，选用鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体检测为阴性公鸡的精液进行人工授精或自然交配，按照常规的标准选留种蛋。利用该批种蛋孵化出的雏鸡作为鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体净化后的商品代鸡群。净化周期启动和终止检测时间的选择曾祖代、祖代可以根据种鸡所处时期5.1.1～5.1.4的任何一个时间点启动净化程序。父母代应在祖代净化的基础上，再在5.2.1～5.2.4的任何一个环节启动净化程序。不同种鸡场可以根据其具体条件选择相关的检测技术，以提高鸡群检测的准确性，缩短净化周期。净化标准评估净化效果评估应按照国家农业行业主管部门制定的鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体病净化评估程序和净化评估标准。净化评估标准见附录D。净化后检测比例的调整按照6.2所列要求判定为种鸡达到鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体病净化状态的鸡群建议不再按照5.1.1～5.1.4或5.2.1～5.2.4的净化程序进行全部的检测，转为按照不低于10%的比例进行抽检，如果抽检不符合6.2所列要求，则必须按照5.1.1～5.1.4和5.2.1～5.2.4的程序进行全部的检测，重新进行净化。注意事项生物安全种鸡场地理位置应相对隔离，远离其他鸡场。在引进种蛋或鸡苗前，应先了解种禽场的净化情况，不能从有疫情的禽场引种。接触种鸡群的工作人员应固定化，避免其他鸡群的饲养员进入实施净化的鸡群中工作。禽舍在饲养前需经过垃圾清除、高压水枪冲洗、福尔马林熏蒸等消毒措施。应加强饲养管理，降低饲养密度，注意通风，保持舍内空气新鲜，防止过热过冷、湿度过高，定期清粪，防止氨气、硫化氢等有毒有害气体的刺激等。运送物品车辆以及人员出入，均应执行消毒制度，同时应尽可能降低种鸡场所需物品与外界的交流。每周进行2次～3次带鸡消毒喷雾，出现疫情时应每天进行带鸡消毒。应坚持“全进全出”制，最大限度地避免多日龄鸡群混养。对病死鸡、未出壳鸡胚、鸡粪和孵化场内废弃物按NY/T1168和DB63/T1652的要求进行无害化处理。药物的预防药物的使用应符合NY/T5030的要求。药物使用应以药物敏感试验结果为基础，选用高敏药物。推荐药物：泰乐菌素、泰妙菌素、北里霉素、恩诺沙星等，按标签说明剂量使用。档案管理做好种鸡鸡毒支原体和滑液囊支原体病净化工作记录，并归档保存。记录内容包括：平板凝集检测抗原购进和检测记录、LAMP或PCR检测记录、各净化阶段种鸡的留种与淘汰记录等（附录D）。记录保存2年。

（资料性附录）

试剂的配制10mmol/LBetaine溶液Betaine1.1715g灭菌水10mL即配置成1mol/L浓度，取10μL加DEPC水至1mL，制成10mmol/LBetaine溶液。100mmol/LMgSO4MgSO4.7H2O0.246g灭菌水1L

（资料性附录）

血清平板凝集试验判定标准血清平板凝集试验结果判定标准图见图B.1。血清平板凝集试验结果判定标准对照图（左为阳性，中为可疑，右为阴性）

（资料性附录）

LAMP反应结果判定可见光下LAMP反应结果判定可见光下LAMP反应阳性（绿色荧光）与阴性（橙黄色）对照图紫外光下LAMP反应结果紫外光下LAMP反应阳性（绿色荧光）与阴性（无荧光）对照图

（资料性附录）

鸡毒支原体病和滑液囊支原体病净化评估标准净化标准评估同时满足以下要求，视为达到净化标准：种鸡群抽检，鸡毒支原体和滑液囊支原体病原学检测均为阴性；连续两年以上无临床病例；种鸡群抽检，曾祖代、祖代鸡毒支原体和滑液囊支原体血清学抗体检测阳性率为0，父母代鸡毒