北中大中药化学实验指导

中药化学实验指导前言中药化学是一门实践性较强的课程，中药化学实验是本课程的重要组成部分。要想跟好的完成科研任务，不仅需要有良好的理论基础，而且还要熟练地掌握各项实验技能，本试验技能广泛用于中药专业的各个领域，与中药制剂、中药鉴定、中药炮制、中成药分析等有密切的联系。与学过的实验课相比，本试验课有其自己的特点：1.一个完整的实验要经过提取、分离、精制、鉴识四个基本过程，历程长，需要时间长。如实验一要用五次实验课完成。2.中药有效成分含量一般比较低，产率也很低，因此要求大家以认真、仔细、耐心的态度进行试验，培养良好的作风。本实验课看重训练同学们在中药化学方面的基本操作技能，用学到的理论知识解释实验原理及现象，培养独立解决实验问题的能力，因此要求实验前做好预习，实验中勤于动手，善于观察，积极思考，实验后认真总结，写出实验报告，提倡写心得体会，发表意见和建议。第一章中药化学实验注意事项中药化学实验室所用的溶剂、药品很多是易燃、易爆、有毒、有腐蚀性、刺激性的物质，实验操作又常常在加温或减压情况下进行，需用各种电源、电器及其他仪器，操作不慎会造成火灾、爆炸等事故，因此要严格遵守操作规程，谨防事故发生。1.实验前必须充分预习，搞清实验原理和操作程序，安排好实验计划，实验开始前应检查仪器是否完整、装置是否正确，合格后才能开始实验。2.实验过程中不能擅自离开，随时注意实验情况，保证实验正常进行，并及时做好实验记录。3.保持实验室内清洁、安静。实验台面要干净整齐。与实验无关的物品不得放在台面上，仪器用后应及时清洗，破损仪器要填写报告单，并注明原因。4.使用电器设备时应了解操作规程，不要用湿手触摸仪器。5.实验结束时应搞好各自台面的卫生，关好水、电，值日生要负责搞好整个实验室的卫生，关好水、电、门、窗。二、防火防爆注意事项1.倾倒和存放易燃、易挥发的有机溶剂时要远离火源，切勿倒于水池内，必须倒入一定容器内。2.不得在烘箱内干燥带有有机溶剂的仪器或物品。3.存放于冰箱中的有机溶剂必须置于带塞容器内，并应注明标签，定时清扫和检查。乙醚、石油醚等闪燃点低的溶剂不能置冰箱中保存。4.使用明火时，实验台面周围不得放置易燃性有机溶剂。5.回流或蒸馏易燃有机溶剂时，不能使用明火加热，应根据溶剂沸点选用水浴、油浴、砂浴或电热套，注意仪器装置切勿漏气，加入溶剂量不应超量，加热前要加入止爆剂。添加溶剂或补加沸石时必须停止加热，待降温后才能加入，否则会发生爆沸。6.乙醚闪燃点低，遇火易引起爆炸，而且在蒸馏过程中因其本身产生的过氧化物浓度增加易引起爆炸，所以在蒸馏乙醚时不要蒸干，或先用FeSO4的酸性水溶液洗涤后，再经水洗，脱水，然后再进行蒸馏。7.苦味酸一般也是易燃之物，一般保存于水中。8.万一不慎引起着火，应保持镇静，立即切断室内所有火源和电源，并移开周围的易燃物质。并视着火情况采取不同的灭火措施。三、防止中毒注意事项实验室中常用氯仿、甲醇、卤代甲苯、苯、苯胺、二硫化碳、汞、铅等及其化合物，均为有毒或剧毒药品，中毒途径一般为消化道、呼吸道及皮肤吸收，所以在应用时应注意：1.取用毒物时要注意，勿洒在容器外面，勿接触皮肤和口腔。2.室内应保持良好的通风状况。3.产生毒气的操作应在通风橱中进行。4.毒物不得随意乱倒。5.废溶剂不得倒入水槽，要倒入制定容器统一处理。四、急救常识1.硬伤：如为一般轻伤，应取出伤口中的碎玻璃或固体物，用蒸馏水冲洗后涂上红药水，用消毒纱布包好。大伤口则先按住住血管，急送医院。2.火伤：轻伤涂以硼酸凡士林，重伤送医院。3.试剂灼伤：酸：立即用大量水冲洗，再用3%碳酸氢钠溶液洗涤。碱：立即用大量水冲洗，再用1%醋酸溶液洗涤，眼睛用饱和硼酸溶液洗。附：常用易燃溶剂的分级及性质：易燃性溶剂比重沸点（℃）闪燃点（℃）着火点（℃）爆炸浓度（℃）分级名称Ⅰ乙醚0.7135-451801.9-3.7Ⅰ二硫化碳1.3046-30100Ⅰ苯0.8880-115381.4-8Ⅰ丙酮0.7957-185382.6-1.3Ⅱ乙酸乙酯0.9077-4427Ⅱ甲醇0.7965114276-37Ⅱ乙醇0.7978.314400-600Ⅱ煤油<165338注：1.闪燃点：简称闪点,指某种液体表面产生足够的蒸汽与空气形成可燃性混合物的最低温度。2.着火点：也称着火温度，指溶剂蒸汽与空气的混合物的爆炸温度。3.爆炸浓度：指溶剂蒸汽与空气的混合物的爆炸浓度（在空气中的百分浓度）。本实验常用仪器仪器名称规格数量仪器名称规格数量圆底烧瓶1000ml29#2抽滤瓶500ml1500ml29#2250ml1250ml19#2100ml1冷凝管30～40cm19#1大接小19#/29#2具塞三角瓶500ml2分液漏斗500ml2250ml2250ml2150ml2烧杯2000ml1100ml101000ml150ml10500ml210ml4100ml2布氏漏斗Φ12cm1抽滤垫1Φ5cm1层析柱2.5×25cm1蒸发皿1000ml1玻璃板5×15cm4100ml1层析槽2表面皿Φ10cm9玻璃小平皿1玻璃漏斗Φ15cm1减压蒸馏头19#1Φ6cm1减压接收管19#1量筒100ml1乳头吸管210ml1玻璃棒2牛角勺1小乳钵1减压用毛细管1试管10剪刀1抽松头19#1万能夹2钢铲烧瓶夹2双顶丝竹夹1铁圈螺旋夹1pH标准板试管架1每组公用仪器仪器名称规格数量仪器名称规格数量电炉800W1酒精灯1熔点测定管1干燥箱1恒温水浴1扭力天平1托盘天平500g1喷瓶4100g1皮老虎1pH试纸铁支台2附录一常用试剂的配制一、生物碱1.碘化铋钾（Dragendorff）试剂溶液Ⅰ：0.85g次硝酸铋溶于10ml冰醋酸及40ml蒸馏水中。溶液Ⅱ：8g碘化钾溶于20ml水中。贮备液：Ⅰ＋Ⅱ等体积混合（可在棕色瓶中保存较长时间，并可作沉淀试剂用）。喷雾液：1ml贮备液加2ml冰醋酸及10ml蒸馏水混合即得。2.碘化汞钾（Mayer）试剂将氯化汞1.35g及碘化钾5g分别溶于60ml及10ml蒸馏水中，混合二溶液，再加蒸馏水稀释至100ml。3.碘—碘化钾（Wagner）试剂1g碘及10g碘化钾共溶于50ml水中，加热加冰乙酸2ml，再用蒸馏水稀释至100ml。4.硅钨酸（Bertrand）试剂将硅钨酸5g溶于100ml蒸馏水中，加10％HCL使呈酸性反应。5.硫氰化铬铵试剂将雷氏铵盐2g溶于100ml蒸馏水中即得。二、黄酮、蒽醌、香豆精、内酯、酚类6.三氯化铝试剂1％三氯化铝乙醇溶液7.醋酸镁试剂0.5％Mg(Ac)2甲醇液8．三氯化铁试剂0.5％FeCl3水溶液或乙醇溶液，并加入少量HCL使呈酸性。9．锆—枸橼酸试剂溶液Ⅰ：2％二氯氧锆甲醇溶液溶液Ⅱ：2％枸橼酸甲醇溶液10．三氯化铁－铁氰化钾试剂溶液Ⅰ：1％eCl3水溶液或乙醇溶液溶液Ⅱ：1％铁氰化钾水溶液临用前Ⅰ、Ⅱ等体积混合。11．异羟肟酸铁试剂溶液Ⅰ：10％盐酸羟胺甲醇溶液溶液Ⅱ：10％氢氧化钾醇溶液溶液Ⅲ：1％三氯化铁水溶液12．重氮化试剂溶液Ⅰ：对硝基苯胺0.35g溶于5ml浓盐酸，缓缓倒入水中，并用水稀释至50ml。溶液Ⅱ：亚硝酸钠5g溶于70ml蒸馏水。临用前Ⅰ、Ⅱ等体积混合，放在冰水中备用。13．Gibb’s试剂0.5％2，6－二氯苯醌4－亚胺氯化物，临用前配制。三、甾体、强心苷、皂苷14．三氯化锑（Carr－price）试剂20％三氯化锑氯仿溶液15．五氯化锑试剂10％五氯化锑氯仿溶液，临用前新鲜配制。16．Legal试剂溶液Ⅰ：0.3％亚硝酰铁氰化钾水溶液溶液Ⅱ：10％氢氧化钠水溶液17．Kedde试剂溶液Ⅰ：2％3，5－二硝基苯甲酸乙醇溶液溶液Ⅱ：10％氢氧化钾甲醇溶液18．Baijet试剂将9ml1％苦味酸乙醇溶液和1ml10％氢氧化钠混匀，使用前配制。四、鞣质19．氯化钠明胶试剂白明胶1g溶于50ml水中（在60℃水浴中加热助溶），加入氯化钠10g，完全溶解后，用蒸馏水稀释至100ml。五、糖20．Feilling试剂溶液Ⅰ：硫酸酮结晶6.93g，溶于100ml水中。溶液Ⅱ：酒石酸钾钠结晶34.6g，氢氧化钠10g，溶于100ml水中。贮存于带橡皮塞的棕色瓶中，使用时将Ⅰ、Ⅱ等体积混合。21．苯胺－邻苯二甲酸试剂苯胺0.93g和邻苯二甲酸1.66g，溶于水饱和的正丁醇100ml中。喷后105～110℃烤1分钟。22．茴香醛－浓硫酸试剂浓硫酸1ml加到茴香醛0.5ml的乙酸液50ml中。23．α－萘酚试剂10％α－萘酚试剂（薄层显色用α－萘酚－硫酸试剂）：15％α－萘酚乙醇溶液21ml，浓硫酸13ml，乙醇37ml及水4ml混合即得，喷后105～110℃烤5～10分钟。六、氨基酸、蛋白质24．茚三酮试剂将0.3g茚三酮溶解于100ml正丁醇中，加入3ml冰乙酸，混合均匀。（或0.2g茚三酮溶于100ml乙醇中）。喷雾后，于110℃加热至呈色。25.双缩脲试剂将10g硫酸铜水溶液和40％氢氧化钠水溶液等量混合即得。（临用前配制）。26．吲哚醌溶于100ml乙醇中，加冰乙酸10ml，混匀。七、有机酸27．溴酚蓝乙醇溶液，用0.1NNaOH溶液调至微碱性。28．溴甲酚绿指示剂0.04％溴甲酚绿乙醇溶液，用0.1NNaOH溶液调至蓝色刚出现。八、通用显色剂29．碘蒸气在一个封闭得玻璃缸内先放入碘，缸内空间被碘蒸气饱和，将被检物得层析板放入缸内数分钟显色。30．硫酸试剂5％硫酸乙醇溶液，喷雾后，于120℃加热至显色。31．磷钼酸5～10％磷钼酸乙醇溶液，喷雾后，于120℃加热至显色。32．重铬酸钾－硫酸试剂5g重铬酸钾溶于100ml40％硫酸中，喷后于105℃加热至显色。附录二常用有机溶剂的精制1．石油醚为石油馏分之一，主要是饱和脂肪烃的混合物，极性极低，其中常含有不饱和碳氢化合物（主要是芳香族）。常用石油馏分根据沸点不同有下列数种：沸点（℃）比重轻石油醚35～600.59～0.62重石油醚60～900.65～0.66汽油90～1200.67～0.72工业规格的石油醚用浓硫酸（80ml/公斤），洗涤数次，再用少量稀NaOH水溶液洗，用水洗至中性，无水氯化钙干燥，重蒸，按沸程收集。2．苯沸点80.7℃，比重0.879，纯苯在5.4℃固化为结晶，常用此法以纯化。工业规格苯含有噻吩、吡啶等，其精制方法同工业石油醚。3．环己烷沸点80.7℃,比重0.779工业规格的环己烷所含杂质，主要是苯，可加浓硫酸及少量硝酸钾放置数小时后分去硫酸层，再以水洗，重蒸。如需绝对无水，再加金属钠脱水干燥。4．氯仿沸点61.2℃，比重1.489普通三氯甲烷含有约1％乙醇作稳定剂，可用稀NaOH溶液洗涤，再以水洗，无水氯化钙或无水碳酸钾干燥，重蒸。应装于棕色瓶中贮存于阴暗处，避免光化作用产生光气。5．乙酸乙酯沸点77.1℃,比重0.902工业用乙酸乙酯最常见杂质是水、乙醇和乙酸，用5％碳酸钠洗1～2次，继以无水氯化钙干燥，重蒸。6．丙酮沸点77.1℃,比重0.90工业丙酮加0.1%KMnO4摇匀放1～2天（或回流4hr）至KMnO4颜色不褪，以无水硫酸钠或无水氯化钙干燥，重蒸。7．乙醇沸点78.8℃,比重0.794工业乙醇用生石灰加热回流2～4hr，放置过夜，蒸馏，可得99.5%无水乙醇。8．甲醇沸点64.6℃，比重0.702一般重蒸即可，如含有醛酮，可用KMnO4大致测定醛酮含量，加过量的盐酸羟胺，回流4小时，重蒸。9．正丁醇沸点118℃，比重0.810用无水碳酸钾干燥后蒸馏。10．乙醚沸点34.6℃，比重0.713工业乙醚用硫酸亚铁或10％亚硫酸氢钠溶液振摇数次（除去过氧化物及水溶性杂质），以氯化钙干燥，重蒸。11．吡啶沸点115.4℃，比重0.983用氢氧化钾干燥后重蒸即得。

第二章基本实验项目实验一虎杖中蒽醌类成分及白藜芦醇苷的提取分离和鉴定虎杖系蓼科蓼属植物（Polygonumcuspidatumsieb.etzucc.）的根茎，又名阴阳莲。味苦，性微寒，具有泻下、健胃、清热、解毒之功。民间多用于消炎、杀菌、利尿、通经、镇痛，近年来用于烫伤、止血、消结石、降血脂的治疗。近年来用于治疗烫伤、止血、消结石和降低血脂均有疗效。虎杖根茎中含有大量的蒽醌成份和二苯乙烯类成份，后者具降血脂的作用。一、部分已知成分的理化性质1.大黄素（Emodin）：橙黄色长结晶（丙酮中为橙色，甲醇中为黄色），mp.256℃—257℃，能升华。其溶解度如下：Et2O0.14%，CCl40.01%，CHCl30.0718%，CS20.009%，乙醚0.14%；易溶于乙醇；可溶于氨水、Na2CO3和NaOH水溶液；几乎不溶于水。2.大黄素-6-甲醚（Physion）：金黄色针晶，mp.207℃，能升华。溶解性与大黄酚相似。3.大黄素-3-D-葡萄糖苷（Emodinmonoglucoside）mp.190℃—191℃，浅黄色针晶，（稀乙醇中结出，含一分子结晶水）。4.大黄素-6-甲醚-8-D-葡萄糖苷mp.230℃—232℃，黄色针晶（稀甲醇中结出）。5.白藜芦醇（resveratrol）：无色针状结晶。mp.256℃—257℃，261℃—264℃，能升华。易溶于乙醚、氯仿、甲醇、乙醇、丙酮等。6.白藜芦醇葡萄糖苷（polydatin,peceid）：又名3，4，5-三羟基芪-3-β-D-葡萄糖苷，mp.225℃，232℃（分解）。无色针状蔟晶。易溶于甲醇、乙醇、丙酮、热水；可溶于乙酸乙酯，稍溶于Na2CO3和NaOH水溶液，难溶于乙醚。UV：λMeOHmaxnm（logε）216（4.42），230sh（4.29），303（4.52），318（4.52）IR：υKBrmax（cm-1）3400，1600，1525，1470，1270，1185，1160，1100，1040，970，850，690附注：此化合物具顺反二种异构体，能互相转化，所得常是二者的混合物以反式为多，故前人工作中所报道的熔点有所不同，按本实验方法所得的白藜芦醇苷结晶含一分子结晶水，在130～140℃先融化，继续加热固化，至225～226℃全熔。二、实验目的 1.学习脂溶性成分（苷元）和水溶性成份（苷）的分离方法。2.学习用pH梯度萃取法分离酸性不同的蒽醌类成分。3.了解蒽醌类成分的一般性质和鉴别反应。三、实验原理根据游离蒽醌与苷溶解性能的差异，先用乙醚萃取出游离蒽醌等脂溶性成份，从而使脂溶性成分（苷元）和水溶性成份（苷）得到分离。再根据虎掌中蒽醌类成分由于结构中酚羟基数目及位置不同而成不同强度的酸性，用碱性递加的的水溶液（5%NaHCO3，5%Na2CO3，2%NaOH）自乙醚中提出不同酸性强弱的游离蒽醌类成分，达到分离的目的。四、提取分离流程五、溶剂、试剂、展开剂及显色剂1.原料：虎杖粗粉50g2.溶剂：90-95%乙醇500ml，80%乙醇200ml，乙醚500ml，CHCl3，MeOH各50～100ml。3.试剂：HCl，NaHCO3，Na2CO3，NaOH，无水硫酸钠，活性炭（2g），Al2O3（30g），硅胶G。4.展开剂：（1）石油醚（bp30～60℃）-甲酸乙酯-甲酸（15:5:1，上层）15ml。（2）氯仿-甲醇（9:2）5.显色剂（1）5%KOH/MeOH液（2）1%FeCl3-1%铁氰化钾（1:1）6.定性试剂2%NaOH，0.5%Mg（Ac）2六、实验方法1．乙醇总提取物的制备取虎杖粗粉50g，用90～95%乙醇回流提取二次（200ml1h；150ml1h），过滤合并乙醇液，如有沉淀，抽滤，滤液减压回收乙醇至无醇味，得乙醇总提取物。2．总游离蒽醌的提取将上述提取物，加入15ml水稀释至分液漏斗中，用乙醚萃取（25ml×2，20ml×4），合并乙醚液即为总游离蒽醌。乙醚萃取后的水层含有水溶性成分。3．游离蒽醌得分离（1）大黄素的分离上述乙醚液移至分液漏斗中，用5%NaHCO3水溶液萃取3～4次（20ml×2，15ml×1～2），弃去NaHCO3液。乙醚溶液再用5%Na2CO3水溶液萃取7～9次（25ml×2，20ml×2～3，15ml×3～4）。合并Na2CO3萃取液，挥去碱液中的乙醚，碱液在搅拌下慢慢滴加6NHCl调PH=2，稍放置，抽滤，沉淀水洗至中性，干燥，称重。沉淀物用20ml环己烷-丙酮（7:3）溶解后，经硅胶柱层析（15g），环己烷-丙酮（7:3）洗脱，流速约4～5ml/min，洗脱至橙色色带洗下即可，收集洗脱液，回收溶剂至干，残留物加少量乙醇溶解，得大黄素乙醇液。（2）大黄素-6-甲醚的分离以上用Na2CO3萃取过的乙醚溶液再用2%NaOH水溶液萃取4～5次，每次10ml，合并NaOH液，干燥、挥去碱液中的乙醚，碱液在搅拌下慢慢滴加6NHCl调PH=2，稍放置，抽滤，沉淀水洗至中性，干燥，称重，得大黄素-6-甲醚粗品。（3）中性脂溶性成分的分离上述NaOH萃取过的乙醚液，用水洗至中性，再用无水Na2SO4脱水，回收乙醚得残留物，即得中性脂溶性成分。4．白藜芦醇苷的分离：取“2”中乙醚萃取过的水层，挥去乙醚，置烧杯中加水至150ml，搅拌混合后，加热10min，放冷过滤，滤液加活性炭2g，煮沸20分钟，趁热过滤，滤液放冷后置分液漏斗中，用乙酸乙酯萃取5～7次（40×2～3，30×3～4），合并乙酸乙酯萃取液回收溶剂，残留物用适量80%乙醇溶解，经Al2O3柱层析（中性Al2O3100～200目，装柱15cm，柱径2cm，干法装柱）净化，80%乙醇洗脱（约100ml），洗脱液回收至干，加1ml水及5ml乙醇，加热溶解（需要过滤时须趁热过滤）。滤液放置，析晶，鉴识。5．鉴识A．层析法鉴定：（1）游离蒽醌的硅胶GTLC对照品：大黄素、大黄素甲醚样品：自制大黄素、大黄素甲醚乙醇液展开剂：石油醚(bp30～60℃)—甲酸乙酯—甲酸（15:5:1），上层。显色剂：a.紫外灯下观察荧光b.5%KOH甲醇溶液（2）白藜芦醇苷的硅胶GTLC对照品：白藜芦醇苷样品：自制白藜芦醇苷乙醇液展开剂：CHCl3-MeOH（9:2）显色剂：a.紫外灯（365nm）下观察荧光b.5%KOH甲醇溶液B．定性反应—游离蒽醌的反应分别取大黄素、大黄素甲醚少许，乙醇2ml溶解，做如下反应：a：Borntrager反应：取试液1ml，滴加2%NaOH溶液，观察颜色。b：Mg(Ac)2试剂：取试液1ml，滴加5%Mg(Ac)2溶液2—3滴，观察颜色。七、实验安排本试验共分4.5次完成。第一次：乙醇总提取物的制备第二次：总游离蒽醌的提取；游离蒽醌的分离第三次：白藜芦醇苷的分离（开始至“残留物用适量80%乙醇溶解”）；大黄素的重结晶第四次：白藜芦醇苷的分离（残留物乙醇液经Al2O3柱净化至放置结析晶）；大黄素结晶的过滤、洗涤、称重；定性反应；层析板的涂铺（2块）第五次：游离蒽醌、白藜芦醇苷的层析鉴识；（实验二芦丁的提取）八、思考题1．pH梯度萃取法的原理是什么？适用于哪些中草药成分的分离？2．根据薄层色谱结果分析各蒽醌类成分的结构与Rf值的关系。3．试说明各显色反应机制。4．试总结萃取操作程序及注意事项。5．结晶及重结晶操作的关键步骤是什么。6．过滤方式有几种？怎样选用?7．活性碳脱色在什么溶剂中效率最高？8．本试验中，在水与亲脂性有机溶剂萃取前，为什麽水液必须浓缩至无醇味。

实验二槐花米黄酮苷及苷元的提取和鉴定槐花米系豆科槐属植物（Sophorajaponica.L）的花蕾。历来作为止血药物治疗痔、子宫出血、吐血、鼻衄等。其所含主要成分为芦丁（Rutin，亦称芸香苷），其含量高达12～16%。药理试验证明芦丁有调节毛细血管渗透作用，临床用于治疗毛细血管性止血药，作为高血压症的辅助药物。芦丁广泛存在于植物中，现已发现含芦丁的植物达70种以上。一、主要黄酮类成分的物理性质（1）芦丁（芸香苷，Rutin）淡黄色针状结晶，熔点：含三分子结晶水物174℃—178℃；无水物为188℃。芦丁溶解度见下表：水甲醇乙醇吡啶冷0.00431.00.368.5热0.5511.23.5易溶不溶于乙醚、氯仿、石油醚、乙酸乙脂、丙酮等溶剂。易溶于碱液且呈黄色，酸化后复析出。可溶于浓硫酸和浓盐酸且呈棕黄色，加水稀释复又析出。UV：λMeOHmaxnm（logε）259，266sh，299sh，359(2)槲皮素（Quercetin）：黄色结晶，熔点：含两分子结晶水物313℃—314℃，无水物316℃。溶解度：乙醇1:290，无水乙醇1:23(沸时)，可溶于甲醇、乙酸乙脂、冰醋酸、吡啶、丙酮等溶剂，不溶于水、乙醚、苯、氯仿、石油醚。UV：λEtOHmaxnm（logε）255，269sh，301sh，370二、实验目的1．了解黄酮类化合物的一般性质。2．学习聚酰胺TLC法在黄酮类化合物中的应用。3．掌握由黄酮苷水解制取黄酮苷元的方法及糖的检识方法。。4．通过测定芦丁及槲皮素的紫外光谱，进一步了解如何利用紫外光谱对黄酮类化合物进行结构测定。三、实验原理1．利用芦丁可溶于热水，难溶于冷水的性质进行提取、精致。2．黄酮苷可通过酸水解得到苷元和糖，并可通过TLC、PC及乙酰化合物制备进行检识。3．不同黄酮类化合物对紫外光有特定吸收，可利用此对其进行结构测定。四、提取精致流程五、溶剂、试剂、展开剂及显色剂1.原料：槐花米30g2.试剂：1%H2SO4100ml，BaCO3，甲醇50ml，醋酐，浓H2SO4，95%乙醇，层析纸，聚酰胺薄膜（3×10cm），硅胶3.标准品：葡萄糖，鼠李糖，芦丁，槲皮素4.展开剂：（1）80%乙醇（2）n-BuOH-HAc-H2O(4:1:5)上层液15ml（3）n-BuOH-HAc-Alc-H2O(4:1:1:0.25)5.显色剂：苯胺—邻苯二甲酸盐试剂，浓氨水，1%AlCl36.定性试剂：10%α-萘酚溶液，浓H2SO4，浓HCl，镁粉，FeCl3乙醇液，1%Mg（Ac）2甲醇液，1%AlCl3乙醇液，2%ZrOCl2甲醇液，2%柠檬酸甲醇液。六、实验方法1.芦丁的提取称取槐花米30g，研碎后，置烧杯中，加热水（50℃以上）300ml，煮沸15分钟，趁热过滤，滤渣再分别用200ml热水煮提两次，每次10分钟，趁热过滤，放置过夜，可析出大量沉淀，等沉淀完全，滤取沉淀，放置自然干燥，即得芦丁粗品。2.芦丁的精制上述沉淀称重后加入100倍量的热水溶解，趁热过滤，放冷析出结晶，结晶自然干燥（或在红外灯下干燥），得芦丁水精制品。3.芦丁的水解称取芦丁水精制品0.5g，置250ml圆底烧瓶中加1%H2SO4（V/V）50ml，直火回流30分钟（注意观察现象），放冷过滤（滤液留作糖的鉴识），沉淀物为芦丁苷元—槲皮素的粗品，水洗至中性用60%乙醇（70～80倍量）重结晶，干燥称重，得槲皮素精品。4.糖的检识（PC和TLC）取水解滤液20ml，水浴上加热，加固体BaCO3中和至中性（不断搅拌下进行），滤除白色BaSO4沉淀，滤液蒸干后加2～3ml甲醇溶解，作层析检识样品溶液。

对照品：葡萄糖，鼠李糖TLC吸附剂：硅胶

展开剂：PC：n-BuOH-HAc-H2O(4:1:5)上层液TLC：n-BuOH-HAc-Alc-H2O(4:1:1:0.25)显色剂：苯胺-邻苯二甲酸盐试剂，喷雾后，105℃加热5～10分钟至显棕色或棕红色斑点。5.芦丁及槲皮素的聚酰胺TLC吸附剂：聚酰胺-6薄膜

对照品：芦丁、槲皮素标准品的甲醇溶液

样品：1%芦丁、槲皮素的甲醇溶液展开剂：80%乙醇显色剂：1%AlCl3乙醇液显色后，紫外光（365nm）下观察。6.槲皮素乙酰化物的制备称取精制槲皮素5mg置10ml干燥三角瓶中，加5ml醋酐和一滴H2SO4振摇，完全溶解后放置24h，倾入30ml冷水中，不断搅拌，则析出白色结晶。滤取沉淀洗涤，以90～95%乙醇重结晶，得槲皮素五乙酰化物的白色结晶。7.芦丁及苷元的的定性反应

（1）样品制备：取芦丁及槲皮素精品约10mg（豆粒大）用5mlMeOH溶解。（2）定性反应A：Molish反应加10%α-萘酚溶液1ml，振摇后斜置试管，沿管壁滴加0.5ml浓H2SO4，静置观察液面交界处颜色变化。B：盐酸镁粉反应取芦丁（槲皮素）溶液少许，分别置于试管中，加浓盐酸，再各加入镁粉，观察颜色变化。C：FeCl3反应取芦丁（槲皮素）溶液少许，分别置于试管中，分别加FeCl3乙醇溶液1～2滴，观察颜色变化。D：Mg（Ac）2纸片反应取2张滤纸片，分别滴2滴芦丁，槲皮素甲醇液，然后各加1%Mg（Ac）2甲醇溶液2滴，于紫外灯下观察荧光变化。E：AlCl3纸片反应取2张滤纸片，分别滴2滴芦丁，槲皮素甲醇液，然后各加1%AlCl3乙醇溶液2滴，于紫外灯下观察荧光变化。F：锆盐—柠檬酸反应分别加入2%ZrOCl2甲醇溶液3～4滴，观察颜色。然后加入柠檬酸甲醇溶液3～4滴，观察颜色。8.芦丁及槲皮素的的紫外光谱测定（1）试液的配制

A.无水甲醇：用分析纯甲醇加入10%氧化钙放置24h。然后蒸馏，即得。B.甲醇钠溶液：取0.25g金属钠切碎，小心加入10ml无水甲醇（此液置玻璃瓶中，用橡皮塞密封）。C.AlCl3溶液：取1g无水AlCl3小心加入甲醇20ml，放置24h，全溶即得。D.醋酸钠：采用试剂级无水粉末醋酸钠。E.硼酸饱和溶液：将试剂级无水硼酸加入适量无水甲醇制成饱和溶液。（上述各溶液可贮存6个月）（2）测定方法精密称取芦丁、槲皮素各10mg，分别用甲醇溶解，并稀释至100ml，从中吸取5ml，置50ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度（10μg/ml）。A.样品甲醇溶液光谱去样品液置石英杯中，在200～400nm内扫描。重复操作一次，观察紫外光谱。B.甲醇钠光谱取样品液置石英杯中，加入甲醇钠溶液3滴，立即测定。放置5min后再测一次。C.AlCl3光谱在盛有样品液的石英杯中滴加6滴AlCl3溶液，放置1min后测定，然后加入3滴HCl溶液（HCl-H2O=1:1），再进行测定。D.醋酸钠光谱取样品溶液3ml，加入过量的无水醋酸钠固体，摇匀（杯底剩有约2mm厚的醋酸钠）。加入醋酸钠后2min采用试剂级无水粉末醋酸钠。E.NaAc/H3BO3方法Ⅰ.在测定用的盛有检品及NaAc液的石英杯中加入足够量的无水硼酸粉末,使成饱和溶液进行测定(本法适用于在加入NaAc5min后无分解现象的样品)方法Ⅱ.于样品液（约3ml）中加入5滴H3BO3溶液，然后迅速加入无水NaAc粉末饱和，立即测定。七、实验安排本实验共分2.5次完成。第一次:芦丁的提取；（实验一游离蒽醌、白藜芦醇苷的层析鉴识）第二次:芦丁的精致；芦丁的水解，槲皮素乙酰化物的制备第三次:糖的层析检识；芦丁及槲皮素的聚酰胺TLC；芦丁及槲皮素的定性反应；芦丁及槲皮素的的紫外光谱测定八、思考题1.一般提取液需经过适当浓缩，分离净化才能得到化合物的粗品，为什么芦丁不经过这些处理就能得到粗品？2.酸水解常用什么酸，为什么用H2SO4比用HCl水解后处理更方便？3.当反应试剂组成是2个以上时，常需考虑试剂加入的顺序，试分析盐酸-镁粉反应。4.制备槲皮素的乙酰化物为何加浓H2SO4？5.本实验中各种层析原理是什么？解释化合物结构与Rf值得关系。6.黄酮类化合物有哪些提取方法？芦丁的提取还可以用什么方法？7.试讨论苷类成分的鉴定顺序，分析示教所做的紫外光谱图。

实验三粉防己生物碱的提取、分离和鉴识粉防己亦称汉防己,为防己科植物汉防己（Stephaniatetrandra）的干燥根，是临床常用中药。具有祛风湿、止痛、利水消肿、泻下焦湿热等功效。现代药理实验研究表明，汉防己总生物碱具有镇痛、消炎、降压、肌肉松弛以及抗菌、抗肿瘤作用，为主要有效成分。粉防己中生物碱含量高达5%~2.3%，其中主要为汉防己甲素（tetrandrine）和汉防己乙素(fangchineline，又称防己诺林)，还含少量的轮环藤酚碱（cyclanoline）。它们的物理性质如下：1.汉防己甲素和汉防己乙素均为双苄基异喹啉衍生物，氮原子呈叔胺状态。汉防己甲素R=CH3汉防己乙素R=H汉防己甲素为无色针状结晶，丙酮中结晶有双熔点：126～127℃/217～218℃。即，在126～127℃先融化，继续加热至153℃固化，温度上升至217～218℃全熔。不溶于水，石油醚，易溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂及稀酸水溶液。UV：λ0.01NHClmax280nm（ε6887）IR：υKBrmax（cm-1）3050，2800，1605，1580，1235，1215，840汉防己乙素为细棒状结晶，同样有双熔点现象，丙酮中结晶mp134～136℃/238～240℃，甲醇中结晶mp177～179℃/238～240℃。溶解度与汉防己甲素相似，，但极性稍大，故在冷苯中溶解度小于汉防己甲素，而在乙醇中的溶解度大于汉防己甲素。具有隐性酚羟基，不溶于NaOH溶液。2.轮环藤酚碱轮环藤酚碱氯化物无色八面体状结晶，mp214～216℃碘化物无色绢丝状结晶，mp185℃苦味酸盐黄色结晶，mp154～156℃轮环藤酚碱为水溶性季铵型生物碱，不溶于低级性有机溶剂。UV：λMeOHmaxnm（logε）223（4.18），286（3.88）IR：υKBrmax（cm-1）3200，1610，1580，1500，1280，1245，885，800一、实验目的掌握生物碱的乙醇提取方法以及脂溶性生物碱与水溶性生物碱分离。脂溶性碱中酚性碱与非酚性碱的分离，水溶性碱与水溶性杂质的分离。学习用吸附柱层析法分离生物碱。学习生物碱的鉴识方法如：色谱法，化学法等。二、实验原理根据大多数生物碱或生物碱盐能溶于乙醇的通性，用乙醇回流提取法提取总碱，利用季铵型生物碱易溶于水，不溶于亲脂性有机溶剂的性质用溶剂萃取法分离脂溶性生物碱和水溶性生物碱，利用汉防己甲素、乙素极性的差别，用吸附柱层析法分离二者。利用季铵型生物碱可与雷氏铵盐产生沉淀的性质使其与其它水溶性成份分离。三、分离流程防己粗粉乙醇回流提取乙醇提取液减压回收乙醇浓缩物酸水溶解，过滤酸水液氨水碱化（PH9~10）乙酸乙酯－环己烷萃取碱水层有机层过滤水洗至中性酸化（PH3~4）回收溶剂酸水液抽松加雷氏铵盐抽松物（称重）过滤丙酮溶解沉淀Al2O3拌样干燥样品丙酮溶解Al2O3柱层析分离过滤环己烷－丙酮洗脱丙酮液Al2O3柱层析净化汉防己甲素汉防己乙素丙酮-水洗脱洗脱液回收丙酮Ag2SO4处理BaCl2沉淀,过滤轮环藤酚碱盐酸盐四、实验材料1.原料：粉防己粗粉：100g2.溶剂：90～95％乙醇550ml；丙酮100ml；环己烷200ml；乙酸乙酯200ml。3.试剂：盐酸；NaOH；浓NH3˙H2O少许；雷氏铵盐饱和水溶液50ml；0.5％Ag2SO4；10％BaCl2；碱性Al2O3（100～200目）20g；固体NH4Cl；无水硫酸钠；碘甲烷0，5ml；pH试纸少许；硅胶G。4.显色剂：改良Dragendroff试剂5.定性试剂：碘－碘化钾试剂；苦味酸饱和液；硅钨酸试剂；碘化铋钾试剂五、实验方法（一）总生物碱的提取称取粉防己粗粉100g置500ml圆底烧瓶中，加90～95％EtOH回流提取二次（300ml，1小时；250ml，45分钟），过滤，二次提取液合并，减压回收乙醇至无醇味，得提取物。（二）分离1.亲脂性生物碱与水溶性生物碱的分离在（一）所得提取物中加入1％的盐酸约100ml充分搅拌使生物碱溶解，放置，过滤，滤渣用水洗涤一次后弃去。滤液合并后移至500ml分液漏斗中加70ml乙酸乙酯-环己烷（3:1）混合溶剂，再滴加浓氨水调PH9～10，（此时再向水层滴加浓氨水至再无沉淀析出），振摇萃取，静置分层后放出乙酸乙酯-环己烷（3:1）层，碱水层再以新的乙酸乙酯-环己烷（3:1）萃取4次（50ml×1，40ml×3次），最后一次萃取的乙酸乙酯-环己烷（3:1）层中应基本没有生物碱时，认为乙酸乙酯-环己烷（3:1）萃取基本完全（取乙酸乙酯-环己烷层液滴在滤纸上，Dragendroff试剂显色不明显为止）。合并乙酸乙酯-环己烷液即为亲脂性生物碱的提取液，碱水层则为水溶性生物碱提取液。乙酸乙酯-环己烷层用蒸馏水洗至中性，回收溶剂后，残留物抽松，称重,即得脂溶性总生物碱。2.季铵型生物碱的分离纯化“1”项中得到的碱水液过滤，滤液加6NHCl调PH3~4，过滤，滤液加雷氏铵盐的饱和水溶液至不再生成沉淀为止。滤取沉淀，少量水洗涤，抽干，自然干燥。称重，用此沉淀的20倍量(CH3)2CO溶解，自然过滤，滤去不溶物，丙酮液通过Al2O3柱除杂质（Al2O3约10g干法装柱），并用稀丙酮（丙酮:水＝5:1）洗至流出液色极浅为止。再此洗脱液中加入0.5％Ag2SO4溶液至不再生成沉淀（记录所用Ag2SO4的毫升数）。放置，自然过滤，弃去沉淀。滤液回收大部分丙酮，放冷（如有沉淀物再过滤）小心加入与Ag2SO4等mol的2％BaCl2溶液，放置，自然过滤，滤液转入蒸发皿中，水浴上浓缩至小体积（约2～3ml），趁热转入小三角瓶中，放置析出无色结晶，得轮环藤酚碱盐酸盐。如有必要可用H2O重结晶一次。分子量：Ag2SO4311.80BaCl2203.253.汉防己甲素和乙素的分离纯化吸附剂：碱性Al2O3100～200目，Ⅱ～Ⅲ级，20g,层析柱：2.5×25cm样品：拌样。取“1”中所得抽松物200mg用少量丙酮溶解，取0.5～1gAl2O3吸附剂于小蒸发皿中，边滴加样品的丙酮溶液于吸附剂中分散均匀，边加热挥去丙酮，研细待用。装柱：干法装柱或湿法装柱都可以。洗脱剂：环己烷-丙酮（2:1）。将吸附有样品液的Al2O3加于柱顶，倒入洗脱剂，进行层析分离，流速控制在约5ml/分钟，收集各流份约20ml/份，共收集8份。各流份回收溶剂，用硅胶GTLC检查，合并相同的流份，回收溶剂至干，分别用(CH3)2CO重结晶1～2次，可得汉防己甲素、乙素精品。附：（1）湿法装柱法：取吸附剂20g左右于烧杯中，加洗脱剂一定量湿润，搅匀。半打开层析柱活塞，控制流速，将吸附剂缓缓倒入柱内，待其自然沉降后即可，柱顶留1cm左右洗脱剂，倒入拌好的样品，敲平（此时洗脱剂不能被样品吸干，应有余量）。即可开始层析。（2）干法装柱：打开柱活塞，均匀倒入干的吸附剂敲平，然后倒入拌样的吸附剂再敲平，沿柱壁均匀加入洗脱剂，待流出第1滴流出液时，加满洗脱剂，开始层析。（3）硅胶GTLC制备与层析：铺板：板规格15×5cm，一块板用吸附剂1～1.5g，加0.3％CMC水溶液3～4.5ml,在乳钵中研匀后铺板，自然干燥后在100～105℃活化30分钟。层析条件：对照品：总碱丙酮液展开剂：CHCl3-(CH3)2CO1:1,展开前氨水饱和15分钟。显色剂：改良Dragendroff试剂（三）鉴识1.层析鉴识硅胶GTLC对照品：汉防己甲素丙酮液1mg/ml样品：自制展开剂：CHCl3-(CH3)2CO1:1,展开前氨水饱和15分钟。显色剂：改良Dragendroff试剂2.定性反应取抽松物溶于稀（0.5％）HCl中，分置4支试管中，加下列试剂1～3滴，观察现象。(1)碘－碘化钾试剂(2)硅钨酸试剂(3)碘化铋钾试剂(4)苦味酸试剂3.衍生物的制备汉防己碱二碘甲烷盐（汉肌松）的制备取丙酮结晶过的甲、乙素混合物50mg，加MeOH5ml溶解，用10%KOH甲醇溶液调pH11，再加入碘甲烷0.5ml，回流加热15min，回收甲醇至干，残留物以乙醇重结晶，可得到白色结晶，即汉肌松，mp261.5℃六、实验安排本实验共分4次完成。第一次：总生物碱的提取第二次：亲脂性生物碱与水溶性生物碱的分离；季铵型生物碱的分离纯化（碱水层酸化，雷氏铵盐沉淀，滤取沉淀干燥）第三次：季铵型生物碱的分离纯化第四次：汉防己甲素和乙素的柱层析分离；鉴识七、思考题1.减压回收较常压回收有那些特点？影响减压回收速度的关键是什么？如何控制？停止减压蒸馏应如何操作？2.萃取操作的好坏对实验结果会有什么影响？正确的萃取操作是什么？3.怎样防止乳化，怎样消除乳化？4.一般情况下为什么有机溶剂必须洗至中性方能浓缩或放置？5.何时有机相需要脱水干燥，何时不必？6.什么叫生物碱的假阳性反应？能消除吗？7.粉防己中各种生物碱的分离原理是什么？8.雷氏铵盐法分离纯化季铵碱有何优缺点？雷氏盐使用时为什么要新配制？做沉淀时加酸调pH的目的是什么？请写出分解生物碱-雷氏盐复合物的反应式。

第三章综合实验项目实验一中药化学成份的系统预试验操作在研究一未知样品时，多采用中药化学成分的系统预实验。先根据各化学成分的溶解性不同，选用适当的溶剂，极性梯变，顺次将各类溶解性相近的成分提出。例如：石油醚、汽油、苯可溶解油脂、挥发油、植物甾醇、某些生物碱、亲脂性强的香豆素等亲脂性化合物；乙醚可提取出树脂、内酯、黄酮等化合物；氯仿可提取有利生物碱；丙酮、乙醇、甲醇则可提取出一些生物碱及其盐，有机酸及其盐、苷类、鞣制、无机盐类等化合物。通过制备预实验的溶液，可减少各成分间的相互影响，提高预试的效果。一般工作中常根据水能提取极性物质，石油醚可提取非极性物质，醇能提取大多数成分等特点，采用石油醚、95%乙醇和水为溶剂对样品进行分别提取。预实验的结果仅能作为进一步提取分离有效成分的初步线索。由于植物中各成分的复杂性和相互干扰，各定性反应常有例外，例如：碘化铋钾试剂，不仅对生物碱发生反应，对碱性氨基，生物胺等同样也发生反应。生物碱沉淀反应作为预实验阴性结果可做出无生物碱存在的结论，阳性结果实际意义不大，须进一步配合其他反应或配合TLC及PC进行。因此，决不能只跟据预试结果武断作出某种成分存在与否的结论。为进一步了解所含成分单体的个数和情况可配合TLC和PC。一、实验目的掌握中药成分的预试验方法，总结中药中各主要化学类型成分的理化性质。二、实验原理根据中药化学成分溶解度不同进行溶剂系统提取分离，达到分类，再利用各种沉淀试剂和显色剂进行预试，并配合TLC及PC，初步判断和了解各部分中可能含有的化学成分。三、溶剂及试剂95%乙醇150ml，石油醚150ml，1%HCl30ml，氯仿40ml，氨水适量。四、实验操作（一）与实验溶液的制备1．水提取液此滤液供糖、多糖、有机酸、皂苷、苷类、酚类、鞣质、氨基酸、生物碱等项的预试。2．乙醇提取液3．石油醚提取液样品粗粉1g，加10ml石油醚（60～90℃）放置2～3h，过滤，滤液放在表面皿上，让石油醚挥发，用残留物进行萜类、甾类、脂肪等的检查。（二）各类成分检查1．生物碱（1）碘—碘化钾试剂：取检液F2ml于试管中若中性要酸化至酸性，滴加碘—碘化钾试剂2滴，如有棕红色沉淀产生，可能含有生物碱。（2）碘化铋钾试剂：试剂同上，也呈酸性，加碘化铋钾试剂立即有桔红色或黄色沉淀产生，亦可能有生物碱。本反应于纸片上进行较为敏感。（3）硅钨酸试剂：操作同上，如有生物碱，试液与硅钨酸试剂相遇，即产生类白色或有浅黄色沉淀。2．氨基酸、多肽和蛋白质（1）双缩脲试验（Biuret反应）：取1%硫酸铜溶液与10%氢氧化钠溶液等量混合。本试验主要是C++u与蛋白质或肽类分子中肽键—CONH—络合显色。取1m1检液A，加入1～3滴40%氢氧化钠溶液，摇匀，使呈碱性，再逐滴加入1%硫酸铜溶液，边加边摇匀（注意不要过量），如显紫、红或紫红，表示有多肽或蛋白质。（2）茚三酮试剂（Ninhydrin试剂）：检液A点在纸片上，滴上或喷洒0.2%茚三酮乙醇液后，在100℃左右的烘箱中放置2min，如有氨基酸和肽就显蓝色或紫红色斑点，也有少数氨基酸呈黄色斑点。亦可在试管中进行，水提液1ml，加试剂2～3滴后在沸水浴上加热5min，冷后有蓝紫色出现，表明有氨基酸或多肽。[注]除上述成分外，伯胺也会显色。3．有机酸（1）用pH试纸检查：取检液D用pH试纸检查，如呈酸性，则可能含有游离酸或酚性化合物。（2）溴酚蓝溶液：取检液D点于滤纸片上，喷洒0.1%溴酚蓝溶液（溶于7%乙醇中），立即在蓝色背景上显黄色斑点，表明可能含有机酸。如觉得不明显，可再喷洒氨水，然后暴露在盐酸气体中，背景逐渐由蓝色变为黄色，而有机酸斑点仍为蓝色。经过这样一个反复，用pH试纸难以肯定的有机酸样品也可检出。4．鞣质（1）1%三氯化铁试验：（样品溶液如为酸性，即可直接进行检查。如为碱性，可加酸酸化后再滴加三氯化铁试剂。）取检液Blml，加1%三氯化铁试剂，如呈蓝墨绿色或蓝紫色，证明可能含有酚类或鞣质。可水解鞣制多为蓝色，缩合鞣制多呈绿色。（2）明胶实验：取检液B2ml，加入氯化钠-明胶溶液，如产生白色沉淀，则表明含有鞣质。5．糖、多糖和苷（1）斐林试剂（Fehling）：斐林试剂为CuSO4与酒石酸钾钠试剂临用前等体积混合。取检液B2ml，加入新配制的斐林试剂，在沸水浴上加热数分钟，如产生红棕色氧化亚铜沉淀，证明含有还原糖存在。另取热水提取液，加盐酸，使呈酸性，加热微沸5～10min，使产生水解反应，冷后，调节pH至中性，同上法加斐林试剂，如热水提取液未水解前呈负反应，水解后呈正反应，或水解后产生氧化亚铜沉淀较前为多，表明可能含有多糖、苷类成分。（2）-萘酚试验（Molish反应）：取检液B和D各3ml，加热浓缩，使溶于0.5ml乙醇中，再加等体积的10%-萘酚乙醇液，摇匀，沿试管壁缓缓滴加浓硫酸，如在二液界面处产生紫红色环，证明含有糖类、多糖或苷类。（3）氨性硝酸银试剂：0.1N硝酸银溶液和5N的氨水临用前等量混合。取检液B点于纸上，喷洒上述试剂，在100℃加热5～10min，还原糖呈褐色。6．皂甙（1）泡沫试验：取检液B3ml于试管内，激烈振摇，如产生持续性泡沫，就可能含有皂苷、高级脂肪酸、蛋白质、粘液质。皂苷和脂肪酸盐泡沫特别明显，在试管内能持续10min以上，即使加热，加乙醇，泡沫也不明显地减少。在有皂苷的基础上，可取二试管取检液分别滴加5%HCl，5%NaOH振摇，比较泡沫高度，判断三萜皂苷与甾体皂苷。（2）醋酐-浓硫酸试验（Liebermann-Burchard反应）：取检液B和D各2ml置蒸发皿中，在水浴上小心蒸去溶剂，残渣溶解或悬浮于醋酐0.5ml中，滴加1滴浓硫酸，如呈紫红色，并且在溶液上层逐渐变绿，证明可能含有皂甙。（3）溶血试验：取检液B2ml，蒸干，使溶于0.9%生理盐水中，加血球生理盐水悬浮液，产生溶血现象，表明含有皂苷。7．植物甾醇、三萜类（1）醋酐-浓硫酸试验（Liebermann-Burchard反应）：取检液D2ml，操作方法同前，结果如果红紫色，并逐渐变为污绿色，表明含有植物甾醇或三萜类成分。颜色变化较快这为甾醇。（2）氯仿-浓硫酸试验（Sackowski反应）：取检液D2ml，在水浴上蒸干，以氯仿溶解残渣，加浓硫酸，如氯仿层显红色或青色，硫酸层有绿色荧光，则表明有植物甾醇。8．黄酮类（1）盐酸-镁粉试验：取检液D2ml于试管中，加镁粉少许，再滴入浓盐酸数滴（必要时在沸水中加热3min），如显樱红色，说明含有黄酮类化合物。如乙醇提取液加浓盐酸而不加镁粉即出现红色表明含有花色素。（2）氨熏试验：将检液D点于滤纸片上，置氨蒸气中熏半分钟，如显黄色，置荧光灯下显黄色荧光，表明有黄酮类化合物。（3）三氯化铝试验：将检液D点于滤纸片上，喷洒1%三氯化铝乙醇溶液，干燥后于紫外灯光下如显明显之黄色或黄绿色荧光，表明可能有黄酮类化合物存在。9．香豆素与萜类内酯化合物（1）荧光试验：将检液D点于滤纸片上，干燥后，放在紫外灯光下观察，如有天蓝色荧光者，可能含有香豆素类。（2）偶合试验：取检液D2ml，加入等体积3%碳酸钠水溶液，于水浴上煮沸3～5min，冷却后，加新配制的重氮化试剂，如显红色或紫色，表明可能含有亲脂性强的香豆素类。（3）异羟肟酸铁试验：取检液D2ml，加2～4滴盐酸羟胺试液和10%氢氧化钾甲醇液至呈碱性（pH8～9），于水浴上加热至反应完全，冷却，加盐酸酸化（pH2～3），并加入1%三氯化铁溶液，混匀，如溶液呈红色或

紫色反应，表明含有酯、内酯、香豆素类成分。10．强心甙（1）碱性3,5-二硝基苯甲酸试验（Kedde反应）：取检液D2ml，加入新鲜配制的碱性3,5-二硝基苯甲酸试剂2～3滴，溶液呈紫红色，表明可能含有强心甙。此反应也可在滤纸片上进行。（2）碱性苦味酸实验（Baljet反应）：取检液D2ml，加入碱性苦味酸试剂2～3滴，放置15min左右，溶液呈现橙色或红色，表明可能含有强心甙。（3）亚硝酰铁氰化钠试验（Legal反应）：取检液D2ml，在水浴上小心蒸干，加入lml吡啶溶解残渣，加入0.5%亚硝酰铁氰化钠水溶液1滴，混匀，再加入10%氢氧化钠1～2滴，摇匀，如呈红色，而后颜色又逐渐消失，表明可能含有强心甙。（4）三氯化铁冰醋酸试验（Keller反应）：取检液D3ml，在水浴上蒸干，冷后，加三氯化铁冰醋酸试剂，溶解残渣于一试管中，沿管壁滴加浓硫酸，于二液界面处显棕色环，上层的冰醋酸呈蓝绿色，表示具有α-脱氧糖的强心苷存在。11．检查蒽醌类（1）KOH试验：取检液D1～2ml，加入10%KOH水溶液3～4滴，如呈红色，表明含蒽醌类。（2）醋酸镁试验：取检液D1～2ml，滴加3滴10%醋酸镁甲醇液，如呈橙红至红色，表明含蒽醌类。12．挥发油和油脂（1）一般检查：将石油醚提取液滴于滤纸片上，如纸片上的油斑能在大气中自然挥发，就可能含有挥发油。如果油斑不消失，可能含有挥发油、油脂或脂质体。（2）磷钼酸试验：将石油醚提取液滴于滤纸片上，喷洒25%磷钨酸乙醇溶液后，将纸片放在115～118℃烘箱中2min，对油脂、三萜及甾醇等呈蓝色，背景为黄绿色或藏青色。（三）薄层检查1.生物碱（以下条件仅限于本试验）吸附剂：硅胶G样品：检液E对照品：粉防己总生物碱、苦参总碱展开剂：CHCl3-MeOH-浓氨水（5:0.6:0.3）显色剂：改良碘化铋钾试剂。2.各类成分的层析条件参见教材及相关文献。五、实验安排本实验共分3次完成第一次：水提液的制备及检查；第二次：乙醇提取液（检液D）的制备及检查第三次：检液E和F的制备，生物碱的检查

实验二银翘散抗流感病毒有效组分研究银翘散为清代医家吴鞠通根据《内经》“风淫于内，治以辛凉，佐以苦甘;热淫于内，治以咸寒，佐以甘苦”的理论而创制的名方，临床应用已久，由金银花、连翘、牛蒡子、甘草、薄荷、荆芥、桔梗、淡豆豉、淡竹叶等9味药组成。始见于1788年出版的《温病条辩》。现代用于治疗流行性感冒、急性扁桃体炎、咽峡疱疹、麻疹、腮腺炎、乙脑、流脑、大叶性肺炎等疾病的初期阶段。现代药理实验表明银翘散具有良好的抗流感病毒活性。石任兵教授课题组以银翘散全方为研究对象，按传统用药方式，结合药效学实验，综合运用现代分离技术和方法，初步阐明了银翘散抗流感病毒作用的物质基础，并初步探讨了其作用机理。一、银翘散抗流感病毒有效组分群的筛选取银翘散原方(金银花:连翘:牛蒡子:甘草:薄荷:荆芥:桔梗:淡豆豉:淡竹叶为9:9:9:5:6:6:6:6:4)按传统用药方式，以水煎煮，得到水煎液。水煎液经过AB-8型大孔树脂柱处理，通过正交实验筛选，以抗甲型、乙型流感病毒为活性评价指标，采用鸡胚法和CPE法，筛选出了银翘散抗流感病毒有效组分群(EFY)。二、银翘散抗流感病毒有效组分群化学成分的结构鉴定采用多种分离纯化方法和结构鉴定手段，对银翘散抗流感病毒有效组分群(EFY)中化学成分的系统研究，从中分离得到43个化合物，并对其中的31个进行了鉴定。1个为新化合物，8个为首次从银翘散中分得的已知化合物，其余为银翘散各单味药已有报道的化合物。1.仪器与试剂HMK显微熔点仪（温度计未校正）。TU1201型紫外可见分光光度计和U2000紫外分光光度计。NicoletImpact410型红外分光光度计，KBr压片。JEOL-300型核磁共振仪、VarianGemini-300型核磁共振仪和BrukerAVANC-EDRX-500超导核磁共振仪。VG-ZAB-HS型质谱仪、VG-20-250型质谱仪、Mariner质谱仪和APEXⅡFT-ICR质谱仪。XZ-7旋转蒸发器（中国科学院生物物理所科龙仪器厂）。SHZ-3循环水真空泵(河南省巩义市英峪电子仪器厂)。H66025超声波清洗仪（无锡市超声电子设备厂）。DS-Ⅱ电热三用水箱（北京市医疗设备厂）。WatersDeltaPerp3000制备液相色谱仪，Waters484可调波长紫外检测器。Waters745数据记录仪,流动相：甲醇-水系统。Gilson制备液相色谱仪，Gilson306泵，Gilson118紫外/可见检测器，Gilson712化学工作站,流动相：甲醇-水系统。薄层层析和柱层析硅胶（青岛海洋化工厂出品）。薄层展开系统:氯仿-甲醇。Sep-hadexLH-20（上海化学试剂采购供应站分装厂产品）。AB-8型大孔吸附树脂（天津南开大学化工厂出品）。柱层析聚酰胺（上海化学试剂公司出品）。聚酰胺-6-薄膜（浙江四青生化材料厂产品）。展开系统：甲醇一水（4:1）。显色剂：10%硫酸乙醇溶液；1%三氯化铝乙醇溶液。所用有机溶剂均为分析纯。2.提取分离流程银翘散抗流感病毒有效组分群（EFY）经AB-8型大孔吸附树脂处理，水-乙醇梯度洗脱，分别得到30%、50%、70%和95%乙醇部分。各部分分别经聚酰胺柱层析，水-乙醇梯度洗脱，聚酰胺薄膜检测，合并相同组分.合并后的组分再行反复硅胶柱层析，氯仿-甲醇梯度洗脱；SephadexLH-20柱层析，甲醇-水不同比例洗脱；硅胶薄层制备，氯仿-甲醇系统展开；HPLC制备，甲醇-水系统作为流动相。最后从95%乙醇部分中得到4个单体化合物;从70%乙醇部分得到5个单体化合物；从50%乙醇部分得到18个单体化合物;从30%乙醇部分得到16个单体化合物。具体分离流程如下:3.银翘散抗流感病毒有效组分群化学成分的结构鉴定通过对银翘散抗流感病毒有效组分群（EFY）中化学成分的系统研究，从中分离得到43个化合物，经理化常数测定及光谱解析，鉴定出其中的31个化合物，其中黄酮类17个、木脂素类3个、酚酸类5个和三萜类4个，其它2个。现以30%乙醇部分分得的化合物A为例说明结构鉴定的一般过程。A为黄色结晶性粉末，mp219-222℃，Mg-HCl反应及Molish反应均呈阳性，酸水解检出半乳糖，示为黄酮苷类化合物。FAB-MS给出准分子离子峰m/z465（M+l）和碎片峰m/z303（M-Gal+1），结合1H和13CNMR数据推断分子式C21H32O12。据此计算不饱和度为12，推知A可能为单半乳糖苷。IR光谱（KBr）cm-1：3240（OH），1650（α，β-不饱和C=O），1600，1550，1496（苯环）。1HNMR（DMSO-d6）：δ：12.60（1H，s），10.81（1H，s），9.67（1H，s），9.10（1H，s）为四个酚羟基质子信号，其中δ12.60位5位羟基质子信号，因其与C=O形成氢键而大幅度移向低场。δ：7.65(1H，dd，J=8.4，2.4Hz)，7.51(1H，d，J=2.4Hz)，6.80(1H，d，J=8.4Hz)三组峰为苯环上的3个氢信号，判断其组成了1个ABX系统，提示分子结构中有三取代的苯环存在，是典型3＇，4＇-二氧取代黄酮类化合物B环上的2＇，6＇-H和5＇-H质子信号。δ：6.39(1H，d，J=2.1Hz)，6.19(1H，d，J=2.1Hz)峰为苯环上的2个间位偶合的氢信号，可归属于苷元A环的8-H和6-H，示A环为5,7-二氧取代。δ：5.36(1H，d，J=7.5Hz)为糖的端基质子信号，根据其偶合常数可知糖苷键为β构型。13CNMR（DMSO-d6）δ：177.8(C-4羰基),δ：156.7(C-2),133.9(C-3),为典型的黄酮醇类骨架类型。同时也可观察到糖的一组碳信号，δ：102.2为糖端基碳信号，δ：75.9，73.3，71.4，68.1，60.3是糖上其它碳信号，经与糖标准数据对照，确定为β-D-半乳糖。结合1HNMR和13CNMR数据，推断该化合物苷元为槲皮素。A的苷元部分与文献相比13CNMRδ：C-2，C-3信号分别位移了+10和-2，说明C-3位取代成苷。综合上述各种结果，鉴定A为槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷即金丝桃苷(hyperosid)，其结构式见图1，全部碳氢信号归属见表1。图1化合物A结构式表1化合物A的1HNMR和13CNMR数据No.δCδHNo.δCδH2156.71′121.43133.92′115.57.51(1H，d，J=2.4Hz)4177.83′144.85161.14′148.5698.66.39(1H，d，J=2.1Hz)5′116.37.51(1H，d，J=2.4Hz)7164.26′122.17.65(1H，dd，J=8.4，2.4Hz)893.96.39(1H，d，J=2.1Hz)1″102.25.36(1H，d，J=7.5Hz)9156.62″71.410104.23″