重组人胰岛素生产工艺

重组人胰岛素生产工艺第一页，共十九页，编辑于2023年，星期三重组人胰岛素定义：

胰岛素：是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。重组人胰岛素（现阶段临床最常使用的胰岛素）：利用生物工程技术，获得的高纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同。

第二页，共十九页，编辑于2023年，星期三结构：

胰岛素由A、B两个肽链组成。A链有11种21个氨基酸，B链有15种30个氨基酸，共26种51个氨基酸组成。其中A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四个半胱氨酸中的巯基形成两个二硫键，使A、B两链连接起来。此外A链中A6(Cys)与A11(Cys)之间也存在一个二硫键。第三页，共十九页，编辑于2023年，星期三3DStructureofInsulin胰岛素二聚体（dimer）胰岛素六聚体（hexamer

）第四页，共十九页，编辑于2023年，星期三胰岛素的性质

第五页，共十九页，编辑于2023年，星期三胰岛素的功能

胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，也是唯一同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素。药理作用

治疗糖尿病、消耗性疾病。第六页，共十九页，编辑于2023年，星期三胰岛素的研究历史

1921年----从动物胰腺中提取出胰岛素，开创了人类胰岛素治疗的历史。

1926年----重结晶胰岛素

1930s----传统中、长效动物胰岛素

1970s----单峰胰岛素和单组分胰岛素

70年代末----半合成胰岛素

1982年----采用基因重组技术生产的人胰岛素正式上市。90年代至今----重组人胰岛素类似物成功研发上市，包括超短效和长效人胰岛素类似物。第七页，共十九页，编辑于2023年，星期三胰岛素制备工艺

以动物胰脏为原料提取胰岛素

----酸醇提取法

※传统胰岛素---猪、牛胰脏提取，只经一步重结晶

※单峰胰岛素----凝胶过滤纯化

※单组分胰岛素---凝胶过滤、离子交换纯化

半合成胰岛素----以猪胰岛素为原料，酶修饰后得到人胰岛素重组DNA技术生产人胰岛素

※AB链合成：分别表达AB链，化学方法连接

※逆转录法：表达胰岛素原，酶切得到重组人胰岛素第八页，共十九页，编辑于2023年，星期三重组DNA技术制造人胰岛素

AB链合成法：以人工合成的人胰岛素A链和B链基因分别与半乳糖苷酶基因连接，形成融和基因，分别在大肠杆菌中表达A链和B链，然后再通过化学氧化作用，通过二硫键连接起来。————已被淘汰第九页，共十九页，编辑于2023年，星期三InsA链InsB链转化大肠杆菌发酵A链B链纯化二硫键活性胰岛素AB链合成人胰岛素AB链合成法第十页，共十九页，编辑于2023年，星期三2.反转录酶法：仿照天然合成途径

通过胰岛素原的cDNA合成，表达产物是胰岛素原，经工具酶切开，除去C-肽得人胰岛素。

第十一页，共十九页，编辑于2023年，星期三提取目的基因：既从人的DNA中提取胰岛素基因，可使用限制性内切酶将目的基因从原DNA中分离。主要有如下4种方法：（1）鸟枪法：用一大堆限制性核酸内切酶对附近基因进行剪切，再提取所需要的。至于如何筛选，用DNA分子杂交，即DNA探针（2）人工合成法：根据转录蛋白或者mRNA推导出基因序列，然后人工合成，没有内含子。（3）从基因文库中提取：也就是事先已经提取完毕的拿来用（4）PCR扩增技术：用于大量生产该段基因片段，用于商业化运作……

第十二页，共十九页，编辑于2023年，星期三提取质粒：使用细胞工程,培养大肠杆菌，从大肠杆菌的细胞质中提取质粒，质粒为环状。主要有如下2种方法：

（1）碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。

（2）煮沸法

第十三页，共十九页，编辑于2023年，星期三基因重组：取出目的基因与质粒，先利用同种限制性内切酶将质粒切开，再使用DNA连接酶将目的基因与质粒“缝合”，形成一个能表达出胰岛素的DNA质粒。第十四页，共十九页，编辑于2023年，星期三将质粒送回大肠杆菌：在大肠杆菌的培养液中加入含有Ca+的物质，如CaCl2,这使细胞会吸收外源基因，此时将重组的质粒也放入培养液中，大肠杆菌便会将重组质粒吸收。将大肠杆菌用氯化钙处理，以增大大肠杆菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒能够进入受体细胞，此时的细胞处于感受态（理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态）。第十五页，共十九页，编辑于2023年，星期三胰岛素的产生：再大肠杆菌内，质粒通过表达转录与翻译后，便产生出胰岛素蛋白质。通过大肠杆菌的大量繁衍，便可大量生产出胰岛素。（注意：大肠杆菌产出的是多肽链，因为原核生物没有内质网、高尔基体等，不能进行多肽的折叠、修饰等，还需人为进行菌体外加工。）第十六页，共十九页，编辑于2023年，星期三质粒InsmRNA反转录InscDNA转化大肠杆菌PCR连接胰岛素原活性胰岛素二硫键酶切

提取质粒限制性内切酶酶切

反转录酶法合成人胰岛素第十七页，共十九