人自噬基因hATG12转染对酿酒酵母自噬过程的作用

人自噬基因hATG12转染对酿酒酵母自噬过程的作用【摘要】目的探讨人自噬基因ATG12(hATG12)在酵母自噬过程中的作用。方法转化重组质粒pESCURAEGFPhATG12(实验组)或pESCURAEGFP(对照组)的酵母用不同方法诱导自噬后,以荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(EGFP)和含hAtg12的融合蛋白(EGFPhATG12)在酵母中的表达与定位;以透射电镜观察前自噬体结构、自噬体和自噬小体的分布及结构特点。结果2组酵母细胞质内均见荧光,液泡内未见荧光,实验组荧光呈小点状分布;电镜下见自噬体由双层膜囊结构延伸而来,该双层膜囊结构靠近细胞膜。液泡内自噬小体由单层膜包裹。结论hATG12参与酵母自噬体最初的形成过程,定位于自噬体外膜上,在自噬体形成后脱离自噬体。自噬体膜最初可能来源于细胞膜。

【关键词】hATG12蛋白质类酵母菌酿酒基因转染吞噬作用

1962年,Ashford和Porter报道在电子显微镜下发现肝细胞自噬现象。近年来由于发现与自噬相关的基因,以及自噬在生物体生理和病理等方面的作用,自噬受到高度关注。自噬基因首先在酵母中发现,随后在小鼠等哺乳动物中发现其同源基因,说明自噬的分子机制从酵母到高等真核生物高度保守。笔者采用报告基因技术,观察hATG12在酵母自噬过程中的表达及定位,采用透射电镜观察自噬体的结构及其形成过程,进而研究hATG12在酵母自噬过程中的作用。

1材料与方法

材料

试剂苯甲基磺酰氟、雷帕霉素(美国Sigma公司)。

质粒和菌株大肠杆菌酿酒酵母穿梭载体pESCURA,营养缺陷型酿酒酵母YPH500(美国Invitrogen公司)。含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的载体pESCURAEGFP和pESCURAEGFPhATG12(由本实验室构建)。hATG12为本实验室从正常人外周血单个核细胞中获得的自噬相关基因。转化质粒pESCURAEGFPhATG12的营养缺陷型酿酒酵母YPH500和转化质粒pESCURAEGFP营养缺陷型酿酒酵母YPH500也由本实验室转化获得。实验分组:转化重组质粒pESCURAEGFPhATG12的酵母为实验组,转化重组质粒pESCURAEGFP的酵母为对照组。

方法

荧光显微镜标本制备与观察(1)实验组和对照组在SD(％酵母氮碱,2％葡萄糖,％缺尿嘧啶的氨基酸省却混合物)培养液中培养到对数早期。(2)4000r/min离心5min。用SG(％酵母氮碱,2％半乳糖,％缺尿嘧啶的氨基酸省却混合物)洗2次。在SG中培养24h。(3)加雷帕霉素(终浓度μg/mL),继续培养5h。(4)取菌液10μL,滴在载玻片上,盖上盖玻片。研究显微镜(BX51,日本Olympuse公司)蓝色滤片观察,数码相机(DP70,日本Nikon公司)照相。

透射电镜观察(1)、(2)同,(3)在SG中培养24h后,4000r/min离心5min。用SD(N)(％酵母氮碱,2％半乳糖)洗2次。加SD(N)培养,加苯甲基磺酰氟(终浓度1mmol/L,以防止自噬小体降解),培养1h和3h取样。(4)透射电镜观察:取菌液1mL离心收集细胞。%戊二醛固定,4℃过夜。PBS漂洗,30min×4。锇酸后固定h。PBS漂洗,30min×4。常规丙酮脱水。渗透:纯丙酮Spurr’s树脂=1∶1,2h;纯丙酮Spurr’s树脂=1∶2,4h;Spurr’s树脂过夜包埋。超薄切片。醋酸双氧铀及枸橼酸铅双染色。透射电镜(JEM1200EX,日本电子光学公司)观察。

2结果

及EGFPhATG12在酵母发生自噬时的表达与定位

荧光显微镜观察实验组和对照组的细胞质内均观察到荧光。对照组荧光较均匀分布于细胞质中,而实验组除此之外,细胞质中自噬体呈小点状分布,液泡中未见荧光。相差显微镜下观察到自噬体结构,自噬体较多,其中一些能和荧光显微镜图像中自噬体对应起来,这部分自噬体是由转染的hATG12参与形成的,另一部分未显示荧光的自噬体由酵母内源性ATG12参与形成(图1)。

透射电镜观察当细胞从营养丰富的培养液转移到营养缺乏的培养液培养后,观察到细胞质内前自噬体结构(preautophagosomestructure,PAS)、自噬体和液泡内自噬小体。PAS为游离的双层膜囊,靠近细胞膜,自噬体位于PAS的内侧,由双层膜包裹,液泡内自噬小体由单层膜包裹(图2)。

自噬体膜的来源在细胞周边靠近细胞膜观察到许多双层膜囊结构、自噬体和小液泡,这些双层膜囊结构与细胞膜相连,可见液泡膜也与细胞膜相连(图3)。

3讨论

在酵母自噬过程中的作用本研究在前期工作中从正常人外周血单个核细胞中克隆了hATG12,而后把hATG12与报告基因——EGFP基因相连,并转化到酵母;荧光显微镜证实EGFP和EGFPhATG12融合蛋白在酵母中稳定表达[1];经进一步研究表明,hATG12并不影响酵母的增殖,但能显着提高酵母自噬活性(待发表)。

从荧光显微镜结果可知,实验组细胞质内(包括自噬体)可见荧光,说明hAtg12定位于细胞质和自噬体中,而在液泡内未见荧光蛋白的表达,推测hAtg12定位于自噬体外膜,在自噬体外膜和液泡膜融合后离开了自噬体,没有进入到液泡内。电镜观察PAS为靠近细胞膜的双层游离膜囊结构,自噬体由双层膜包裹,而液泡内的自噬小体则由单层膜包裹。综合光镜和电镜结果,说明hAtg12定位于PAS及自噬体的外层膜上,hATG12在酵母自噬体的形成过程中起作用,在自噬体形成后从自噬体外膜上脱离下来,重新参与另一个自噬体的形成。酵母ATG12在自噬过程中的作用研究最为清楚:Atg12与Atg5、Atg16形成复合物,该复合物参与自噬体的形成。研究植物自噬现象时发现植物ATG12是自噬相关基因,在自噬过程中起重要作用[34]。有研究表明,哺乳动物Atg12与自噬体的形成有关,ATG12缺失的小鼠胚胎干细胞前自噬体结构和自噬体的数量明显减少。因此,ATG12的功能在不同的种属是相似的。

实验组在诱导自噬后形成了自噬体,对照荧光显微镜和相差显微镜图像,可以观察到后者胞质内自噬体较多,其中一些自噬体能和前者自噬体对应起来,这部分自噬体是由转染的hATG12参与形成的,另一部分并未显示荧光的自噬体是由酵母内源性ATG12参与形成的。酵母ATG12和其同源基因hATG12有着相似的功能,即在自噬体形成过程中起作用,在自噬体完全形成后离开了自噬体,重新参与下一个自噬体的形成。转染了pESCURAEGFPhATG12后,hATG12对酵母自噬活性的影响在另文中有阐述(待发表)。

自噬体膜的来源自噬体首先由细胞内较小的双层游离膜囊结构不断延伸而来,这小囊泡结构称为PAS,ATG12系统和ATG8系统的蛋白质经过膜再循环不断补充到PAS膜上,使PAS不断延伸,最后形成球形的自噬体。但PAS膜最初的来源一直有争议。Dunn等认为自噬体膜最初来源于脱核糖体后的粗面内质网。而Yamamoto等学者用细胞化学方法研究大鼠干细胞的自噬现象,认为自噬体膜最初来源于高尔基复合体。1998年Stromhaug等研究大鼠肝细胞的自噬体,发现自噬体膜蛋白成分不含内质网特征性酶——葡萄糖诱导的二硫化物酯酶的异构酶,也不含溶酶体的特征性酶——酸性磷酸酶和组织蛋白酶B等,并且也不具有内涵体的早期内涵体相关蛋白1和阳离子依赖的6磷酸甘露糖受体等内涵体的特征性蛋白,因此认为自噬体膜并非来源于上述细胞器,而是自噬体特有的膜。而从本实验结果来看,自噬体和液泡多数分布于细胞的周边靠近细胞膜,细胞膜与自噬体膜、细胞膜与液泡膜相连,同时也观察到细胞周边许多双层膜囊结构。由此,笔者认为自噬体膜来源于细胞膜。自噬体形成机制可能如下:细胞膜发生凹陷,呈双层膜囊状,此双层膜囊结构即为PAS,ATG12系统和ATG8系统等自噬蛋白不断添加到PAS中,使双层膜囊不断延伸,最后和细胞膜分离,形成球形的自噬体。

【参考文献】

“[1“]何才姑,朴英杰,郑文岭.hAPG12EGFP融合基因真核表达载体的构建及其在酵母中的表达“[J“].广东医学,2005,26(7):904906.

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“[3“]ThompsonAR,DoellingJH,SuttangkakulA,etal.AutophagicnutrientrecyclinginArabidopsisdirectedbytheATG8andATG12conjugationpathways“[J“].PlantPhysio,2005,138(4):20972110.

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“[5“]MizushimaN,YamamotoA,HatanoM,etal.DissectionofautophagosomeformationusingAPG5deficientmouseembryonicstemcells“[J“].JCellBiol,2001,152(4):657668.

“[6“]HanadaT,OhsumiY.StructureFunctionRelationshipofAtg12,anubiquitinlikemodifieressentialforautophagy“[J“].Autophagy,2005,1(2):110118.

“[7“]DunnWAJr.Studiesonthemechanismsofautophagy:for