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［摘要］目的：在外源抗原表位表达载体系统中构建并表达乙型肝炎病毒抗原表位，并对其诊断敏感性进行评价。方法：人工合成编码HBV“a”抗原决定簇表位中24个氨基酸的寡核苷酸序列，克隆入外源抗原表位表达载体系统FHVRNA2I3位点，构建重组质粒，在原核pET系统中表达。通过ELISA和Westernblot检测表达产物的抗原性，并以表达产物为包被抗原,通过ELISA和Westernblot检测58份乙肝患者血清抗HBs。结果：嵌和蛋白可与抗HBs特异性结合，其ELISA检测抗HBs阳性率为%，Westernblot的为68%，而对照试剂盒的为62%。结论：在外源抗原表位表达系统中表达的HBV重组抗原表位具有良好的抗原性，有诊断应用价值。

［关键词］HBV;抗原表位;抗原性;FHVRNA2载体系统

乙型肝炎病毒是乙型肝炎的病原体，并引起慢性肝炎和肝硬化，而且与肝癌的发生密切相关。迄今，对HBV感染最有力的预防和控制措施，仍是发展疫苗。FHVRNA2载体系统［1］是一个以昆虫小RNA病毒flockhousevirus外壳蛋白为载体的新型抗原表位表达载体，此系统中表达的载体蛋白可自动组装成病毒样颗粒，使插入的外源抗原表位可以暴露在颗粒的表面，保持天然构象和免疫学特性。本研究拟将HBVa抗原表位插入到FHV外壳蛋白上，并对其抗原性及诊断意义进行了研究。

1材料与方法

细胞重组质粒DNA大肠杆菌DH5α用于重组质粒pETEDNA的克隆和扩增。大肠杆菌BL21用于重组质粒pETEDNA的表达。质粒DNA在含200μg/ml氨苄青霉素的LB或TB培育中生长，FHVRNA2载体系统即重组pETFHV构建见［1］。

抗原表位及重组pETE的构建和表达

抗原表位及重组pETE的构建人工合成HBV特异抗原表位E寡核苷酸序列：正向5’GATGCACGACTCCTGCTCAAGGCAACTCTATGTTTCCCTCATGTTGCTGTACAAAACCTACGGATGGAAATTGC3’；反向3’CTACGTGCTGAGGACGAGTTCCGTTGAGATACAAAGGGAGTACAACGACATGTTTTGGATGCCTACCTTTAACG5’，两端为Bsu36I识别位点，与经Bsu36I作用后的重组pETFHVDNA混匀后置室温连接2h,转化DH5α细胞，接种LB平板培养。重组质粒pETEDNA经酶切筛选并经DNA序列测定。

携带HBV抗原表位的嵌和蛋白的表达重组pET系统中，嵌和蛋白的表达受T7启动子的控制［2］。BL21经重组pETEDNA转化后，在TB培养液中37℃生长16h～18h,细胞经4000r/10min离心沉淀,用超声裂解缓冲液悬浮，超声裂解，裂解液经离心，弃上清，沉淀用8mol/L尿素溶解。

PAGE及Westernblot分析方法见前文［1，3］，3，3二氨基苯胺四氢盐酸底物试剂为AMRESCO公司产品;第二抗体辣根过氧化物酶结合物购自华美公司。

重组抗原表位诊断意义评价

检测血清样本固相ELISA检测如前文所述［1］，以纯化的嵌和蛋白为包被抗原，每孔100μl，检测58份乙肝患者血清中抗HBs，与抗HBsELISA检测试剂检测结果比较。阳性判断标准为/>。邻苯二胺二氢盐酸购自AMRESCO公司；第二抗体辣根过氧化物酶结合物购自华美公司；乙肝患者血清由昆明市传染病医院收集;抗HBsELISA检测试剂盒购自上海科华公司。

重组抗原表位Westernblot检测血清样本方法见前文［3］，检测了58份乙肝患者血清样本。

2结果

携带HBV抗原表位的嵌和蛋白的表达FHVRNA2cDNA载体系统即重组pETFHV构建见文献［4］，其编码产物是FHV外壳蛋白，三维立体结构已得到精确测定，其上有6个可供外源抗原表位插入的位点［5］。应用该系统，我们将人工合成HBV抗原表位寡核苷酸序列插入到重组pETFHVDNA上，构建携带HBV抗原表位的重组质粒pETE，经NsiⅠ和NcoⅠ双酶切筛选和DNA序列测定无误后转化BL21细胞，高水平表达嵌和蛋白。经SDSPAGE和考马斯亮蓝染色和Westernblot分析结果表明，这些嵌和蛋白为携带有HBV抗原表位的重组FHV外壳蛋白。

携带HBV重组抗原表位的嵌和蛋白在BL21中的表达与鉴定携带HBV抗原表位的重组质粒pETFHVE在BL21转化细胞中高水平表达了携带HBV抗原表位的嵌合蛋白FHVE,其分子质量与阳性对照相同，约为45000。经SDSPAGE和考马斯亮蓝染色及Westernblot分析结果表明，重组抗原表位显示了抗原性。

重组抗原表位ELISA检测敏感性分析我们用嵌和蛋白为包被抗原用间接ELISA法检测58份乙肝患者血清中抗HBs抗体，检测阳性率为%，高于ELISA试剂盒检测的62%。

重组抗原表位Westernblot以嵌和蛋白为包被抗原用Westernblot检测58份乙肝患者血清中抗HBs抗体，检出阳性率为68%。

3讨论

抗原表位在疫苗及诊断应用研究中的意义根据HBsAgS蛋白的抗原性不同，将HBV分为9个血清型［6，7］：ayw1、ayw2、ayw3、ayw4、ayr、adw2、adw4、adrq-、adrq+。HBVS蛋白第120～第160氨基酸序列是HBV的交叉中和抗原表位即a表位［8］，可诱导产生交叉中和抗体，保护成人免受各HBV亚型的感染。本研究进一步表明，HBVa重组抗原表位可与临床不同来源的血清抗HBs发生特异性结合，具有疫苗研究和诊断意义。

新型抗原表位表达载体系统对于抗原表位来说，决定其免疫原性和抗原性的因素除了氨基酸序列，更重要的是分子的空间构象和呈递给免疫细胞识别的方式。利用FHVRNA2表达载体在大肠杆菌中表达的抗原表位具有良好的免疫原性，免疫小鼠产生了交叉中和抗体［9］，并已成功的在该系统中表达了HIV1V3、轮状病毒Vp4抗原表位和HCV抗原表位，并诱导中和抗体和交叉中和体产生［1，10，11］。HBV抗原表位在FHVRNA2载体系统可中高效地表达，并近似天然构象，能被天然抗HBs抗体特异性识别结合，具有良好的抗原性，在以其为包被抗原用ELISA和Weternblot检测抗HBs中检测敏感性与ELISA诊断试剂盒差异无显著性，在HBV诊断试剂和重组抗原表位亚单位疫苗研究中具有重要意义