第四章基因工程所需的基本条本

第四章基因工程所需的基本条本第一页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五基因工程操作过程第二页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为“工具酶”。第三页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五一类来源于原核生物的，能够识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列（回文序列，4—8bp），并切割DNA双链,使磷酸二酯键断开的核酸内切酶。

1.定义第一节限制性核酸内切酶（Restrictionendonuclease）√×第四页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五II型限制性内切酶：同型二聚体结构与DNA双链结合，两个催化Mg2+与DNA裂解位点相邻限制性内切酶EcoRI的结构第五页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五

（2）修饰（Modification）细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护,不能被自身的限制性内切酶识别切割。2、细菌的限制和修饰系统（R/M体系）（1）限制（Restriction）限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。第六页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五研究发现，限制-修饰系统广泛存在在原核细菌中，与三个连锁基因相关：Genesforrestriction-modificationenzymesareoftenclusteredtogetherinaregioncalledan"immigrationcontrolregion".TheimmigrationislandfromE.coliK-12isabout14Kbp.第七页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五噬菌体DNA进入细菌后，其基因组DNA被降解第八页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五3、类型分类的主要依据：亚单位组成识别序列的种类是否需要辅助因子分三类(I,II,III)第九页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五第十页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五

（1）酶结构三亚基，包括：R（限制酶亚基）；M（甲基化酶亚基）；S（识别DNA序列亚基）（2）切割位点

切割位点在识别位点1000bp以外，无特异性

4、I型限制性内切酶

首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌B株和K株分离的，如EcoB和EcoK，研究较少。Recognizesitecut1-1.5kb第十一页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五（3）结合方式

I类限制性内切酶与DNA结合依赖M亚基与辅助因子S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的相互作用。

第十二页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五例子：EcoB的识别序列为T-G-A*-N8-T-G-C-TA-C-T-N8-A*-C-G-AEcoK的识别序列为A-A*-C-N8-G-T-G-CT-T-G-N8-C-A*-C-G第十三页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五

II类限制性内切酶(93%)II类限制性内切酶由H.O.Smith等1970年首先在流感嗜血杆菌Rd型菌株中发现。目前已有3000多种II类限制性内切酶被分离，它是分子量较小的单体蛋白，识别和切割双链DNA分子时仅需要Mg2+,识别和切割位点的序列有严格的特异性。

（1）酶结构修饰和限制活性由分开的两个酶(甲基化酶和限制性内切酶)来完成，其中甲基化酶由一条肽链构成，限制酶由相反方向结合的同源二聚体构成。

第十四页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五

（2）识别序列DNA双链上的回文对称序列（旋转对称序列，反向重复序列），一般长4-8bp，与DNA的来源无关。EcoRI：5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’EcoRV第十五页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’

产生粘性末端EcoRV5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’

产生平齐末端（3）切割位点识别位点处切开双链DNA，形成粘性末端（stickyend）或平末端（bluntend）。第十六页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五几种II型限制性核酸内切酶的酶切位点PstIProvindenciastuartii164

CTGCAGGACGTCHaemophilusinfluenzaeRd

第十七页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五（4）粘性末端（stickyends，cohensiveends）含有几个核苷酸单链的末端分两种类型：①5’端凸出（如EcoRI切点）GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’第十八页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五EcoRI等产生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’

退火4-7℃5‘…G-C-T-G

A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A

G-C-T-C…5’OHPOHP第十九页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五PstI等产生的3‘粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI37℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’

退火4-7℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHP第二十页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五PvuII等产生的平头末端5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’PvuII37℃5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’

第二十一页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五粘性末端促进连接便利

i）不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。ii）同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。第二十二页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五第二十三页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五识别相同序列的限制性内切酶称同裂酶。（5）同裂酶（Isoschizomers)①同序同切酶（完全同裂酶）：识别位点和切点完全相同。如HindⅢ和HsuI。HindⅢ5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’HsuI5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’第二十四页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五识别位点相同，但切点不同。如XmaI和SmaI。②同序异切酶（不完全同裂酶）：XmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’

第二十五页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端的酶。如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等（6）同尾酶(Isocaudamers）5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BamHIBclI5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’

5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’BglⅡ5’-UGATCY-3’3’-YCTAGU-5’XhoⅡU代表嘌呤；Y代表嘧啶。第二十六页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五5’-GATC----3’3’----CTAG-5’

Sau3A同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。5’-G3’-CCTAG

GATCT-3’

A-5’BamHIBglⅡ5’-GGATCT-3’3’-CCTAGA-5’BamHIBglⅡSau3A第二十七页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五（7）DNA末端长度对限制酶切割的影响PstIGCTGCAGC

TGCACTGCAGTGCA

AACTGCAGAACCAA

0

10

>90

0

10

>90

EcoRIGGAATTCC

CGGAATTCCG

CCGGAATTCCGG>90

>90

>90>90

>90>90

第二十八页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五（8）酶切反应条件①缓冲液：MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和离子强度

Tris-HCl：维持pH；二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定②反应温度：大多数为37℃③反应时间：通常1h,许多酶延长反应时间可减少酶量④终止酶切的方法：a、10mM/LEDTAb、加热，大多数酶可用65℃温育20分钟失活C、苯酚抽提蛋白，然后用乙醇沉淀DNA第二十九页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五

一个酶单位（U）指：在理想的反应条件（适宜的缓冲液和反应温度，通常为37℃）下，50L反应体系中完全降解1gDNA所需要的酶量。影响酶活性的因素很多，最重要的有：ADNA的纯度和甲基化程度B甘油的含量（不超过5%）C反应体系中的离子强度D反应体系的pH值F反应的温度条件（通常为37℃

）Buffer(10X)2.0LWater16.5LDNA1.0LEnzyme0.5LVolume20.0L酶单位的定义和影响酶活性的因素第三十页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五酶切反应的基本步骤＋－电泳紫外分析37℃1h加反应液CKM1.0kb1.0kb0.4kb0.5kb0.6kbCKMTT酶量的确定：2-3倍才能保证完全消化；第三十一页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五（10）双酶切反应1）对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切2）对盐浓度要求不同的酶，也可采取同步双酶切：选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。3）如果找不到一种可以同时适合两种酶的缓冲液，就只能采用分步酶切。分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求，然后加入第二种酶完成双酶切反应。第三十二页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五第三十三页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五

3.III类限制性内切酶（＜1%）由R亚基和MS亚基二亚基组成双功能酶，其中MS亚基具有位点识别和甲基化修饰双重活性。在切割位点下游24-26bp处，反应需要ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。该类酶与DNA识别位点的结合严格依赖ATP。修饰作用和切割作用取决于两个亚基之间的竞争。修饰作用在识别位点内进行。切割序列位于识别位点一侧若干碱基对处，无序列特异性。在基因工程操作中用途不大。

第三十四页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五EcoP15I

M.EcoP15I

第三十五页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五1973年H.OSmith和D.Nathans提议的命名系统，命名原则如下：三、限制性内切酶的命名

1.用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。大肠杆菌（Escherichiacoli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示。2.用一个大写字母表示菌株或型。如Ecok,EcoR。

3.如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示。如EcoRI，EcoRV。第三十六页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五限制性核酸内切酶的命名第三十七页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五四、影响限制性内切酶活性的因素DNA的纯度DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。一般采取①纯化DNA，如用2.5倍体积的冰冷乙醇沉淀②加大酶的用量③延长保温时间④扩大反应体积（>20l）第三十八页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五2.DNA的甲基化程度大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：dam甲基化酶（修饰GATC中的A）；dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG的C）。基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株！第三十九页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五3.温度不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37oC

，少数要求40-65oC

。酶最适温度oC酶最适温度oC酶最适温度oCApaIBclIMaeII305050ApyIBstEIIMaeIII306055BanIMaeISmaI504525第四十页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五4.缓冲液(Buffer)是影响限制酶活性的重要因素。商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。缓冲液的化学组成MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和离子强度；Tris-HCl：维持pH；二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；

第四十一页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五第二节基因工程中常用的DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶2.Klenow片段3.T4噬菌体DNA聚合酶4.T7噬菌体DNA聚合酶5.反转录酶6.末端转移酶第四十二页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五共同特点把dNTPs连续地加到引物的3’—OH端。2.主要区别持续合成能力和外切酶活性不同。如：T7DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。常用的DNA聚合酶的特点第四十三页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五1.大肠杆菌DNA聚合酶I（1）大肠杆菌DNA聚合酶I（DNAPolI）的性质①一条多肽单链②5’3’DNA聚合酶活性③5’3’外切酶活性，位于N端，用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉N端的5’3’外切酶活性部分，就成为Klenowfragment④3’

5’外切酶活性。

第四十四页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五①底物：

dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）②Mg2+③带有3’—OH游离端的引物④DNA模板（2）DNA聚合酶I的反应条件-OH5’3’dNTPs第四十五页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘5‘…G-C-T-CA-G-C-T-G-GA-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘（3）DNA聚合酶I基本用途：制备32P标记的探针DNAaseIDNAPolIMg2+5‘dNTP5‘pppdA（a-32P-dATP）DNAaseI：为一内切核酸酶，它优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链或单链DNA，形成单链切口第四十六页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五2.Klenowfragment（1）Klenowfragment的性质具有5’3’聚合酶活性和3’5’外切酶活性。（失去了5’3’外切酶活性）。DNAPolIKlenowfragment(76KD）枯草杆菌蛋白酶第四十七页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五①3’端补平补平限制性内切酶切后形成的3’隐蔽端。5’5’klenow②DNA3’末端标记

在3’隐蔽端加上放射性标记的dNTP。klenow（2）主要用途第四十八页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五3’隐蔽末端的DNA片断Klenowfragment补平根据末端的顺序选择一种-32P-dNTPs末端标记的DNA限制性内切酶切5’----G3’3’----CTTAA5’5’----GAA3’3’----CTTAA5’5’----GAATT3’3’----CTTAA5’5’----G3’3’----CCTAG5’5’----GG3’3’----CCTAG5’5’----GGATC3’3’----CCTAG5’EcoRIBamHI-32P-dATP-32P-dGTP25oC1h第四十九页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五（1）T4DNA聚合酶的性质从T4噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中分离纯化。有5’3’聚合酶活性和3’5’外切酶活性（约为Klenow片段活性的200倍）。3.T4DNA聚合酶用3’5’外切酶活性作用于末端制造出3’隐蔽端。再利用它的5’3’聚合酶活性补平，并加入放射性标记的dNTP。第五十页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五5’5’3’3’5’5’3’3’T4DNA聚合酶无dNTPsT4DNA聚合酶有dNTPs5’5’当没有dNTP时，T4DNA聚合酶行使3’5’外切酶功能，制造出3’隐蔽端。当有dNTP时，T4DNA聚合酶行使5’3’聚合酶功能，填平3’隐蔽端。第五十一页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五5.逆转录酶依赖RNA的DNA聚合酶（RNA指导的DNA聚合酶），来源于RNA肿瘤病毒,最普遍使用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒（avianmyeloblastosisvirus,AMV）。作用：以oligodT为引物（与mRNA的polyA尾巴互补结合），合成cDNA。AAAAATTTTT5’3’mRNA5’cDNA第五十二页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTPs5‘p3‘HOOH3‘p5‘末端转移酶Mg2+dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAAAOH3‘p5‘

6.末端转移酶来源于小牛胸腺，是一种不依赖于模板的DNA聚合酶。可在cDNA或载体的3’末端加同聚物尾巴，便于克隆。第五十三页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五一、连接酶1.两种DNA连接酶（1）大肠杆菌连接酶:只能连接粘性末端。（2）T4噬菌体的连接酶:不但能连接粘性末端,还能连接齐平末端。2.连接条件（1）必须是两条双链DNA。（2）DNA3’端有游离的-OH,5’端有一个磷酸基团。（3）需要能量动物或噬菌体中：ATP大肠杆菌中:NAD+第三节其它分子克隆工具酶第五十四页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五OHP3、功能：（1）修复DNA链上切口处的磷酸二酯键：T4-DNA连接酶5‘…

G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-GA-C-G-G-C-C-T-C…5’nick5‘…

G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C…5’第五十五页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五（2）连接多个平头双链DNA分子：5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C

…

5’5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C

…

5’

T4-DNA连接酶第五十六页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五4、连接反应的温度最佳温度：连接酶反应的最佳温度是37C。实用温度：在37℃下粘性末端的结合很不稳定，所以一般采用4~16C。插入片段与载体的浓度比例：10~20倍（摩尔之比）目的：增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。第五十七页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五DNA连接酶DNA连接酶的反应条件Tris-HCl50-100mMpH7.5MgCl210mMATP0.5-1mMDTT5mMVolume10-20ul4-15℃4-16hr1UDNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下16℃反应1小时，完全连接1mgl-DNA（HindIII片段）所需的酶量第五十八页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五二、碱性磷酸酶1.碱性磷酸酶种类从大肠杆菌中分离出来，具有抗热性。Bacterialalkalinephosphatase，BAP（1）细菌性碱性磷酸酶（2）小牛肠碱性磷酸酶Calfintestinalalkalinephosphatase，CIP从小牛肠中纯化出来，SDS中加热68oC可完全失活。第五十九页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五2.碱性磷酸酶的特性催化脱掉DNA（或RNA）5’端的磷酸根。3’P--OH5’3’HO--P5’5’3’HO--OH5’3’HO--OH碱性磷酸酶3.碱性磷酸酶的功能（1）防止线性化的载体分子自我连接第六十页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五单一酶切口的载体的粘性末端容易自我连接。AAGCTTTTCGAAHindⅢ酶切A-OHTTCGA-PP-AGCTTHO-A碱性磷酸酶5’5’5’第六十一页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五A-OHTTCGA-OHHO-AGCTTHO-AOH与OH不能形成磷酸二酯键，所以不能自我连接。但同一酶切后的外源DNA的5’端有P，能与脱磷酸的载体OH连接。第六十二页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五ATTCGAAGCTTAAGCTTAATTCGA连接酶-OH与-OH连不住其中每条链上都有一个nick，但转入细菌后会被修复。3’P-AGCTTA-OH5’3’HO-ATTCGA-P5’外源DNA第六十三页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五四、核酸酶1、单链核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII）大肠杆菌的核酸外切酶VII不需要Mg2+ExoVII3’5’3’5’3’5’3’5’第六十四页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五2、双链核酸外切酶：核酸外切酶III（ExoIII）大肠杆菌的核酸外切酶III特异性地从3‘端外切ExoIII3’5’3’5’Mg2+3’5’3’5’第六十五页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五λExo3’5’3’5’Mg2+3、双链核酸外切酶：λ核酸外切酶（λExo）λ核酸外切酶特异性地从5‘端外切3’5’3’5’第六十六页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五4、单链核酸内切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基本特性：来自稻谷曲霉菌（Aspergillusoryzae）降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍Zn2+必需最适pH范围为4.0-4.3需要NaCl10-300mM降解单链DNA的速度比降解单链RNA快7倍第六十七页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五一、载体的功能及特征1、定义：把目的基因通过运载工具送到受体细胞内，这种运载工具就叫载体（vector)。2、载体的特征1）在宿主细胞内必须能够自主复制（具备复制起点）2）具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点，供外源DNA片断插入，同时不影响复制3）有一定的选择标记，用于筛选第四节用于基因克隆的载体第六十八页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五3、载体的种类质粒载体（plasmid）噬菌体载体（phage）动物病毒（virus）噬菌粒载体考斯质粒（cosmid）人造染色体（artificalchromosome）第六十九页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五二、质粒载体

质粒（plasmid）：独立于染色体以外的能自主复制的双链、共价、闭合、环状DNA分子,大小范围在1kb-200kb以上不等。质粒存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。细菌的大质粒可含几百个基因，小质粒仅含20～30个基因。第七十页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五①致育质粒，F质粒（fertilityplasmid），编码有性生殖功能，带有F质粒的细菌为雄性菌，能长出性菌毛，无F质粒的细菌为雌性菌，无性菌毛。

②耐药性质粒编码细菌对抗菌药物或重金属盐类的耐药性，耐药性质粒分为二类，其中可以通过细菌间的接合进行传递的称接合性耐药质粒，又称R质粒(resistanceplasmid)。另一类是不能通过接合传递的非接合性耐药质粒，但它可通过噬菌体传递。④细菌粘附定植在肠粘膜表面是由K质粒决定的。⑤细菌素质粒编码各种细菌产生细菌素，如Col质粒编码大肠杆菌素，对同品系或近缘的细菌具有抑制作用，实际是对产生细菌素细菌本身起保护作用。

⑥代谢质粒编码产生相关的代谢酶，如沙门菌发酵乳糖的能力通常是由质粒决定的。

细菌携带有哪种质粒，则有相应的功能，但也有某种质粒可同时决定几种功能，如F质粒除有致育性功能外，还能提供辅助质粒转移的能力，某些耐药性质粒上还带有编码毒力的基因，故带此种质粒的细菌，不仅获得了耐药性，而且致病性也得到了增强。③毒力质粒或Vi质粒（virulenceplasmid）编码与该菌致病性有关的毒力因子。第七十一页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五

天然质粒用作载体的局限性天然质粒相对分子质量拷贝数单一酶切位点选择性标记复制类型pSC1015.8×1069.09kb1~3EcoRItetr严紧ColE14.2×10620EcoRI大肠杆菌素松弛RSF21247.4×10610EcoRI(BamHI)ampr松弛局限性：分子量高、拷贝数低、合适的单一酶切位点少、选择标记不合适第七十二页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五1.质粒的空间构型：①共价闭合环状DNA（CovalentclosecircularDNA，cccDNA)，呈超螺旋（supercoil，SC）②开环DNA（opencircular，ocDNA），一条链上有一至数个缺口。③线形DNA（Linear，LDNA）DNA超螺旋结构第七十三页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五质粒空间构型与电泳速率：同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同，scDNA最快、lDNA次之、ocDNA最慢。SCOCL第七十四页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五2、质粒的基本性质1）质粒的自主复制性质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制。根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型。①严紧型质粒（stringentplasmid）拷贝数少，大约有1-几个拷贝。②松弛型质粒（relaxedplasmid）拷贝数多，有10—60份拷贝。

第七十五页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五2）质粒的不相容性任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质粒组成不相容性群。以大肠杆菌的质粒为例：ColE1、pMB1拥有相似的复制子结构，彼此不相容；pSC101、F、RP4拥有相似的复制子结构，彼此不相容。第七十六页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五质粒的不相容性分子机制：两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定。因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内。两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，由于竞争作用致使两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。

第七十七页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五质粒不亲和性a：在同一个细胞中含有两种不相容的质粒b：随着细胞的分裂质粒分配到两个子细胞中去c：在下一次细胞分裂之前，质粒拷贝数加倍，但因为存在竞争，增加拷贝数不同d：两种不相容质粒拷贝数比例发生变化，最终产生出只含有一种类型质粒的子细胞第七十八页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五在大肠杆菌中的质粒，可以分为：接合型质粒:能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），多为低拷贝的大质粒，含有完整的转移操纵子基因（tra）和转移起始位点。能在同种或亲缘关系近的菌体细胞间进行转移。非接合型质粒：不能在天然条件下独立地发生接合作用，多为高拷贝的小质粒，如大肠杆菌的ColE1、RSF1010等。由于缺少转移基因（tra），不能自主转移，但由于含有与F质粒类似的bom位点或诱动基因mob（mobilization），因而能被带有tra基因的转移性质粒诱动而发生转移。

3）质粒的转移性第七十九页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五大肠杆菌接合（conjunction）F因子：又叫致育因子，在某些大肠杆菌中发现的一种最具代表性的单拷贝的接合型质粒，94kb，总共编码19个转移基因（tra），以三种形式存在。第八十页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五3、质粒上的标记基因野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，但是对DNA重组分子的筛选具有重要意义包括：物质抗性：抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成：细菌毒素、天然色素、有机碱第八十一页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五第八十二页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五第八十三页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五第八十四页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五标记基因用途：1）选择标记基因：鉴别目的DNA（载体）的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来。2）筛选标记基因：用于将携带了外源DNA片断的重组子挑选出来。第八十五页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五4、质粒的命名用小写字母p代表质粒（plasmid），在p字母后用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名称，再加上质粒编号。如：pBR322：p表示一种质粒，而“BR”则是分别取自该质粒的两位主要构建者F.Bolivar和R.L.Rodriguez，322为编号。第八十六页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五5、质粒载体的种类1）克隆质粒载体（cloningvector）：主要用于扩增或保存DNA片断，其上有复制子，最好是松弛型高拷贝；2）表达质粒载体（expressionvector）：能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体。这类载体既有复制子，更要有强启动子；3）穿梭质粒载体（shuttlevector）：装有针对两种不同受体的复制子，便于基因克隆。这类载体可以在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。第八十七页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五1）克隆质粒载体天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。第八十八页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五

目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的：

pSC101

8.8kb,拷贝数5、四环素抗性标记基因TetrColE1

6.5kb,拷贝数20–30、大肠杆菌内毒素标记基因E1RSF2124

ColE1衍生质粒、氨苄青霉素抗性标记基因Ampr第八十九页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五组成:它由三部分组成：来自pSCl01的四环素抗性基因Tetr来自RSF2124的氨苄青霉素抗性基因Ampr。来自ColEl的衍生物pMBl的松弛复制起点ori常用质粒克隆载体：pBR322，4376bp第九十页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五pBR322质粒载体的结构来源第九十一页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五特点:具有多个单一的限制性内切酶位点。

Tetr中有BamH1切点（G↓GATCC）和SalⅠ切点（G↓AATTC），Ampr中有PstⅠ切点（CTGCA↓G）。利用ColEl的复制子，所以在细胞中是多拷贝的。第九十二页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五重组克隆的“插入失活”筛选方法

外源基因→插入在Tetr中，基因型为TetsAmpr

；外源基因→插入在Ampr中，基因型为TetrAmpr；Tetr：在含有四环素培养基可生长；Tets：在含四环素培养基上不生长；Ampr：在含有氨卞青霉素培养基上不生长；Amps：在含有氨卞青霉素培养基上可生长；而在两种抗生素培养基上都生长的是非重组型。

这种在一个基因位点中插入外源DNA片段，从而使该基因活性丧失的现象叫插入失活（insertionalinactivation

）。第九十三页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五pBR322质粒载体tetr基因插入失活效应第九十四页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五常用质粒克隆载体：pUC系列

pUC18/19特点：具有更小的分子量（2686bp）和更高的拷贝数（500-700个）。具有多克隆位点，很方便插入外源基因含有氨苄青霉素抗性基因可用α-互补方法鉴别(含有一个来自于大肠杆菌的经过加工的LacZ’基因)第九十五页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五第九十六页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五αbpUC18/19：正选择标记lacZ’的显色原理5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷X-galβ-半乳糖苷酶的α-肽段lacZ’MCSPlac突变型lac-E.coli溴氯吲哚第九十七页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五LacZ:大肠杆菌的编码β-半乳糖苷酶基因，编码1024个氨基酸，切断乳糖的半乳糖苷键产生半乳糖和葡萄糖

LacZ’:编码β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸，这个编码区中插入了一个MCS，但它并不破坏读框，但是，若在该DNA小片段中再插入一个片段，将几乎不可避免地导致产生无α-互补能力的β-半乳糖苷酶片段X-gal：5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷，也是β-半乳糖苷酶的一种生色底物，经降解后可生成溴氯吲哚，呈蓝色，也使大肠杆菌菌落从白色转变为蓝色第九十八页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五α-互补(Alphacomplementation)

：质粒中插入lacZ’基因，编码N端146个氨基酸残基（β-半乳糖苷酶的α片段）。突变型lac-E.coli可表达该酶的β片段（酶的C端）。单独存在的α及β片段均无β半乳糖苷酶活性，只有宿主细胞与克隆载体同时共表达两片段时，宿主细胞内才有β半乳糖苷酶活性，使底物X-gal特异性变为蓝色化合物，这就是所谓的α-互补。

BlueWhite第九十九页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五（2）表达质粒1）大肠杆菌中的表达质粒包括启动子、操纵位点序列、多克隆位点、转录及翻译信号、质粒复制起点及筛选标记等2）真核表达质粒酵母表达质粒昆虫表达质粒哺乳动物细胞表达质粒第一百页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五1）大肠杆菌中的表达质粒第一百零一页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五启动子（promoter）：是与基因表达启动相关的顺式作用元件，与RNA聚合酶特异结合，是基因转录的起始部位，分为两类：一类是RNA聚合酶能够直接识别的，另一类在与RNA聚合酶结合时需要蛋白质辅助因子存在。序列特点：上游有-10，共同序列TATAAT（Pribnowbox）；上游有-35，共同序列TTGACA第一百零二页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五Lac启动子（Plac）：中等强度启动子，一般带有lacZ’基因片段，实现α-互补。λ噬菌体左臂（λPL)和右臂启动子（λPR)

：是λ噬菌体早期左臂和右臂转录控制区，启动效率高，广泛使用的原核生物启动子。Trp启动子（Ptrp）：是强启动子，来源于大肠杆菌色氨酸操纵子，在富含trp的培养基中处于关闭状态，当trp水平下降，Ptrp开始转录。T7启动子（PT7）：来自于T7噬菌体晚期转录基因启动子，只能由T7聚合酶识别（其转录活性是大肠杆菌聚合酶6倍，因此PT7转录活性高。第一百零三页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五lac操纵元结构调节序列结构基因操纵子：以乳糖操纵子为例来说明第一百零四页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五异丙基硫代半乳糖苷(isopropylthiogalactoside,IPTG)就是其中一种很强的诱导剂，不被细胞代谢而十分稳定。第一百零五页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五核糖体结合位点（ribosomebindingsite，RBS）：大肠杆菌中翻译起始时，首先是核糖体30S小亚基识别并结合至mRNA5’端的翻译起始部位，该部位就是RBS。RBS包括起始密码子ATG序列及其上游SD序列。SD序列：ATG上游3~11碱基处的保守序列AGGAG，可与小亚基中16SrRNA3’端富含嘧啶序列互补结合，mRNA必须有这一序列才能进入核糖体。第一百零六页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五转录终止区（terminator）：是DNA分子中决定RNA聚合酶终止转录的一段回文核苷酸序列。分为两类：不依赖ρ因子的终止子的回文序列中富含GC碱基对，在回文序列的下游方向又常有6～8个AT碱基对；而依赖ρ因子终止子中回文序列的GC对含量较少。在回文序列下游方向的序列没有固定特征，其AT对含量比前一种终止子低。

第一百零七页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五大肠杆菌中蛋白表达形式(1)完整目的蛋白(2)融合蛋白：两个或多个基因的开放阅读框按一定顺序连接在一起表达形成的蛋白。

当蛋白质表达以后，有效的分离纯化或分泌就成为获得目标蛋白的关键因素。通过以融合蛋白的形式表达，并利用载体编码的蛋白或多肽的特殊性质可对目标蛋白进行分离和纯化。用作分离的载体蛋白被称为标签蛋白或标签多肽（Tag），常用的有谷胱甘肽转移酶（glutathioneS-transferase,GST）、六聚组氨酸肽（polyHis-6，6×Histag）、金黄色葡萄球菌蛋白质A或G（proteinA,proteinG）等。第一百零八页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五融合蛋白的表达载体（1）GST融合表达载体GST是来源于血吸虫的小分子酶（26kDa），在E.coli易表达，在融合蛋白状态下保持酶学活性，对谷胱甘肽有很强的结合能力。第一百零九页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五

GST表达载体在启动子tac和多克隆位点之间加入了两个与分离纯化有关的编码序列，其一是谷胱甘肽转移酶基因，其二是凝血蛋白酶（Thrombin）切割位点的编码序列。当外源基因插入到多克隆位点后，可表达出由三部分序列组成的融合蛋白。将谷胱甘肽固定在琼脂糖树脂上形成亲和层析柱，当表达融合蛋白的全细胞提取物通过层析柱时，融合蛋白将吸附在树脂内，其它细胞蛋白就被洗脱出来。然后再用含游离的还原型谷胱甘肽的缓冲液洗脱，可将融合蛋白释放出来。再用凝血蛋白酶切割融合蛋白，便可获得纯化的目标蛋白。除了凝血蛋白酶的切割位点外，其它还有肠激酶。第一百一十页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五（2）his(组氨酸）标签表达载体启动子下游有一段编码6个组氨酸的序列，多聚组氨酸肽能与2价金属离子结合（镍离子），将镍离子固定在树脂上，便可对带His标签的融合蛋白进行亲和层析分离。第一百一十一页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五真核表达载体酵母表达载体昆虫表达载体哺乳动物细胞表达载体

第一百一十二页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五

酵母表达载体酿酒酵母和毕赤酵母毕赤酵母载体:均为大肠杆菌-毕赤酵母穿梭载体第一百一十三页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五毕赤酵母启动子（来自乙醇氧化酶基因AOX1），受到甲醇严格控制。第一百一十四页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五哺乳动物细胞表达质粒载体包括:1）大肠杆菌的复制子及抗生素抗性基因：便于基因工程操作2）哺乳动物的启动子和增强子：使外源基因表达3）含有终止信号及加polyA信号：polyA上游11~30bp处有一高度保守的AAUAAA序列，下游富含GU或U第一百一十五页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五Neomycin：G418第一百一十六页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五绿色荧光蛋白（greenfluorescenceprotein，GFP）：从水母体内发现的发光蛋白，分子质量为26kDa，由238个氨基酸构成，第65～67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团，是主要发光的位置。其发光团的形成不具物种专一性，发出荧光稳定，且不需依赖任何辅因子或其他基质而发光。绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因。如利用GFP的示踪特性，研究肿瘤细胞内某些基因异常表达与肿瘤细胞浸润的关系，即可揭示肿瘤细胞浸润的某些机制。

第一百一十七页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五内部核糖体进入位点序列（Internalribosomeentrysite,IRES）。IRES能招募核糖体对mRNA进行独立地翻译。第一百一十八页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五3）穿梭质粒穿梭载体（Shuttlevector）是能够在两类不同宿主中复制、增殖和选择的载体。这类载体可以在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。酵母、昆虫、哺乳动物细胞等使用的表达载体，一般都有在大肠杆菌中复制的元件，因此都具备穿梭载体的特征，如大肠杆菌/酵母、大肠杆菌/昆虫细胞、大肠杆菌/哺乳动物细胞穿梭载体等。

第一百一十九页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五5、质粒DNA的分离纯化实验室一般使用下列2种方法制备质粒DNA：1)氯化铯密度梯度离心法质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染2)碱裂解法方便、快速，满足一般需要第一百二十页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五1）氯化铯密度梯度离心法：

原理：是一种沉降平衡离心法，经超速离心，离心介质CsCl形成一连续的密度梯度，在过量EB存在的条件下，各种不同密度的物质经离心平衡后得以分开。其中蛋白质密度小（1.3g/cm3～1.4g/cm3），浮于液面；RNA密度大（2.0g/cm3），沉于管底；各种DNA密度介于蛋白质与RNA之间，处于中部。过量EB处理前，细菌染色体DNA与不同分子构型的质粒DNA的密度均为1.7g/cm3左右，难以区分。经过量EB处理后，不同分子构型的DNA与EB的结合能力不一样，因而密度下降不一致，可有效分离。其中，闭环质粒DNA为超螺旋三级结构，EB不易插入，结合量少，密度下降小，约为1.59g/cm3；而染色体DNA、开环质粒DNA以及带切口的环状质粒DNA可以嵌入更多的EB，密度下降较多，约为1.54g/cm3，从而能与闭环质粒DNA分开。第一百二十一页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五proteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs过程：用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁加CsCl和溴乙锭超速离心过夜在紫外灯下吸取cccDNA稀释沉淀cccDNA第一百二十二页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五

2）碱变性法原理：碱变性法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异，在pH12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态；将pH调至中性并有高浓度盐存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态。通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。由于操作原因，提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。第一百二十三页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五第一百二十四页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五试剂1.LB培养基2.溶液I3.溶液Ⅱ4.溶液III5.TE(pH8.0)稳定ＤＮＡ

第一百二十五页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五

LB培养基

配制1升培养基，应在950ml去离子水中加入：细菌培养基用胰化蛋白胨(bacto-tryptone)10g细菌培养基用酵母提取物(bacto-yeastextract)5gNaCl

10g摇动容器直至溶质完全溶解，5mol/LNaOH(约0.2ml)调节pH值至7.0,加入去离子水至总体积为1L，15lbf/in2(1.034×105Pa)高压下蒸汽灭菌20分钟。第一百二十六页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五溶液I50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris·Cl(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)在10lbf/in2(6.895×104Pa)高压下蒸汽灭菌15分钟，保存于4℃。作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活第一百二十七页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五溶液II0.2mol/LNaOH(从5mol/L贮存液中现用稀释)1%SDS作用：细胞壁肽聚糖在碱性下水解，核酸和蛋白质变性。第一百二十八页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五溶液III5mol/L乙酸钾 冰乙酸 水 作用：酸性条件下质粒DNA复性，变性蛋白-SDS使线性DNA、蛋白沉淀第一百二十九页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到1.5-3ml含有相应抗生素的液体培养基，37℃培养12～16小时;取液体培养液1.5-3ml于Eppendorf管中，10000r/min离心1min，去掉上清液，加入100l溶液1，充分混匀放置3-5分钟;加入200l新配制的0.2mol/LNaOH+1％SDS（溶液II），加盖颠倒6-7次使之混匀；质粒小量提取的方法（手工提取）：第一百三十页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五加入150l溶液III，加盖后颠倒6-7次混匀，放置5min;用台式高速离心机，10000r/min离心7min，上清移入另一干净离心管，并加1ml100％乙醇混匀，12000r/min离心5min，弃去上清液;沉淀用0.5ml70％乙醇清洗一次，12000r/min离心5min，弃去上清液，小管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥;加入30-50l含有20g/mlRNase的灭菌蒸馏水或TE缓冲液溶解提取物，室温放置15-30min，使DNA充分溶解(有时需要酚:氯仿抽提);将分离出的质粒DNA置于-20℃保存备用。第一百三十一页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五1、λ噬菌体的生物学特性

三、λ噬菌体载体有尾部结构的二十面体λ噬菌体由外壳包装蛋白和DNA组成。第一百三十二页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五裂解周期和溶原周期

2、λ噬菌体的生活周期裂解周期第一百三十三页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五E.coliT4噬菌体的生命周期（以分钟记）t=0噬菌体吸附到寄主菌的细胞壁，大约在吸附的2秒钟内就会发生噬菌体DNA的注入；t=1寄主DNA、RNA和蛋白质的合成反应被全部关闭；t=2第一个噬菌体mRNA开始合成；t=3细菌DNA开始降解；t=5噬菌体DNA合成开始启动；t=9“晚期”噬菌体mRNA开始合成；t=12出现完整的头部和尾部结构；t=15出现头一个完整的噬菌体颗粒；t=22细菌发生溶菌作用，释放出约300个左右的噬菌体时粒第一百三十四页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五溶原周期

λ噬菌体感染大肠杆菌后，通过同源重组，将其DNA整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种状态称为溶原状态，这个过程称溶原化。整合主要由λ

-DNA上的cⅠ和int两基因的产物所激活。

原噬菌体（prophage)：整合到细菌染色体的噬菌体DNA称为原噬菌体，随细菌的染色体复制而复制。

第一百三十五页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五第一百三十六页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五3、λ噬菌体的基因组1）线状双链DNA分子，全长48.502bp。2）两端的5’末端具有12碱基的突出互补的粘性末端（cohensiveend，cos），该末端称为cos位点。3）当λ侵入宿主细胞后，线状DNA分子借助粘性末端连接成环状分子。5’--5’-3’3’-第一百三十七页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五第一百三十八页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五λDNA基因结构

b2区和重组基因区是λ噬菌体进入裂解周期的非必需区（~15kb，约占λ噬菌体DNA的1/3），可将该区缺失或用外源DNA片段取代，对噬菌体的感染和生长都不会造成影响。第一百三十九页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五4、λ-DNA载体的构建λ噬菌体的缺陷：⑴基因组太大（49kb），只能接纳一定长度的DNA。⑵酶切点太多，5个EcoRI位点和7个HindIII位点第一百四十页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五λ噬菌体的改造⑴切去非必须区段，在切去的同时，加载目的基因（2.5kb或更大）；⑵去掉太多的酶位点，每种酶只留1-2个切口；野生型的λ

-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不利于重组操作，必须删除至1-2个。同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加些单一的酶切位点。采用定点突变技术去除或增添酶位点。⑶增加标记基因；(4)引入无义突变。第一百四十一页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五体外包装插入位点体外包装插入片段插入型载体:通过特定的酶切位点允许外源DNA片断插入的载体（0-11kb)。第一百四十二页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五体外包装

体外包装插入片段插入片段置换型载体:允许外源DNA片断替换非必需DNA片断的载体(9-23kb)。第一百四十三页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五加装选择标记与质粒不同，野生型λ-DNA上缺少合适的选择标记，因此加装选择标记是λ-DNA克隆载体构建的重要内容,λ-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：免疫功能类标记imm434颜色反应类标记lacZ’第一百四十四页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五加装选择标记imm434imm434基因：编码一种阻止λ

-噬菌体进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记基因的λ-载体进入受体细胞后，建立溶原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；当外源DNA插入到标记基因中，基因灭活，λ-重组分子便进入溶菌循环，形成透明斑第一百四十五页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五加装选择标记lacZlacZ基因编码β-半乳糖苷酶，能催化无色的X-gal生成蓝色化合物。当外源基因插入到lacZ基因中，基因灭活，不能合成蓝色化合物；而空载体λ-DNA则产生蓝色透明斑第一百四十六页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五构建琥珀密码子的突变体

将野生型λ

-DNA上D和E两个头部包装蛋白的基因中的CAG密码子突变成UAG。当这种λ-DNA进入一般的大肠杆菌菌株后，不能合成有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂解细菌，这样就可以阻止有害重组体的生物污染及扩散，而基因工程实验中使用的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株，在琥珀密码子位点上可掺入酪氨酸、赖氨酸等一些其他氨基酸，编码完整肽链。第一百四十七页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五λ-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞5、λ-DNA重组分子的体外包装：第一百四十八页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五6、λ-DNA及其重组分子的分离纯化：1）将大肠杆菌培养至对数生长期

2）加入λ噬菌体或重组λ噬菌体的悬浮液，37℃培养1小时3）用新鲜培养基稀释，继续培养4-12小时4）这时噬菌体颗粒密度已达1013-1014/L，大肠杆菌细胞已完全裂解，超速离心，沉淀噬菌体，苯酚抽提，释放λ-DNA，乙醇或异丙醇沉淀λ-DNA

第一百四十九页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五能高效转染大肠杆菌装载能力为25kb，远远大于质粒的装载量重组λ-DNA分子的提取较为简便适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因7、λ-DNA作为载体的优点：第一百五十页，共一百九十五页，编辑于2023年，星期五2700个外壳蛋白分子M13噬菌体的外型呈丝状M13噬菌体由外壳包装蛋白和正链DNA组成M13噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长M13DNA全长6407个核苷酸M13DNA上至少有10个基因四、大