第十四章电泳分离技术演示文稿

第十四章电泳分离技术演示文稿本文档共96页；当前第1页；编辑于星期六\12点44分优选第十四章电泳分离技术本文档共96页；当前第2页；编辑于星期六\12点44分

电泳技术概述70年以来，电泳技术围绕制胶、电泳、染色三个技术环节，不断改进，以实现下列目标：

1、提高分辨率及灵敏度。

2、简化操作，缩短电泳时间。

3、扩大应用范围。目前，电泳技术已成为生物化学与分子生物学以及与其密切相关的医学、农、林、牧、渔、制药及某些工业分析中必不可少的手段。

本文档共96页；当前第3页；编辑于星期六\12点44分电泳是指带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。二、电泳技术的基本原理本文档共96页；当前第4页；编辑于星期六\12点44分蛋白质分子在不同pH下的解离状态NH3+NH3+NH2PPPCOOHCOO-COO-

pH＜pIpH＝pIpH＞pIpH>pI

分子带负电荷，在电场中向正极移动;pH<pI分子带正电荷，在电场中向负极移动;本文档共96页；当前第5页；编辑于星期六\12点44分u:泳动度or泳动率(cm/伏·秒or分)V:泳动速度:cm/秒or分E:电场强度:伏特/cmd:泳动距离:cmt:电泳时间:秒/分U:电压:常压(100—500v)

高压(500—10000v)仅需几分钟l:支持场的长度(有效长度)(一)、泳动度u(迁移率):

带电质点在单位强度电场下的泳动速度不同分子在同一电场中可能具有不同的泳动度本文档共96页；当前第6页；编辑于星期六\12点44分泳动度与带电颗粒所带净电荷的数量、颗粒大小和形状有关。被分离的球形分子在电场中所受的力(F)为：

F=EQ式中E：电场强度，即每厘米支持物的电位降；Q为被分离物所带净电荷。

泳动度本文档共96页；当前第7页；编辑于星期六\12点44分（二）、影响电泳速度的因素样品本身：带电量，分子大小，形状电场强度：电压缓冲液：成分，pH，离子强度支持介质：电渗作用，吸附作用温度本文档共96页；当前第8页；编辑于星期六\12点44分

影响泳动度的因素

1．电场强度

是指每厘米的电位降，也称电位梯度(电势梯度)。电场强度越高，则带电颗粒泳动越快。根据电场强度的不同，电泳可分为两种。(1)常压(100～500V)电泳

其电场强度为2～10V／cm。分离时间较长，从数小时到数十小时，适合于分离蛋白质等大分子物质。(2)高压(2000～10000V)电泳

其电场强度为50～200V／cm，电泳时间很短，有时只需几分钟。多用于分离氨基酸、多肽、核苷酸、糖类等小分子物质。本文档共96页；当前第9页；编辑于星期六\12点44分

影响泳动度的因素2．溶液pH

溶液的pH值决定带电颗粒的解离程度，亦即决定其所带电荷的多少。对蛋白质而言，溶液pH值离等电点(pI)越远，则颗粒所带的净电荷越多，泳动速度也越快；反之，则越慢。本文档共96页；当前第10页；编辑于星期六\12点44分

影响泳动度的因素3．溶液的离子强度

缓冲液离子强度越高，则颗粒的电动电势越小，泳动度也越小。一般最适合的离子强度在O.02～O.2之间。本文档共96页；当前第11页；编辑于星期六\12点44分

影响泳动度的因素4．电渗

电泳缓冲液相对于固体支持物的移动称电渗。如纸电泳时，滤纸吸附OH-带负电荷，与纸接触的缓冲液带正电荷向负极移动。本文档共96页；当前第12页；编辑于星期六\12点44分

影响泳动度的因素5．温度

电泳时会产生焦耳热，使介质黏度下降，分子运动加快，迁移率增加，同时温度过高会使样品中的生物大分子变性失活。因此电泳时，要控制电压或电流，也可安装冷却散热装置。6．支持物

要求是均匀，吸附力和电渗小，机械性能好，便于染色或紫外光下检测，故最好透明，无紫外吸收。本文档共96页；当前第13页；编辑于星期六\12点44分三、电泳的分类按形状分类：U型管电泳、柱状电泳、平板电泳；按载体分类：滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电泳、自由电泳；本文档共96页；当前第14页；编辑于星期六\12点44分按分离原理分类移界电泳（movingboundaryEP）不同的离子成分在均一的缓冲液系统中分离成独立的区带，可以用染色等方法显示出来，如果用光密度计扫描可得出—个个互相分离的峰;区带电泳(zoneEP)只能起到部分分离的作用，如将浓度对距离作图，则得出一个个台阶状的图形;等速电泳(isotachophoresis)在电泳达成平衡后，各区带相随，分成清晰的界面，以等速移动。按浓度对距离作图也是台阶状，但不同于上述移界电泳，它的区带没有重叠，而是分别保持;等电聚焦

(isoelectricfocusing)由多种具有不同等电点的载体两性电解质在电场中自动形成pH梯度。被分离物则各自移动到其等电点而聚成很窄的区带，分辨率很高。本文档共96页；当前第15页；编辑于星期六\12点44分AB+BABAABBAABCCBA移界区带ABC等速等电聚焦pH9876混合分立稳态时毗邻稳态时分立静止本文档共96页；当前第16页；编辑于星期六\12点44分1.连续系统：缓冲液的离子成分、PH、凝胶浓度、电位梯度都相同，带电颗粒电泳时仅具有电荷效应、分子筛效应。2.不连续系统：

缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度、电位梯度不连续，带电颗粒电泳时具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。根据操作方式分类本文档共96页；当前第17页；编辑于星期六\12点44分分子筛效应：分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。

分子量小，阻力小，移动快；分子量大，阻力大，移动慢。电荷效应：电荷量不同，迁移率不同。电泳作用效应本文档共96页；当前第18页；编辑于星期六\12点44分本文档共96页；当前第19页；编辑于星期六\12点44分㈠、凝胶电泳凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)琼脂糖凝胶电泳本文档共96页；当前第20页；编辑于星期六\12点44分1、琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，是由D—半乳糖和3、6—脱水—L—半乳糖结合的链状多糖。

本文档共96页；当前第21页；编辑于星期六\12点44分琼脂琼脂糖琼脂胶脱去SO42-丙酮酸酯基应用由于孔径大，对大多数蛋白来说，其分子筛作用微不足道。因此广泛应用于核酸的研究，分离范围广（200bp-50kb的DNA）.本文档共96页；当前第22页；编辑于星期六\12点44分琼脂凝胶电泳：常用pH6-9;离子强度0.02-0.05;硼酸盐缓冲液和巴比妥缓冲液；浓度常用1%-1.5%。琼脂凝胶电泳的优点：近似自由界面;液固相间无明显界面，电泳速度快;不吸收紫外线，可直接用紫外检测仪测定;容易染色易洗脱.本文档共96页；当前第23页；编辑于星期六\12点44分琼脂糖凝胶电泳的基本操作１、配制缓冲液贮备液２、水平型琼脂糖凝胶制备３、样品的制备与点样４、电泳５、染色６、样品回收-紫外-+本文档共96页；当前第24页；编辑于星期六\12点44分水平板式电泳槽垂直板式电泳槽本文档共96页；当前第25页；编辑于星期六\12点44分﹢﹣﹣﹢本文档共96页；当前第26页；编辑于星期六\12点44分在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭（EB）--ethidiumbromide染色，此时，核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ngDNA所形成的条带。核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系:共价闭环超螺旋结构DNA>直线DNA>双链环状DNA本文档共96页；当前第27页；编辑于星期六\12点44分2、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE)早在1959年由Raymends和

Weintraub．L建立。1964年，此法进一步从理论和实验技术上得到改进并推广应用。由于具有较高的分辨率和灵活性，目前已被广泛应用于蛋白质等生物大分子的分离和分析。

本文档共96页；当前第28页；编辑于星期六\12点44分聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）原理PAGE是根据被分离物质所带电荷的多少及其分子大小、形状不同，在电场作用下产生不同的移动速度而分离。它具有电泳和分子筛双重作用.本文档共96页；当前第29页；编辑于星期六\12点44分

聚丙烯酰胺凝胶构成聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂

N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED)和催化剂过硫酸铵(AP)或核黄素(C17H2O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。本文档共96页；当前第30页；编辑于星期六\12点44分■凝胶的聚合反应：Ammoniumpersulfate(freeradicalinitiator)过硫酸铵

Acrylamide(monomer)Bis(acrylamide)(bridge)TEMED(catalyst):四乙基乙二胺自由基的生成者凝胶的基本單位:丙烯酰胺交联使聚合产生分枝:甲叉丙烯酰胺帮助传递自由基的催化剂Acrylamide有毒性！-(OS-SO)442-2SO4CH2=CH-CO-NH212112核黄素-TEMED系统与过硫酸铵-TEMED系统本文档共96页；当前第31页；编辑于星期六\12点44分■

联丙烯酰胺单体聚合过程：聚合反应交联剂造成分枝端点自由基可再延续freeradicalBisBis聚合反应交錯连結本文档共96页；当前第32页；编辑于星期六\12点44分丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺

聚丙烯酰胺凝胶具有一定的网状结构。如果形成的孔径大小接近于所分离样品分子的平均半径，样品分子在通过凝胶孔洞时，所受到的阻力就会和样品分子的大小及形状有关。本文档共96页；当前第33页；编辑于星期六\12点44分聚丙烯酰胺凝胶的优点①在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；②化学性能稳定，与被分离物不发生化学反应；③对pH和温度变化较稳定；④几乎无电渗作用；⑤样品不易扩散，其灵敏度可达10-6g；⑥凝胶孔径可通过选择单体及交联剂的浓度调节；⑦分辨率高；PAGE应用范围广，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量及少量的制备，还可测定相对分子质量、等电点等。本文档共96页；当前第34页；编辑于星期六\12点44分一些概念凝胶浓度和交联度不连续胶与连续胶变性胶及非变性胶SDS(Sodiumdodecylsulfate)十二烷基磺酸钠本文档共96页；当前第35页；编辑于星期六\12点44分凝胶的浓度和交联度凝胶浓度：

T（Acr和Bis总浓度）=(a+b)/m.100%交联百分比：

C（交联剂的百分比）=b/(a+b).100%a:Acr浓度；b:Bis浓度；m:缓冲液体积本文档共96页；当前第36页；编辑于星期六\12点44分凝胶的浓度和交联度浓度和交联剂浓度决定胶的物理状态及分子筛的孔径的大小一般浓缩胶：2-5%，a:b=20分离胶：7-10%，a:b=40标准胶浓度：7%本文档共96页；当前第37页；编辑于星期六\12点44分在浓度为7.5%

的凝胶中，大多数生物体内的蛋白质能得到满意的分离效果。因此，把浓度为7.5%

凝胶称为标准胶。对于一个未知样品，常用7.5%的标准胶或4%-10%

的凝胶梯度来测试，而后选出适宜的凝胶浓度。本文档共96页；当前第38页；编辑于星期六\12点44分连续胶与不连续胶:连续胶：胶条(胶板)的浓度、pH值、组成成份不变不连续胶:胶条(胶板)的浓度、pH值、组成成份变化本文档共96页；当前第39页；编辑于星期六\12点44分连续胶的制胶过程与点样过程玻璃板

(前,后)样本梳间隔条间隔条本文档共96页；当前第40页；编辑于星期六\12点44分浓缩胶分离胶不连续胶的制胶过程与点样过程玻璃板

(前,后)样本梳间隔条间隔条本文档共96页；当前第41页；编辑于星期六\12点44分■

电泳凝胶系統的組成：1电泳系統pH胶体浓度缓冲液上层

(负极)缓冲液

2样品溶液3浓缩胶

6.9

4分离胶

胶体

5下层

(正极)缓冲液

Tris-HClTris-HClTris-glycine

Tris-glycine

Tris-glycine

8.3

8.3

8.3

8.3

5%

7.5~20%

-

-

-

●

不连续胶有聚焦样品的作用本文档共96页；当前第42页；编辑于星期六\12点44分聚丙烯酰胺凝胶电泳原理三种物理效应

⑴样品浓缩效应

⑵分子筛效应⑶电荷效应三种物理效率使样品分离效果好，分辨率高本文档共96页；当前第43页；编辑于星期六\12点44分（1）样品浓缩效应：由凝胶系统的不连续性产生。

①凝胶孔径不连续性②缓冲液离子成份的不连续性

③pH的不连续性本文档共96页；当前第44页；编辑于星期六\12点44分

⑴．样品浓缩效应

凝胶孔径的不连续性

样品胶及浓缩胶为大孔胶；分离胶为小孔胶。在电场作用下，样品颗粒在大孔胶中泳动的阻力小，移动速度快；当进入小孔胶时，受到的阻力大，移动速度减慢。因而在两层凝胶交界处，样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。本文档共96页；当前第45页；编辑于星期六\12点44分■浓缩胶对蛋白质分子的集焦作用：分离胶浓缩胶样本8.96.9离子缺乏空间ABC++8.3本文档共96页；当前第46页；编辑于星期六\12点44分

⑵．分子筛效应

大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。蛋白质进入pH8.9的同一孔径的分离胶后，分子小且为球状的蛋白质分子所受阻力小，移动快，走在前面；反之，则阻力大，移动慢，走在后面，从而通过凝胶的分子筛作用将各种蛋白质分成各自的区带。这种分子筛效应不同于柱层析中的分子筛效应，后者是大分子先从凝胶颗粒间的缝隙流出，小分子后流出。本文档共96页；当前第47页；编辑于星期六\12点44分图中圆球分别代表大、中、小3种不同分子量的蛋白质。大、中、小分子分别滞留在与分子大小相当的凝胶孔径中，不再前进，因而分离成3个区带。本文档共96页；当前第48页；编辑于星期六\12点44分

⑶．电荷效应

在pH8.9的分离胶中，各种带净电荷不同的蛋白质有不同的迁移率。净电荷多，则迁移快；反之，则慢。因此，各种蛋白质按电荷多少、相对分子质量及形状，以一定顺序排成一个个区带，因而称为区带电泳。本文档共96页；当前第49页；编辑于星期六\12点44分变性胶与非变性胶：变性胶：胶电泳在蛋白质变性的状态下进行，主要指SDS变性条件下进行；非变性胶：电泳在蛋白质保持天然状态下进行，不加变性剂。本文档共96页；当前第50页；编辑于星期六\12点44分

3、SDS电泳SDS即十二烷基硫酸钠(SodiumDodecylSulfate，简称SDS)是阴离子表面活性剂，它能以一定的比例和蛋白质结合，形成一种SDS--蛋白质复合物。此复合物可用具有SDS的聚丙烯酰胺凝胶(包括连续的和不连续的系统)电泳进行分离，通常把这种电泳称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称SDS)。它的主要用途是分离蛋白质和测定其分子量。本文档共96页；当前第51页；编辑于星期六\12点44分⑴.SDS原理

聚丙烯酰胺凝胶电泳能有效地把不同类型的蛋白质分开的主要依据，是样品中各种物质的电荷和分子量的差异性。而SDS—PAGE的主要依据，则是各种物质分子量的差异性。因为当SDS与蛋白质结合后，蛋白质分子即带有大量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷，从而使天然蛋白质分子问的电荷差别就降低乃至消除了。与此同时蛋白质在SDS作用下结构变得松散，形状趋向一致，所以各种SDS一蛋白质复合物在电泳时产生的泳动率差异，就反映了分子量的差异。本文档共96页；当前第52页；编辑于星期六\12点44分SDS与PAGE有什么区别？SDS（十二烷基磺酸钠）+蛋白线性复合物使复合物所带负电荷远超过天然蛋白本身电荷，消除了电荷效应，而分子量占主导。本文档共96页；当前第53页；编辑于星期六\12点44分H-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-O-S-O-Na+HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHOONon-polarHydrophobictailHydrophilicheadSDS（C12H25NaO4S）

SodiumDodecylSulfate十二烷基磺酸钠

SDS是一种阴离子去污剂，它在水溶液中以单体和分子团的混合形式存在。这种阴离子去污剂能破坏蛋白质分子之间以及与其他物质分子之间的非共价键，使蛋白质分子内的二硫键被还原剂打开并不易再氧化，这就保证了蛋白质分子与SDS充分结合从而形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。本文档共96页；当前第54页；编辑于星期六\12点44分SDSProteinSDSandProteins本文档共96页；当前第55页；编辑于星期六\12点44分

蛋白质分子与SDS充分结合后，所带上的SDS负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而也就掩盖或消除了不同种类蛋白质分子之间原有的电荷差异。

这样的蛋白质-SDS复合物在SDS聚丙烯酰胺凝胶系统中的电泳迁移率便不再受蛋白质原有电荷和形状等因素的影响，而主要取决于蛋白质分子量大小。本文档共96页；当前第56页；编辑于星期六\12点44分SDS本文档共96页；当前第57页；编辑于星期六\12点44分XYZ+SDSNativeSDS分子量及净电荷密度均影响泳动率只有分子量

影响泳动率XYZ-+-本文档共96页；当前第58页；编辑于星期六\12点44分SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）本文档共96页；当前第59页；编辑于星期六\12点44分缓冲液样品缓冲液凝胶缓冲液电泳缓冲液1xSDS:50mmol/LTris-Hcl(PH6.8)100mmol/LDTT2%SDS0.1%溴酚蓝10%甘油Tris碱用盐酸一次调PH成功0.1%SDS1xTris–

甘氨酸:25mmol/LTris250mmol/L甘氨酸(PH8.3)0.1%SDS本文档共96页；当前第60页；编辑于星期六\12点44分主要试剂及相关问题：1、Acr和Bis

比例29：1，此时分辨率最佳，凝胶成透明；避光室温保存，隔几个月重配。2、SDS

电泳级10%母液，室温储备。3、分离胶、浓缩胶的Tris缓冲液

PH6.8PH8.8神经毒！！！刺激呼吸系统！！本文档共96页；当前第61页；编辑于星期六\12点44分主要试剂及相关问题：4、TEMED(四甲基乙二胺)

通过催化过硫酸铵形成自由基，加速Acr-Bis聚合。低PH聚合反应受到抑制。5、过硫酸铵提供引发聚合反应的自由基。10%4℃保存.6、Tris-GlyBuffer吸入致命、挥发性强极其易燃，周围不得有明火！！！每周新配！！安全！本文档共96页；当前第62页；编辑于星期六\12点44分凝胶浓度及其分离范围丙烯酰胺浓度线性分离范围/kDa1512107.55.010-4312-6020-8036-9457-212本文档共96页；当前第63页；编辑于星期六\12点44分SDS电泳装置本文档共96页；当前第64页；编辑于星期六\12点44分实验步骤安装玻璃板本文档共96页；当前第65页；编辑于星期六\12点44分灌注分离胶加水膜约30min后，胶凝聚后用水清洗几遍！并吸干残存的液体本文档共96页；当前第66页；编辑于星期六\12点44分灌注浓缩胶灌满！本文档共96页；当前第67页；编辑于星期六\12点44分根据需要插入不同的梳子30min左右加电泳缓冲液，再拔梳子！本文档共96页；当前第68页；编辑于星期六\12点44分拔梳子后形成点样孔孔周围有膜，用针拨开本文档共96页；当前第69页；编辑于星期六\12点44分点样，电泳本文档共96页；当前第70页；编辑于星期六\12点44分-+本文档共96页；当前第71页；编辑于星期六\12点44分蛋白质电泳中SDS凝胶检测常采用的染色方法有:考马斯亮蓝、硝酸银染色、荧光染色法。本文档共96页；当前第72页；编辑于星期六\12点44分染色液配制：

0.1%考马斯亮蓝R250(先用甲醇充分溶解)50%甲醇

10%冰乙酸

40%蒸馏水滤纸过滤脱色液配制：

10%甲醇

10%冰乙酸

80%蒸馏水5倍体积染色4小时以上，脱色摇床，中间更换几次脱色液本文档共96页；当前第73页；编辑于星期六\12点44分硝酸银染色银染的机制:来源于摄影银染技术,是将蛋白分子结合的银离子还原作成金属银。优点:检测灵敏度高,较普通考马斯亮蓝染色灵敏度要高50-100倍,可在蛋白质中找到含量较低的蛋白,而且所需的上样量较少(每点仅需0.1ｎｇ)。缺点:可重复性差耗费人力质谱测定有一定的干扰本文档共96页；当前第74页；编辑于星期六\12点44分本文档共96页；当前第75页；编辑于星期六\12点44分

在某一PH下，蛋白质分子在电场中不再移动，即静电荷为零，则此PH值即为该蛋白质的等电点。4、等电聚焦本文档共96页；当前第76页；编辑于星期六\12点44分

聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(IsoelectricFocusing，简称IEF)：利用各种蛋白质pI不同，以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体(carrierampholytes)，两性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的pH梯度。在电场作用下，蛋白质在此pH梯度凝胶中泳动，当迁移至pH值等于pI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区带。本文档共96页；当前第77页；编辑于星期六\12点44分PI2

PI3

PI1

++-+++--+---PH增加+_蛋白质123蛋白质在电场中，等点聚焦示意图本文档共96页；当前第78页；编辑于星期六\12点44分本文档共96页；当前第79页；编辑于星期六\12点44分电泳系统中加进两性电解质载体，当通已直流电时，两性电解质载体即形成一个由阳极到阴极连续增高的pH梯度。Pr进入时，不同的Pr移动到与其等电点相当的pH位置上，从而使不同等电点的Pr得以分离。优点：分辨率高，区带清晰、窄，加样部位自由，重现性好，可测定Pr或多肽的等电点。缺点：需无盐溶液，不适用于在等电点不溶解或发生变性的Pr。本文档共96页；当前第80页；编辑于星期六\12点44分第二向根据蛋白质的分子量大小不同在垂直方向或水平方向进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS)5、双向电泳第一向根据蛋白质的等电点不同在PH梯度胶中等点聚焦（isoelectricfocusing,IEF)本文档共96页；当前第81页；编辑于星期六\12点44分本文档共96页；当前第82页；编辑于星期六\12点44分本文档共96页；当前第83页；编辑于星期六\12点44分蛋白质双向电泳中SDS凝胶检测常采用的染色方法有考马斯亮蓝、硝酸银染色、荧光染色法、免疫染色法以及蛋白质印迹法。

染色本文档共96页；当前第84页；编辑于星期六\12点44分6、变性梯度凝胶电泳变性梯度凝胶电泳（denaturinggelgradientelectrophoresis，DGGE）温度梯度凝胶电泳（Temperaturegradientgelelectrophoresis，TGGE）恒定变性胶电泳（Constantderatararedgelelectrophoresis，CDGE）本文档共96页；当前第85页；编辑于星期六\12点44分分离原理：