免疫组化技术

制片过程可能遇到的问题一、 组织脱水时间的掌握脱水时间与组织大小，厚薄关系很大。组织厚、大，脱水时间须长些；而小、薄的组织脱水时间相对短些。组织脱水过度表现为：切片时组织较硬、干、易碎；镜下易见核固缩明显，核染色后表现为墨点。可将蜡块放到95%乙醇甘油1：1混合液中软化再行切片。二、 切片不完整或切片困难的原因实质性的器官，如淋巴结、肝、脾组织因细胞丰富，脱水透明时间不宜过长，否则易导致细胞严重脱水；浸蜡温度过高也会导致组织收缩变硬变脆。纤维瘤、脂肪结缔组织等如取材过厚，纤维组织膜可阻止脱水透明和浸蜡过程，导致组织脱水不彻底、石蜡不易浸透、组织过软。新鲜组织宜及时固定。脱水、透明要保持最后一缸试剂的纯度。浸蜡温度不超过65°C，包埋用蜡温度应高于浸蜡温度。夏季温度高可用熔点60-62°C切片石蜡；冬天气温低，可用56-58C切片石蜡。三、 切片皱缩、折叠、破碎、裂纹的原因可能刀锋变钝、刀锋上粘有蜡屑、切片刀角度太小或组织浸蜡时间不够。漂片水温过高，如淋巴结、脑组织及含黏液成分较多的组织切片，放到过高水温中未及时展片，易粘在一起形成折叠，还可能将含脂肪的组织烫碎。切片刀有小缺口，组织中有钙化、异物、包埋；蜡温过低、蜡块中出现小白点等。都可造成切片的裂纹。四、 切片染色对比不佳的原因切片脱蜡不彻底，细胞不易着色；切片过厚导致细胞重叠；苏木素染得时间过长，分化时间不够，胞核着色深，核仁分辨不清。表面有氧化金属膜的苏木素染液易污染切片，应及时过滤；苏木素染色超过5min，染色效果不佳应及时更换，否则延长染色时间易造成核浆共染。脱蜡入水后切片成云雾状，应延长脱蜡时间或更换脱蜡用试剂。分化后肉眼观查切片呈淡蓝色为良好。为了节约成本，梯度酒精请以95%乙醇配制:先将95%乙醇注入量杯，其量同将要稀释酒精浓度数字相等。加入蒸馏水，致总量达到原酒精浓度的数字量。例如：用95%酒精配制成70%酒精取95%酒精70毫升；加蒸馏水使达到95毫升；稀释后的酒精即为70%的酒精。病理制片步骤（仅供参考）一、 组织固定、脱水（共15h）甲醛3h—70%乙醇2h—80%乙醇2h—90%乙醇1.5h—95%乙醇1.5h—95%乙醇1.5h—95%乙醇1.5h—100%乙醇1h—100%乙醇1h二、 组织透明（共1.5h）二甲苯I45min—二甲苯II45min三、 组织浸蜡（共3h，也可过夜）石蜡I1h—石蜡II1h—石蜡III1h四、 组织包埋五、 切片、烤片六、 切片脱蜡至水洗二甲苯5min—二甲苯5-10min—100%乙醇1min—100%乙醇1min—95%乙醇1min—85%乙醇1min—75%乙醇1min—自来水洗2min，蒸馏水洗2min七、 HE染色苏木素5-8min，水洗—盐酸酒精分化10-30sec，水洗—1%氨水返蓝3-4sec，流水冲洗（3-5min）—1%伊红Y1min八、 切片脱水、透明、封片70%乙醇30sec—80%乙醇30sec—95%乙醇1min—100%乙醇1min—100%乙醇1min—二甲苯1min—二甲苯1min—滴中性树胶、盖玻片一、 苏木素染液：A液：苏木素2.5g溶于10ml无水乙醇中B液：硫酸铝钾25g,蒸馏水330ml，稍加热溶解A液加入B液中搅匀，再依次加入：碘酸钠250-450mg甘油150ml冰醋酸10ml新配制的染液需染12-16min（加碘酸钠250mg），染液放置1-2w后着色力最强。苏木素从配制-成熟-失效，有一个过程，一种简便的方法判断其是否成熟、何时失效：取一滴苏木素染液，滴入一杯自来水中，如果沉在水底不散开，且呈红色，是未成熟的；如果很快散开，且呈紫蓝色，为成熟，此时染色效果最好，如果呈蓝色，表示染液失效。二、 伊红染液伊红Y（水溶）蒸馏水若取用伊红Y（醇溶性