DPPH·体外清除实验研究萝芙木水溶性生物碱抗氧化活性

DPPH·体外清除实验研究萝芙木水溶性生物碱抗氧化活性

【摘要】目的研究萝芙木水溶性生物碱(WSAR)的抗氧化活性。方法根据DPPH·体系吸光值的变化研究催吐萝芙木水溶性生物碱清除自由基的能力，DPPH·反应体系为ml×10-5mol·L-1DPPH·+ml样品溶液，反应时间30min。考察了不同浓度WSAR和特丁基对苯二酚(TBHQ)与DPPH·自由基清除率的关系。结果DPPH·自由基的清除能力IC50(WSAR)=×10-4g/ml,IC50(TBHQ)=×10-5g/ml。结论萝芙木水溶性生物碱具有抗氧化活性，可以开发为天然抗氧化剂。

【关键词】水溶性生物碱;抗氧化;自由基;萝芙木

AntioxidantPotentialofWaterSolubleAlkaloidsfromRauvolfiaStudybyDPPH·invitroAssay

Abstract：ObjectiveTostudytheantioxidantpotentialofwatersolublealkaloidsfromRauvolfia(WSAR)bystudyingabsorptionspectrumofDPPH·reactionTheconditionwasdrawnasfollows,DPPH·reactionsystemwasmlof×10-5mol·L-1DPPH·+mlofsamplesolutionwiththereactiontimeof30min.TherelationbetweenDPPH·radicalscavengingrateandtheconcentrationofWSARandTBHQwerestudied,andIC50(thevalueofantioxidantconcentrationforscavenginghalfofDPPH·radical)wasusedastheindextoevaluatescavengingThedeterminingIC50valueswereasfollows:IC50(WSAR)=×10-4g/mlandIC50(TBHQ)=×10-5g/WatersolublealkaloidsfromRserpentinacanbeusedasnaturalantioxidant.

Keywords：Watersolublealkaloids;Freeradical;Antioxidant;Rauvolfia

研究表明，适量的自由基在免疫反应、细胞分化、细胞凋亡和其它生化代谢过程中起着重要的作用，然而过量的自由基则在机体中引起一系列生物学反应，导致细胞、亚细胞和分子结构的破坏，并随着破坏层次逐渐扩展造成功能损伤，引起心血管疾病、癌症和衰老等，它是构成很多疾病的病基础。因此合理地使用抗氧化剂可以有效地预防和治疗某些疾病，延缓衰老。

合成抗氧化剂往往具有一定的毒副作用，使得它们的使用受到严格控制。而天然抗氧化剂副作用较小，因此，寻找高效、价廉、低毒甚至无毒的天然抗氧化剂的备受关注。

夹竹桃科萝芙木有135种，主要分布在美洲、非洲、大洋洲和亚洲，我国分布有9种和4变种。萝芙木在非洲和印度被广泛作为民间草药。自从1952年Muller等从印度萝芙木(Rauvolfiaserpentina)中提取出利血平并发现它具有降压和安定作用之后，各国科学家对萝芙木脂溶性成分进行了大量研究，发现了一系列单萜吲哚类生物碱[5～7]，并对其中一些成分进行抗炎、降血脂、降血压和镇静等药理研究[8～10]，但是对萝芙木抗氧化活性的研究报道甚少，2007年，Al-qirim等[11]报道了印度萝芙木标准提取物能够保护小鼠心肌免受过氧化自由基的伤害。由于萝芙木的民间用药多为水溶性成分，为了对萝芙木传统的药理作用做进一步的研究，本实验以海南引种的催吐萝芙木RauvolfiavomitoriaAfzel.exSpreng为原材料制备水溶性生物碱，并对其进行体外清除DPPH·自由基活性的研究，测定自由基的清除能力，评价萝芙木的抗氧化活性。

1材料与仪器

材料与试剂催吐萝芙木干根(海南省五指山市海南制药厂提供)粉碎过40目筛，TBHQ(广东省食品工业研究所)，有机溶剂均为国产分析纯。

DPPH·母液：称取mgDPPH·(2,2-二苯基-1-苦基肼，sigma-Aldrich)溶于少量体积分数为95%乙醇中，最后定容至100ml(即×10-4mol/L)，置于冰箱中冷藏备用。

仪器与设备722S可见分光光度计(上海棱光技术有限公司)，BT-244-S型电子天平(德国Sartorius)。

2方法与结果

水溶性生物碱的制备以催吐萝芙木生药粉为材料制备乙醇提取物浸膏，然后采用雷氏铵盐沉淀法制得水溶性生物碱，具体方法见文献[12]。

萝芙木水溶性生物碱清除DPPH·自由基能力

水溶性生物碱清除DPPH·能力的测定方法采用文献[13,14]所述方法：将DPPH·贮备液用体积分数95%乙醇稀释至×10-5mol/L。按表1加样，总体积3ml。用光径1cm的比色皿在517nm处测定各吸光值(A)。每一吸光值平行测定3次，最后取其平均值。DPPH·自由基清除率按式①计算：清除率(%)=(1-Ai-AjAo)×100%①表1DPPH·反应体系加样表

DPPH·自由基稳定性实验为了了解DPPH·自由基体系在催吐萝芙木水溶性生物碱作用下吸光值A随时间的变化规律，取适量水溶性生物碱用体积分数95%的乙醇配制成质量浓度为mg/ml样品溶液，按照“”项下方法，每隔2min测定吸光值A。吸光值随时间变化规律如1。A值在最初20min内下降较快，在20～30min内，反应体系的A值变化缓慢，30min后A值基本保持不变。故测定催吐萝芙木水溶性生物碱与DPPH·自由基的反应时间为30min。

图1加样品后DPPH·吸光度A随时间变化曲线

DPPH·自由基清除率与样品浓度关系称取适量水溶性生物碱用体积分数95%的乙醇倍比稀释配制成质量浓度分别为，，，，，mg/ml的样品溶液。测定各样品溶液对DPPH·自由基的清除率。催吐萝芙木水溶性生物碱对DPPH·自由基清除率与样品浓度关系见表2。表2水溶性生物碱对DPPH·自由基的清除效果

根据上述数据，可得催吐萝芙木水溶性生物碱清除DPPH·自由基的剂量-效应关系，如2。由图2可知，在～mg/ml范围，DPPH·自由基清除率随着样品质量浓度的增加而增大，在mg/ml时，清除率为%，而在mg/ml时，清除率达到%。

图2催吐萝芙木水溶性生物碱对DPPH·自由基清除作用的剂量-效应关系

数据分析采用SAS(STATISTICALANALYSISSYSTEM)对表2数据进行统计分析，以Reg过程进行一元非线性回归分析，建立催吐萝芙木水溶性生物碱对DPPH·自由基清除作用的剂量-效应回归方程。

回归方程显着性分析见表3，模型Y=a+bX+cX2的参数a=48，b=26，c=-06，a达到显着水平()，b和c均达到极显着水平()，在此基础上建立的催吐萝芙木水溶性生物碱对DPPH·自由基清除作用的剂量-效应回归方程为式②。相关系数R2=8，说明该回归方程具有可靠性，能较好的解释催吐萝芙木水溶性生物碱对DPPH·自由基清除作用的剂量-效应关系。Y=48+06X2②表3回归方程显着性分析

催吐萝芙木水溶性生物碱的抗氧化水平抗氧化剂清除DPPH·自由基能力采用IC50表示。IC50的物理意义为当抗氧化剂对DPPH·自由基清除率达到50%时的质量浓度，IC50值越低，抗氧化剂清除自由基的能力越强。由回归方程计算出DPPH·自由基清除率为50%时所需的样品质量浓度IC50=×10-4g/ml。

3结论

研究催吐萝芙木水溶性生物碱对DPPH·自由基体系吸光值的变化，认为采用分光光度法测定催吐萝芙木水溶性生物碱对DPPH·自由基体外清除实验的条件是反应体系经30min后在517nm波长下测定吸光值。

提出以IC50值作为评价样品清除DPPH·自由基能力的指标，通过测定不同质量浓度的催吐萝芙木水溶性生物碱对DPPH·自由基清除率曲线，计算出其IC50值为×10-4g/ml。特丁基对苯二酚(TBHQ)是现今食品医药行业广为的合成抗氧化剂，在与WSAR同等条件下测定TBHQ对DPPH·自由基的清除能力IC50为×10-5g/ml。这表明萝芙木水溶性生物碱具有较强的抗氧化活性。萝芙木化学成分多以吲哚类生物碱为主，而生物碱是自然界中具有强生理活性的氮杂环化合物[15]，深入研究，可以开发成天然抗氧化剂。

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