免疫实验技术

关于免疫实验技术第1页，讲稿共24页，2023年5月2日，星期三利用免疫学原理来检测抗原、多种免疫分子(抗体、补体、细胞因子和粘附分子等)及免疫细胞的实验过程。有助于疾病的辅助诊断、治疗及预后判断。第2页，讲稿共24页，2023年5月2日，星期三

一、凝集反应

颗粒性抗原（细胞、细菌等）或吸附于免疫无关载体上的可溶性抗原与相应抗体，在适量电解质的存在下，形成肉眼可见的凝集团块。

1、直接凝集反应（1）玻片凝集试验ABO血型鉴定（2）试管凝集试验肥达试验效价（滴度）：以出现明显抗原抗体反应现象的最高稀释度作为待检抗原（或抗体）的含量。

第3页，讲稿共24页，2023年5月2日，星期三凝集反应（agglutination)颗粒型抗原细菌、细胞＋抗体（凝集素）电解质（生理盐水）＋37℃～50℃数小时凝集反应（凝集成团）第4页，讲稿共24页，2023年5月2日，星期三1.直接凝集试验玻片法试管法含有已知抗体的诊断血清待检菌液生理盐水特点简便、快速不能定量UUUU待检血清盐水简便、快速能定量肥达氏试验（widaltest)伤寒、副伤寒已知抗原第5页，讲稿共24页，2023年5月2日，星期三ABO血型鉴定红细胞表面抗原抗A抗体抗B抗体血型A+-AB-+BH--OA,B++AB第6页，讲稿共24页，2023年5月2日，星期三2、间接凝集反应指可溶性抗原(或抗体)吸附在乳胶颗粒或红细胞等载体表面与相应抗体(或抗原)结合反应，在适宜的条件下，出现凝集现象。正向间接凝集反应用可溶性抗原包被载体以检测抗体。反向间接凝集反应用抗体包被载体以检测抗原。第7页，讲稿共24页，2023年5月2日，星期三第8页，讲稿共24页，2023年5月2日，星期三

二、沉淀反应可溶性抗原与相应抗体结合，当两者比例合适，并有适量电解质存在时，形成肉眼可见的沉淀物或沉淀线。

第9页，讲稿共24页，2023年5月2日，星期三沉淀试验（precipitationtest）可溶性抗原细胞裂解液＋抗体（沉淀素）电解质（生理盐水）＋37℃～50℃数小时沉淀反应（清澄液中出现混浊沉淀）第10页，讲稿共24页，2023年5月2日，星期三沉淀反应分类（1）琼脂扩散试验a.单向琼脂扩散试验

b.双向琼脂扩散试验（2）免疫电泳试验对流免疫电泳：原理：在阴极孔内加抗原，阳极孔内加抗体。通电后，抗原带负电荷较多，分子较小，向阳极泳动；抗体分子带负电荷较少，加上分子量大，在琼脂的电渗作用下向阴极泳动。（3）环状沉淀试验

第11页，讲稿共24页，2023年5月2日，星期三（1）单向扩散试验（Singleredialdiffusiontest）预先混有抗体第12页，讲稿共24页，2023年5月2日，星期三（2）双向扩散试验（Doublediffusiontest）第13页，讲稿共24页，2023年5月2日，星期三（3）对流免疫电泳作用及特点：抗体球蛋白移向阴极，抗原分子移向阳极，当两者在适当比例处相遇，即形成灰白色沉淀线。检查乙型肝炎抗原及甲胎蛋白，敏感度比双向扩散法高约10倍，只需1～2小时即可获得检验结果。不能定量测定。AgAb_+第14页，讲稿共24页，2023年5月2日，星期三三、免疫标记技术原理：利用酶、荧光素、胶体金、发光物质以及放射性核素等标记物来标记抗原或抗体，再与标本中的抗体或抗原反应，最后测定复合物中的标记物。优点：特异、敏感、快速，可作定性、定量或定位测定。

第15页，讲稿共24页，2023年5月2日，星期三依据检测物分两类：

1.免疫组化技术(immunohistochemicaltechnique)，用于组织/细胞中抗原或抗体的定位；2.免疫测定(immunoassay)，用于液体标本中抗原或抗体的检测。依据标记物的不同，可分为：酶免疫技术、荧光免疫技术、金免疫技术、化学发光免疫技术和放射免疫技术。

1、酶免疫技术

酶免疫技术是以酶标记的抗体或抗原进行抗原抗体反应。第16页，讲稿共24页，2023年5月2日，星期三酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)属固相酶免疫测定ELISA原理：把待测标本(含有未知抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的顺序与固相抗原或抗体起反应，再洗涤固相载体，随后加入酶的底物，底物受酶催化转变为有色产物。根据颜色的深浅对待测物质定性或定量。第17页，讲稿共24页，2023年5月2日，星期三三种试剂：①固相抗原或抗体即把抗原或抗体用合适的方法连接到固相载体表面，同时保留它们的免疫活性；②酶标抗原或抗体即把某些酶用合适的方法连接到抗原或抗体表面，同时保留它们的免疫活性以及酶的催化活性。常用的酶是辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)；③酶作用的底物常用的底物是邻苯二胺第18页，讲稿共24页，2023年5月2日，星期三ELISA的类型：

(1)双抗体夹心法测抗原

1）已知抗体包被2）洗板3）加待检抗原标本4）洗板5）加酶标记抗体6）洗板7）加底物显色，测定第19页，讲稿共24页，2023年5月2日，星期三（2）间接法

测抗体

1）己知抗原包被2）洗板3）加待检病人血清4）洗板5）加酶标记抗人IgG6）洗板

7）加底物显色，测定（3）竞争法测抗原或抗体测定抗原：在待测管中加入受检抗原和酶标抗原，使它们同固相抗体进行竞争性结合。第20页，讲稿共24页，2023年5月2日，星期三酶联免疫吸附试验（ELISA）间接法Ag待检血清酶标抗抗体检测抗体双抗体法Ag检测抗原待检抗原抗原竞争法Ag待检抗原酶标抗原Ag检测抗原第21页，讲稿共24页，2023年5月2日，星期三

2、胶体金免疫技术

以胶体金为标记物的抗原抗体反应。常与膜载体技术结合，包括斑点金免疫渗滤试验和斑点金免疫层析试验等。斑点金