幽门螺杆菌NCTC11639基因hpaA的克隆表达及鉴定

幽门螺杆菌NCTC11639基因hpaA的克隆表达及鉴定【摘要】目的获取幽门螺杆菌hpaA基因的序列，预测其编码蛋白hpaA作为候选疫苗的可行性，在大肠杆菌表达系统中表达hpaA。方法提取Hp标准株NCTC11639的基因组DNA，使用PCR扩增hpaA基因，克隆入pGEMT载体中测序，并进行同源性分析。将hpaA克隆入表达载体pGEX4T1中，诱导表达，SDSPAGE电泳鉴定。结果同源性分析表明hpaA具有很高的保守性，成功构建出可以高效、分泌型表达hpaA的原核表达系统。结论hpaA具有高保守性，在Hp各菌株中普遍存在，是有良好应用前景的Hp候选疫苗。

【关键词】hpaA基因；克隆表达；SDSPAGE

【Abstract】ObjectiveTheintentionofthisstudycanbesubscribedinthreeaspects:obtainingthesequenceofHelicobacterpylorigenehpaA,predictingwhetherproteinhpaAhaspotentialtobecomeavaccinecandidateofHpandexpressinghpaAinheterogeneousexpressionsystem.MethodsThehpaAgenewasamplifiedfromthegenomeofHpstrainNCTC11639andthenclonedintovectorpGEMT.Thesequencehasbeenobtainedbysequencingtherecombinantvector.ThepGEX4T1wasusedtoconstructexpressionsysteminstrainBL21andtheexpressionresultverifiedbySDSPAGE.ResultsThehomogeneousanalysisshowedthathpaAisahighlyconservativeefficientandsecretiveexpressionsysteminBL21wasconstructed.ConclusionTheresearchindicatesthathpaAisauniversalandhighlyconservativegeneandhpaAisapromisingvaccinecandidateofHelicobacterpylori.

【Keywords】GenehpaA；Cloneandexpression；SDSPAGE

幽门螺杆菌(helicobacterpylori，Hp)是慢性胃炎和消化性溃疡的重要致病菌，并与胃腺癌和胃粘膜相关B细胞淋巴瘤的发生密切相关。如何有效控制Hp感染，一直为国内外学者所关注。目前临床上多采用抗生素治疗Hp感染，但Hp容易产生耐药性，导致抗生素治疗失效，并且Hp未能根除，大多数患者很快又旧病复发，因此开发疫苗被认为是控制Hp感染最有效的方法。但迄今为止，尚未开发出成功Hp的疫苗，筛选合适的抗原表位仍是目前Hp疫苗研究的热点。Hp的主要粘附素为N乙酰神经氨酰乳糖结合原纤维样血凝素(Nacetylneuraminyllactosebindinghaemagglutinin，NLBH)，hpaA是其亚单位，并且作为核心组成部分，主要参与编码鞭毛鞘壳和外膜中的脂蛋白［1-3］。hpaA在Hp感染过程中不可或缺，hpaA突变的Hp菌株无法在小鼠体内定植［4］，目前hpaA的具体功能尚未阐明。本项研究旨在探讨hpaA蛋白作为抗Hp感染的候选疫苗的可行性，拟构建可高效表达hpaA的原核表达系统，并获得重组hpaA蛋白。

1材料和方法

菌株与培养基Hp标准株NCTC11639、大肠杆菌Top10及BL21来源于本实验室菌种库。重组大肠杆菌所用培养基为LB培养基。

实验试剂细菌基因组提取试剂盒、质粒小量提取试剂盒、DNAMarker均购自天为时代，一管式PCR反应体系及PCR产物纯化试剂盒购自英韦创津公司，限制性内切酶BamHI和HindIII以及低分子量蛋白质Marker购自TaKaRa公司。

扩增及克隆设计用于扩增hpaA的引物，并送交TaKaRa公司合成。

hpaA1：5‘GGATCCATGAAAGCAAATAATCATTTTAAAG3‘

hpaA2：5‘AAGCTTTTATGGGTTTCTTTTGCCTTTTAA3‘

利用以上引物和一管式PCR反应体系，从提取到的HpNCTC11639基因组中扩增hpaA。

扩增条件：盖温105℃，预热94℃10min，(94℃30s，50℃1min，70℃)×35，最后70℃再延伸6min。

扩增产物用PCR产物纯化试剂盒纯化后，连入T载体pGEMT，转入大肠杆菌Top10感受态细胞中，37℃在含有Xgal的平板上培养14h，利用Amp抗性和蓝白斑筛选出白色重组菌落，微量PCR鉴定，挑取阳性菌落，提取重组质粒，双酶切鉴定，保存阳性克隆菌种，提取的质粒送交TaKaRa进行测序。从重组pGEMT中用BamHI和HindIII，双酶切下hpaA，克隆入表达载体pGEX4T1中，转化入大肠杆菌BL21感受态细胞中，Amp抗性平板培养基上筛选阳性克隆，进行PCR及双酶切鉴定。重组大肠杆菌30℃下4h，150rpm，mMIPTG诱导表达，将产物进行SDSPAGE鉴定。

2结果与分析

PCR扩增hpaA扩增出的hpaA片段长度符合预测，将PCR产物分别连入pGEMT中获得重组T载体，经测序证明为hpaA基因。

同源性比较对测序结果分别与GeneBank上已公布的8株Hp的hpaA序列进行同源性比较，结果表明NCTC11639的hpaA基因同源性达到%～％。

hpaA的诱导表达从重组pGEMT克隆中切下hpaA，克隆入pGEX4T1中，转化大肠杆菌BL21，对阳性克隆进行双酶切和PCR鉴定，诱导表达，上清液经SDSPAGE鉴定(图3)。结果表明GSThpaA为可溶性表达，重组蛋白主要存在于上清液中。

3讨论

Hp与胃炎、消化性溃疡、胃腺癌及胃粘膜相关B细胞淋巴瘤等消化道疾病密切相关。目前Hp疫苗研究热点主要集中在尿素酶，毒力因子CagA和VacA，热休克蛋白60等亚单位保护性抗原上［4］。但Ure难以诱导出全面而稳定的保护性免疫应答［5］；CagA和VacA变异较大，且CagA是否为Hp感染所必需还存在一定争议［6］；Hsp60和人体自身蛋白有较高同源性，用Hsp60免疫小鼠只能获得局部保护性免疫应答，并且会导致小鼠肠胃炎［7］，其作为疫苗的安全性和有效性尚需进一步验证。因此，仍需进行研究以筛选出更合适的Hp候选疫苗。

NLBH是Hp的主要粘附素之一，它能与多种胃上皮细胞表面成分如神经节苷脂(GM3)、硫酸脑苷脂(SLC)及层粘连蛋白上的唾液酸乳糖等结合，使Hp紧密粘附于胃上皮细胞，从而进一步发挥对胃粘膜的损伤作用。所有Hp菌株均有hpaA基因，并且其核苷酸序列高度保守。Hp感染患者血清中出现的hpaA抗体能与hpaA融合蛋白发生免疫反应，因此hpaA作为Hp疫苗的候选抗原非常可行。

本研究克隆并表达了幽门螺杆菌NCTC11639的hpaA基因，与Genbank上已经公布的Hp菌株hpaA序列进行对比，同源性达到％～％，表明hpaA具有较高的保守性。目前已成功构建了可高效表达hpaA的原核表达系统，拟分离纯化重组蛋白，利用临床阳性血清进行鉴定。

【参考文献】

1KimN,WeeksDL,ShinJM,etal．ProteinsreleasedbyHelicobacterpyloriinvitro.JBacteriol,2002,184(22):61556162.

2EvansDG,KarjalainenTK,EvansDJJr,etal．Cloning，nucleotidesequence，andexpressionofageneencodinganadhesinsubunitproteinofHelicobacterpylori．JBacteriol,1993,175(3):674683.

3BaikSC,KimKM,SongSM,etal.Proteomicanalysisofthesarcosineinsolubleoutermembranefractionofhelicobacterpyloristrain26695.JBacteriol,2004,186(4):949955.

4CarlsohnE,NystromJ,BolinI,etal.HpaAisessentialforhelicobacterpyloricolonizationinmice.InfectImmun,2006,74(2):920926.

5李丙生，周曾芬．幽门螺旋杆菌疫苗的研究现状．胃肠病学和肝病学杂志，2004，13：203206．

6陈洪，刘晶