细菌耐药表型的检测方法

细菌耐药表型的检测方法

细菌耐药表型的检测一、β-内酰胺酶的检测（1）头孢硝基噻吩显色法（Nitrocefin）：制配纸片→灭菌水湿润→涂测试菌于纸片上，10min观察纸片颜色，显红色为阳性（葡萄球菌应放置1h内观察）。（2）酸度法：青霉素→β-内酰胺酶水解→青霉酸、pH6.8以下→酚红指示剂由红色（构橼酸钠缓冲液pH8.5）变为黄色。（3）碘测定法：β-内酰胺酶破坏β-内酰胺环，碘与破坏后的β-内酰胺结合，使兰色的淀粉—碘复合物转变成无色。（4）仪器测定法：Vitek、Microscan的药物测试卡中均带有检酶功能。二、ESBLS检测（1）纸片扩散初筛：头孢他啶（30μg/片）抑菌圈≤22mm头孢噻肟（30μg/片）抑菌圈≤27mm头孢曲松（30μg/片）抑菌圈≤25mm氨曲南（30μg/片）抑菌圈≤27mm（2）肉汤稀释法：上述药物MIC≥2μg/ml可疑为ESBLS。（表型确证试验：对2个任何一个药物MIC，在加克位维酸比不加克拉维酸的MIC值降低3个以上对倍稀释度判为ESBLS）。（3）双纸片协同确认试验：头孢他啶（30μg/片）与头孢他啶（30μg）/克位维酸（10μg）头孢噻肟（30μg/片）与头孢噻肟（30μg）/克拉维酸（10μg）两纸片抑菌圈相比≥5mm即为ESBLS。（4）E-test法（浓度梯度法）：由瑞典ABBiodisk公司研究生产，广洲贝肯公司经销。试条中的三代头孢菌素或氨曲南的MIC≥2μg/ml即可疑为ESBLS。（5）仪器测定法：Vitek,microscan和BD-PHOEMXTM微生物分析仪均可测试ESBLS。（6）利用分子生物学技术（PCR、DNA探针等）及分析酶底物谱及抑制物谱、生物化学技术等检测技术可对ESBLS做出确诊。三、Ampc酶检测1.初筛：（1）头孢西汀（30μg/片）与头孢西汀（30μg）/邻氯西林（200μg）。后者比前者的抑菌圈≥5mm即疑为Ampc。（2）5种纸片筛选：马斯平、泰能、头孢西汀、头孢他啶与头孢他啶/克拉维酸。如头孢西汀≤18mm，对马斯平、泰能敏感即疑为产Ampc，如头孢他啶与其酶抑制剂的抑菌圈≥5mm可能产ESBLS。2.确认试验（头孢西汀三维水相试验法）AmpC酶新的检测方法3.三维水相试验方法的改进（1）将标准菌株ATCC25922按常规药敏纸片K-B法操作均匀涂布于M-H平板上。（2）在M-H平板中心贴一片头孢西汀(30ug/片)纸片，在距纸片边缘1cm处，用无菌手术刀片切3cm长度的小槽，将待测菌株的6个菌落接种于槽内(勿溢出槽外)，35℃孵育18-24h。（3）结果观察：若抑菌圈向内凹陷，即AmpC酶阳性。※三维水相试验方法的改进(M-H平板打孔[2mm]扩散法).AmpC酶新的检测方法4.质粒型AmpC酶三联纸片方法的检测（1）将标准菌株ATCC25922按常规药敏纸片K-B法操作均匀涂布于M-H平板上。（2）在M-H平板中心贴一片头孢西汀(30ug/片)纸片，在纸片边缘贴有待测菌的纸片（纸片上含20ul，PH8.0，1MTris-0.1MEDTA）。（3）另一侧边缘贴有产AmpC酶菌的纸片（同上）。（4）35℃孵育18-24h，如待检菌出现扁平或凹陷的抑菌环为阳性。四、番金属展β-忘内酰社胺酶妈的表临型检地测方赚法1.洒头孢肯他啶严+2木-巯辣基丙匀酸法陶(C绞AZ裙+N哲CA会)（1绵）将笑待测呀菌株冤按常寺规药意敏纸滥片K款-B友法操波作均执匀涂岂布于营M-极H平逐板上反。（2察）在熄M-乎H平慈板上粒分别仓贴两胖片头陡孢他掏啶(阵30亦ug夕/片拢)纸势片，惩纸片荡中心坝相距车2.独5c泻m,井将其结中一弟片头害孢他蜡啶纸惯片上丧加3童ul仔2接-巯馆基丙测酸，艇35洒℃孵醉育1万8-丙24存h。（3采）结阔果观爽察：樱若加盐有2肾-巯症基乙优酸的缠头孢摄他啶尾纸片雹抑菌闻圈大叫于单貌个头蠢孢他诊啶的请抑菌堪圈（课≧4双mm抗），密则为菊阳性像，即欧产金模属β轮-内来酰胺押酶。金属对β-狮内酰砍胺酶赖的表际型检蜡测方轨法2.揭亚胺捆培南巨+E药DT丈A法脂(I粉MP皂+E牧DT巷A)（1注）将甩待测叼菌株佩按常犬规药萍敏纸良片K删-B竖法操匠作均委匀涂广布于尿M-常H平所板上笑。（2群）在糖M-找H平赏板上浅贴一团片亚完胺培女南(娇10趟ug因/片债)匙纸片光，在策距亚皆胺培取南纸勾片中繁心1慕.5母cm怕处贴发无菌屋空白昏纸片忆一片蔬，将渐0.五5M乌E罚DT右A等10泉ul碍均秩匀浸定注于黎空白酷纸片解上，钩35件℃孵妖育1泻8-封24图h。（3文）结膊果观蜜察：滋若两雷片纸哪片抑刑菌圈暖有协沸同作肢用，伙则为陡阳性斧，即陡产金荐属β翠-内摇酰胺萌酶。五、买肠杆色菌科叉碳青吧霉烯蠢霉筛纵选和尼确证旺（同20免09激年）1.轰如果摔菌株输对碳匆青霉脊烯类语药物同表现钞为“咱I”防或“泄R”唉没必讽要再替去检惠验该肌酶，婚（医舅生通残常不叉会选吵用“穴I”碧或“充R”卷的药私物）折，但笋主要铲以感惯染控败制为吊目的谊检验笑该酶准。2.纪什么炸是碳衣青霉趋烯酶监？一类凶能水望解或皂灭活网碳青障霉烯争类抗绞生素咱的酶备，如浩：K己PC未（肺言炎克醒雷伯脉菌碳矩青霉摄烯酶回）.碳青虫霉烯寺类抗死生素－D特or竭ip摔en僵em秧（目俯前无登CL敏SI穗折点扑）－厄肝他培绒南－亚屿胺培尚南－美闯洛培脚南3.羊肠杆化菌科粗碳青巧霉烯艘敏感嫩及碳鼻青霉坝烯酶序筛选摇的折桌点＊亚绕胺培童南不吴用于歉变形握/普轿罗威型登/筒摩根归菌属脏中碳码青霉溪烯酶输的筛及选。军因为贤这些差菌属吗会产生非滤碳青侵霉烯赛酶导步致的责亚胺窃培南贺MI刻C升虹高。＊＊虽NA贡：不倍可用斑（本映试验挡不适长用于蚂筛查会）4.耍什么缎时候凉做改遵良H惧od割ge左试验帅？如果提头孢晒噻肟雕、头榴孢他犬啶和白/押或头侨孢曲挺松全哲部“脂R”叛。注：男头孢澡比肟吴对于乎碳青伤霉烯伏酶产堪生株贝的结熄果是饥不稳狗定的带。MI编C（μg惊/m食l)工抑且菌圈疯(m德m)厄他祸培南蹲2珠1某9-令21亚胺脉培南办＊阴2-赵4唉NA企＊饭＊美洛赔培南钱2招-4排16跨-2采15.芝做改栏良的乏Ho壶dg昂e试泊验（脆确证带试验骡）（1衫）A理TC弦C2查59嫁22泼配成近0.绣5麦吗氏浊冷度，写1：疫10器稀释张。（2蒸）用嗽棉签塑满涂肥布于犁MH控平板蠢上，舍就像遣纸片镰扩散泽法药眨敏试太验一摄样，寻在中竭心加兄一张片厄他戚培南躁或美脂洛培见南（断最好杯）纸慕片。（3秆）取兵待测烘菌（竭1－届3号坑）从拥纸片歌边缘落向外猾划（许用1μl挨接种敬环）具。（4叛）3升5℃祖培养睡过夜悠后，捐观察谢结果威。（5嫁）大胜肠沿腿着菌床株划章线的例生长称表明拌碳青号霉烯奖水解炼酶的术产生谦。6.扑改良槽的H并od慢ge稼试验霸：检赶测碳肾青霉程烯酶仿活性僻的表侄型试汤验，埋在检丸测K储PC惕方面隐有>伙90唯％的糟敏感寄性/锈特异冻性，贵检测孙其他肠碳青鸽霉烯位酶时视敏感台性/酱特异鸡性不播定（薄如：朝低水成平的廊金属誉酶）运。7.害改症良H苏od免ge划试验蚂的质抚量控蚁制(说20照09毅年C舒LS惨I:负M1固00拢-S苗19践.A以PP危B.育12泉4)体：谅随患跨者菌给株每极天检跃测。（1葬）改励良H资od极ge斑试验献阳性桃菌株史:桥肺克斜AT标CC否B串AA育-1辽70议5（2恶）否改良桥Ho岛dg弊e试存验阴份性菌判株：省肺克卧AT捏CC提B资AA佳-1沸70蝴6六、节D-谈Te像st货试验（1加）将斜待检啊菌按告常规辅药敏壮纸片姜K-流B法薯操作坝均匀屯涂布冷于M彻-H吗平板础上。（2竿）在购M-偶H平姥上板汗贴一坦片红喉霉素劲(沿15凤ug辫/片错)婚纸片钓，在怪距纸炕片边趴缘1锻.5屈cm始处贴黄克林玻霉素肾(妈2u忧g/患片)取纸匹片。（3镰）3机5℃僵孵育哥18纺-2偶4h饱，如纽奉克林骄霉素泄出现藏扁平穴或凹苏陷的痒抑菌钩环为熟阳性覆。D-兼Te菜st瞒试验森耐药棉表型联判断耐药休机制拒红霉比素虚克低林霉策素池基因呆型――弦――困――辣――罩――阻――抚――怠――鸽――锁――选――哗―泵出匪(M吼S)罗R购S蔑MS漫RA核糖愚体基度因诱联导变兔异比(i不Ml灯s)嚷R才D与-T松es勇t(探+)庙（厉er饰mC既为主嚷）核糖冤体基舟因结授构变连异猛(c巡寿ML舒S)加R跌R楼（e末rm从A为急主）――伤――塔――镰――暴――烂――湖――众――垦――刚――脏―－职－七、蚀其它惯耐药捷表型祖检测1.嫩MR茶SA凝，M踪蝶RC熄NS2.础VR浆E3.苹PR惹P4.愉泵出忽机制诵：美餐平/蝇泰能钉（M冒IC怪）≥唱1附：晓鉴