生物工艺学胡庆森编安徽科技

生物工艺学胡庆森qshu@生命科学学院本课程的主要内容和考核方式菌种选育（第2章）微生物代谢调节（第3章）微生物培养基及灭菌（第4、5章）种子扩大培养（第6章）发酵工艺控制（第7章）平时成绩：20%（出勤率、课堂表现、课后习题）期末考试：80%（闭卷，平时上课讲解的重点内容）主要内容通过理解所学的知识，达到重点内容熟练掌握，具有初步分析和解决本专业问题的能力。绪论（第1章）第一章绪论第一节生物技术的概念与特点

IECDO给出的定义：应用自然科学和工程学的原理，依靠生物作用剂（biologicalagents）的作用将物料进行加工以提供产品或用以为社会服务的技术。特点：①一门多学科、综合性的科学技术②反应过程中需要生物催化剂的参与③最终目的是建立在工业生产过程或进行社会服务。(Moo-Young,1985)

生物学化学工程学生物技术1.2生物技术的发展历史（四个阶段）代表性的产品或技术:在石器时代后期，我国人民利用谷物酿酒，公元10世纪,我国就有了预防天花的活疫苗。公元前221年（周代后期），作豆腐、酱和醋，另外还有泡菜、奶酒、干酪等制作以及面团发酵、粪便和秸杆的沤制等。特点

知其然不知其所以然，有关实践没有上升到理论，更不能以理论来指导提高、实践。经验生物技术时期（从人类出现到19世纪中期）近代生物技术建立时期（19世纪50年代至20世纪40年代）这一时期的诞生与显微镜的发明、微生物的发现和微生物学的问世密切相关。1683年，荷兰人列文虎克(A.vanLeeuwenhoek)制作显微镜，人们认识到微生物的存在。

Leeuwenhoek在1683年寄给英国皇家协会信的部分内容。

A和B代表杆菌，C和D表示菌体运动的轨迹，E代表球菌

F代表长杆菌，G代表螺旋菌，H代表一簇球菌1863年“微生物学之父”法国人巴斯德（L.Pasteur）指出所有的发酵都是微生物作用的结果。（Pasteurization；利用减毒的病原菌制成疫苗）

1881年细菌学奠基人德国的科赫（R.Koch）首先用染色法观察细菌形态（固体培养皿表面划线培养获得单孢子菌落；发现结核菌）。1926年美国的萨姆纳（J.B.Summer）首次证实结晶脲酶是蛋白质划线分离获得单菌落青霉素抑菌实验1928年英国人弗莱明（A.Fleming）发现青霉素产品特点：以厌氧发酵居多，不少工业过程陆续出现产物多数属于微生物初级代谢产物，主要与细胞生长相关的产物及能量代谢相关的副产物。产品类型：有机溶剂乙醇、丙酮-丁酮-乙醇、丙酮-丁酮-异丙醇多元醇甘油有机酸乳酸、乙酸、丙酸、丙酮酸、柠檬酸、富马酸酶制剂淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、纤维素酶、凝乳酶疫苗卡介苗该阶段的特点：微生物学通过对微生物形态和生理的观察与研究建立的时期，为工业、农业、医学开始做出比以往更多的贡献，出现了不少新品种和新成就。早期以固态发酵生产

近代生物技术的全盛时期（20世纪40年代-20世纪70年代）

出现于20世纪40年代，是以青霉素的工业开发获得成功为标志。最初采用表面培养生产，以麸皮为培养基，发酵效价单位约为40u/mL，纯度20%，收率30%。1943年，美英科学家研究出5m3的机械通风发酵罐，采用深层培养法使发酵效价为200u/mL

，纯度60%，收率75%。机械搅拌和通气装置的发酵罐代替扁瓶或锥形瓶

不久其他抗生素如链霉素、新霉素相继问世。很快又发展了其他发酵产品，如维生素（19世纪40年代）、氨基酸（19世纪50年代）、酶制剂（19世纪60年代）

、核苷酸、多糖、有机酸。

本阶段形成两项技术：固定化酶（细胞）技术和生物转化技术。固定化技术应用实例生物转化技术在两步法生产Vc中应用

现代生物技术建立和发展时期（从20世纪70年代末开始）

以分子生物学理论为先导，基因工程的技术能作为生物技术新产品的一项开发手段和关键技术算起。

1974年美国人H.W.Boyer和S.N.Cohen在实验室内首次成功获得基因的克隆。

1944年美国微生物学家O.T.Avery证明了基因的化学本质是DNA。1953年美国J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA双螺旋模型。1958年F.H.C.Crick发现中心法则。1961-1965M.W.Nirenberg，R.W.Holley,H.G.Khorana完成常见氨基酸密码子的破译。

1982年美国Eli-Lilly药厂第一个基因工程产品胰岛素投入市场。1.目的基因的获取2.载体的选择3.目标基因与载体NDA的体外连接4.重组体DNA导入受体细胞5.重组细胞的筛选和鉴定基因工程的基本操作步骤基因工程产品发展概况目前，世界上已经批准上市的基因工程药物就有几十种，集中在多肽或蛋白质的生化药物中，如：胰岛素、人生长激素等。部分利用基因工程技术研制的产品人胰岛素

人生长激素(GH)

表皮生长因子(EGF)

肿瘤坏死因子

白细胞介素-2(IL-2)

尿激酶原

猪生长激素(PGH)

牛生长激素(BGH)纤维素酶

,-干扰素

乙型肝炎疫苗

集落刺激因子(CSF)

红细胞生成素(EPO)

抗血友病因子

组织溶纤原激活剂(t-PA)

这一时期出现了一项属于细胞工程的巨大成就-单克隆抗体技术。这一技术的基础是细胞融合，基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。

脾脏淋巴细胞骨髓瘤细胞繁殖快速产生目的抗体基因杂交瘤细胞繁殖快速+产生目的抗体基因动、植物细胞培养技术的应用：动物细胞生产单克隆抗体、糖蛋白干细胞的培养杂交技术在动、植物生产中应用：“三系杂交水稻”转基因动、植物的研究和开发：“金稻米”“克隆羊”、“克隆牛”、“克隆鼠”

生物技术发展现状与趋势第二章微生物代谢调节第一节微生物初级代谢调节代谢调控机制分为两种主要的类型：酶活的调节和酶合成的调节。快速相对缓慢酶活的调节酶合成的调节活化或钝化诱导或阻遏微调粗调本章以下内容围绕微生物细胞如何实现这两种调节方式展开论述蛋白质水平基因水平代谢调节的部位第一节酶活性调节1.定义：蛋白质分子中的一个或者多个氨基酸残基与一化学基团共价连接或者解开，使其活性改变的作用。2.化学基团：磷酸基、甲基、乙基、腺苷酰基。蛋白质的共价结合部位：一般为丝氨酸残基上的羟基（-CH2OH）。3.共价修饰的分类：可逆共价修饰、不可逆共价修饰。1、共价修饰酶活性调节可以归纳为以下几种方式：共价修饰、变构效应、缔合与解离、竞争性抑制。a、可逆共价修饰大多数共价调节是通过特定部位的丝氨酸、苏氨酸的侧链（-OH）的磷酸化和去磷酸化来调节的。磷酸化酶酶原：必须在一定条件下，去掉一个或者几个特殊的肽键，从而使酶的构象发生一定的变化才有活性。b、不可逆共价修饰如：胰蛋白酶原的活化

是通过肠肽酶在胰蛋白酶原N-端除去一个己肽。变构蛋白(变构酶)至少存在2个结合位点：活性位点+效应物结合位点当效应物与变构酶上的效应物结合位点结合后，酶蛋白的构象发生变化，引起催化中心改变，从而引起酶活性的变化（酶分子结合的效应物不同，产生不同的效应）。

2、变构控制（P64-65）变构效应是反馈抑制的理论基础，是代谢调节的有效方法。加正效应物加负效应物不加酶（有活性）酶（无活性）终产物终产物（调节物）结合在效应物结合位点变构酶活性调节示意图

3、缔合与解离能进行这种转变的蛋白质由多个亚基组成，蛋白质活化与钝化是通过组成它的亚基单位的缔合与解离实现的。这类互相转变钝化是由共价修饰或若干配基缔合启动的。4、竞争性抑制一些蛋白质的生物活性受代谢物的竞争性抑制。NAD+与NADH葡萄糖+ATP6-磷酸葡萄糖+ADP己糖激酶酶活调节方式小结共价修饰变构控制缔合与解离竞争性抑制酶活调节可逆共价修饰不可逆共价修饰（磷酸化酶）（胰蛋白酶原激活）（天冬氨酸转氨甲酰酶）反馈抑制

☞

一定数量的酶，通过其分子构象或分子结构的改变来调节其催化反应的速率,特点是反应快速。（ATPvs

ADP;NADHvsNAD）酶合成调节：主要指通过调节酶合成的量来控制微生物代谢速度的调节机制。这类调节是在基因水平（原核生物主要在转录水平上）上进行。第二节酶合成的调节酶合成调节的方式酶合成的诱导酶合成的阻遏分解代谢物阻遏终产物阻遏定义：培养基中某种基质与微生物接触而增加（诱导）细胞中其相应酶的合成速度。按照酶的合成与环境影响的关系来分，若酶的合成速度受基质浓度变化的影响很小，这种酶称为组成酶（如EMP途径中的酶），反之，称为诱导酶（如β-半乳糖苷酶）。1、诱导作用（induction）诱导物：是指能起诱导作用的化合物。诱导物常见的类型：基质、基质衍生物、产物

☺诱导作用可以保证能量和氨基酸不浪费，不把它们用于制造那些无用的酶；但是如有需要可迅速合成。安慰诱导物：酶基质的结构类似物，它们不能作为基质被酶代谢，却是出色的诱导物。异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside，ITPG）诱导作用的分子机制（P70）：

Jacob与Monod最先提出诱导作用模型，也叫操纵子模型。

RPOSS调节基因启动基因操纵基因结构基因操纵子是一组功能上相关的基因，由启动基因（Promoter）、操纵基因（Operater）、结构基因（Structuralgene）三部分构成。

P-RNA聚合酶结合位点；O-调节RNA聚合酶启动或停止转录的调控位点，该基因不能转录和翻译；S-负责编码有关酶蛋白的氨基酸序列；R-调控O，能编码一种蛋白质（阻遏蛋白或阻遏物），该蛋白质专一性强，只能与特定操纵基因结合。乳糖操纵子调控示意图阻遏蛋白具有活性（负调节）（a）无乳糖时（b）有乳糖时2、分解代谢物阻遏（P65-66）定义：培养基中某种基质的存在会减少（阻遏）细胞中其相应酶的合成速率，这种现象称为分解代谢物阻遏。现象：若微生物的培养基中存在一种以上可利用的养分，通常它们会先分解那些最易利用的基质，只有该基质耗竭后才开始分解第二种基质(如大肠杆菌在葡萄糖和乳糖上混合碳源中生长)。葡萄糖效应：葡萄糖降解产物对其他分解代谢操纵子的阻遏作用称为分解代谢物阻遏（降解物阻遏）。☞实质：容易利用的底物在分解过程中产生的中间代谢物或末端代谢物过量积累，阻碍了代谢中某些酶的合成。蛋白质（mg/mL）鸟氨酸氨甲酰基转移酶（U/mL）鸟氨酸氨甲酰基转移酶的分解代谢物阻遏①3’-5’环腺苷单磷酸（cAMP）;

②微生物细胞内存在一种蛋白质，称为受体蛋白（CRP）又称为降解物基因活化蛋白（CAP）;③RNA聚合酶和模板NDA的结合以及mRNA合成的开始，都需要有cAMP和CRP同时存在。分解代谢物阻遏作用的分子机制（P70）：

☞分解代谢物阻遏是由于cAMP的不足造成的，这是因为支持低生长速率的碳源比迅速利用的碳源造成细胞内更高的cAMP☆大肠杆菌利用葡萄糖造成细胞内cAMP含量过低，cAMP无法与受体蛋白CAP结合成复合物，导致RNA聚合酶无法结合到操纵基因位点，分解乳糖的相关酶基因不能正常进行转录和翻译，因此当葡萄糖存在时，菌株表现为不能利用乳糖。酶合成调节的方式酶合成的诱导(β-半乳糖苷酶)酶合成的阻遏分解代谢物阻遏(二次生长)终产物阻遏（随后讲解）酶合成调节小结反馈调节反馈调节反馈抑制（酶活调节）反馈阻遏（酶合成调节）分解代谢物阻遏终产物阻遏★反馈抑制：指代谢途径的终产物对催化该途径的一个反应（通常是第一个反应）的酶活力的抑制。其实质是终产物结合到酶的效应物结合位点（变构部位），从而影响酶与底物的结合，当然与此相反的有酶活性的激活。☆反馈阻遏：指终产物（或终产物的结构类似物）阻扰催化该途径的一个（或几个）反应中的一个（或几个）酶的合成。其实质是调节基因的作用，这是微生物不通过基因突变而适应于环境改变的一种措施，当然与此相反的有酶合成的诱导。反馈抑制和反馈阻遏的比较终产物阻遏现象：微生物合成代谢过程中某些化合物（如氨基酸、核苷酸）不能无限量生成。终产物阻遏调节机制：阻遏蛋白对转录起始的阻遏作用色氨酸操纵子调节模型(P70)阻遏蛋白无活性☺（a）低浓度色氨酸（b）高浓度色氨酸色氨酸衰减器模型(P71)即使形成转录mRNA,微生物仍可以通过衰减器模型在mRNA水平上控制此mRNA的转录衰减子：结构基因之前，位于前导区内，能使转录终止的DNA序列。

衰减子前导肽核蛋白体衰减子结构RNA聚合酶5'mRNA10、11位Trp密码子1234UUUU3'DNADNA前导肽5'1234Trp结构基因MKAIFVLKGMKAIFVLKGWWRTSRNA聚合酶

Trp操纵子的转录衰减机制（a）高浓度Trp（b）低浓度Trp决定转录终止的主要因素酶活性调节的其他方式：共价修饰、变构效应、缔合与解离、竞争性抑制微生物调节机制小结反馈调节1.直线式代谢途径中的反馈调节：

2.分支代谢途径中的反馈调节：

在分支代谢途径中，反馈抑制的情况较为复杂，为了避免在一个分支上的产物过多时不致同时影响另一分支上产物的供应，微生物发展出多种调节方式。

主要有：同功酶调节，顺序反馈调节，协同反馈调节，积累反馈调节等。终产物作为调节因子通过反馈抑制限速酶或作为辅助阻遏物阻遏限速酶的合成同功酶反馈调节同功酶：同功酶是几种在一个细胞中催化同一反应的酶。该模式中分支末端的产物可分别专一性地对同工酶中的某一个发生反馈作用。P66图3-6ABC

E2E1E3E4反馈调节反馈调节DEYFGZ特点：途径中的第一个反应（A至B）被两个不同的酶（E1，E2）所催化，一个酶被Y反馈调节，另一个酶被Z反馈调节。只有当Y和Z同时过量才能完全阻止A转变为B。

特点：末端产物Y和Z单独过量，对途径中第一个酶E1无反馈调节作用或产生很小的影响，只有Y和Z同时过量，才能对E1具有反馈调节作用。ABC

E1D

E

YFGZE3E2反馈调节协同反馈调节顺序反馈调节P66图3-6特点：两个末端产物(Y,Z)，不能直接反馈调节途径中的第一个酶Ea，而是分别反馈调节分支点后的Eb和Ec，造成中间产物C的积累，高浓度的C再反馈调节Ea。DEYFGZ

Eb

Ec抑制抑制抑制ABCEa特点：末端产物Y和Z单独过量时，各自对途径中第一个酶E1仅产生较小的抑制（或阻遏）作用，一种末端产物过量（Y或Z）并不影响其他末端产物的形成。只有当Y和Z同时过量，才能对E1产生较大的抑制（或阻遏）作用。P66图3-6ABCE1DEYFGZ40%30%58%细菌调节机制的多样性芳香族氨基酸合成途径中的反馈抑制和阻遏（P66图3-7）EA莽草酸激酶EB分支酸变位酶第二节微生物次级代谢的调节1、微生物次级代谢相关的概念

☞初级代谢：微生物提供能量、合成中间体及其关键大分子（如蛋白质与核苷酸互相关联的代谢）

☞次级代谢：主要涉及合成过程，其终产物、次级代谢产物对菌的生长不是必须，但对其生命活动可能具有某种意义，通常是在生长后期开始形成。

☞次级代谢产物：抗生素、色素、生物碱、毒素等。次级代谢产物的代谢调节在生产和理论上又有一定的应用价值和研究意义。2、微生物次级代谢的特征①种类繁多，结构特殊，含有不常见的化合物；如：抗生素、毒素、色素和生物碱等，如氨基糖、苯醌、香豆素、麦角生物碱、萜烯、四环类抗生素等；②含有少见的化学键；如：吩嗪、吡咯、喹啉、聚乙烯和多烯的不饱和键等；③一种微生物所含有的次级代谢产物往往是一组结构相似的化合物（青霉素G,V,F,U,N）④一种微生物的不同菌株可以产生分子结构迥异的次级代谢物(如灰色链霉菌可以产生7种抗生素)；不同种类的微生物也能产生同一种次级代谢物（至少有5类真菌能产生青霉素）；⑤次级代谢产物的合成比生长对环境因素更敏感。如菌体生长，磷酸盐浓度0.3～300mmol/L；产物合成，磷酸盐浓度0.1～10mmol/L，⑥一簇抗生素中各组分的多少取决于遗传因素和环境因素;

♂初级代谢的特异性很高，而次级代谢合成所涉及的酶的特异性较低。

♀次级代谢的差错对细胞的生长无关紧要，而初级代谢的差错却会引起致命后果。⑦次级代谢产物的合成过程是一类由多基因（基因簇）控制的代谢过程；这些基因不仅位于微生物的染色体中，也位于质粒中，且后者的基因在次级代谢产物的合成过程中往往起主导作用。3、次级代谢产物的生物合成步骤①养分的摄入；②通过中枢代谢途径（初级代谢）养分转化为中间体；③小分子建筑单位（前体，进入次级代谢）的形成；④如有必要，改变其中一些中间体⑤前体进入次级代谢生物合成的专有途径；⑥在次级代谢的主要骨架形成后作最后的修饰，成为产物。中间体：对初级代谢而言；前体：对次级代谢而言；★有时二者是同一物质，有时前体在中间体的基础上结构略有改变。☞前体：加入到发酵培养基中的某些化合物，能被微生物直接结合到产物分子中去，而自身的结构无多大变化，且具有促进产物合成的作用。☞中间体：养分或基质进入一途径后被转化为一种或多种不同的物质，它们均被进一步代谢，最终获得该途径的终产物。★两者的区别在于：前者的结构往往要略需变化后才能进入代谢途径，有时候两者是同一种物质。前体与诱导物区别：一般把那些能在生长期内生产期前促进抗生素合成的化合物看做诱导物；而前体仅仅在生产期起作用。四、由初级代谢物衍生次级代谢物的途径①糖类：葡萄糖碳架掺入途径-差向异构化、氨化、去羟基、重排、脱羧、氧化和还原②莽草酸、芳香氨基酸莽草酸途径（芳香中间体）：莽草酸，对氨基苯甲酸，色氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸。③非芳香氨基酸（丙酮酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸）④C1化合物⑤脂肪酸（乙酸、丙酸）⑥TCA循环的中间体⑦嘌呤和嘧啶（与核苷有关的途径）次级代谢产物多数来源于以下几种关键的触及代谢产物，他们是初级代谢的中间体，可以作为次级代谢的前体。按Betina分类法五、微生物次级代谢的调节本小节主要以抗生素的生物合成阐述次级代谢的调节机理，其中多数概念也适用于非抗生素的次级代谢产物，如色素、毒素等。青霉素G苯乙酸1.酶的诱导调节在次级代谢过程中，有些参与次级代谢产物合成的酶为诱导酶，如链霉素生物合成中的转脒基酶、甘露糖链霉素酶等。诱导酶需要有诱导物存在才能形成。诱导物起诱导作用，能提高次级代谢产物的产量。例如，蛋氨酸能提高头孢菌素C的产量，其原因是蛋氨酸的诱导作用，而不是作为硫源的供给物。次级代谢的一个特征是次级代谢物通常是在生长阶段（营养期）之后的生产阶段（分化期）合成。产物的形成是在某些营养成分从培养基中耗竭时开始的。易利用的糖、氨或磷酸盐的消失使次级代谢物阻遏作用的解除。色氨酸诱导生物碱合成酶提高生物碱产量α－酮戊二酸＋乙酰CoA高柠檬酸顺—高乌头酸高异柠檬酸α－酮已二酸α－酮已二酸α-氨基已二酸（α-

AAA）赖氨酸L-α-

AAA

-半胱氨酸L-α-

AAA-半胱氨酸-D-缬氨酸青霉素G高柠檬酸合成酶反馈抑制2、反馈调节3、分解代谢物调节20世纪40年代初期就发现，青霉素发酵过程中，虽然葡萄糖被菌体利用最快，但对青霉素合成并不适宜。而乳糖利用虽然较为缓慢，却能提高青霉素产量。使用寡糖、多糖等缓慢利用的碳源，葡萄糖与麦芽糖、葡萄糖与蔗糖、葡萄糖与淀粉混合碳源的利用或者采用流加葡萄糖的策略，也都能减少碳分解阻遏的发生。4、磷酸盐调节磷酸盐不仅是菌体生长的主要限制性营养成分，还是调节次级代谢产物生物合成的重要因素。过量的磷酸盐也象葡萄糖一样抑制次级代谢产物的合成，这种抑制作用被称为磷酸盐调节。①过量磷酸盐对四环素类、氨基糖苷类、多烯类和大环内酯类等32种抗生素的生物合成产生阻抑作用。这些次级代谢产物的生物合成只有在适当的磷酸盐浓度下才能进行。磷酸盐浓度≥10mmol/L往往对次级代谢产物的合成有抑制作用。②磷酸盐浓度的高低还能调节次级代谢产物合成期出现的早晚，当磷酸盐接近耗尽时，才开始进入次级代谢产物的合成期。磷酸盐起始浓度高，耗尽时间长，合成期就向后拖延。如金霉素、万古霉素等的发酵都有这些现象。5、能荷调节Atkinson把能荷定义为：细胞内总的腺苷酸系统（即ATP,ADP,AMP之和）所负载的高能磷酸键数量，并规定细胞内最高能荷为1.微生物初级代谢和次级代谢均存在能荷调节。能荷=[ATP]+0.5[ADP][ATP]+[ADP]+[AMP]ATP直接影响次级代谢产物合成和糖代谢中某些酶的活性。在四环素的生物合成中，ATP水平对四环素合成起调节作用。磷酸烯醇式丙酮酸在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶作用下生成草酰乙酸，再经羧基转移酶作用生成丙二酰CoA（四环素合成的前体），此途径在四环素合成期起决定作用。而草酰乙酸是三羧酸（TCA）循环中的重要中间产物，催化其形成的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的合成受ATP和过量磷酸盐的强烈抑制，从而降低了草酰乙酸的生成，最终降低了四环素生物合成前体丙二酰CoA的浓度，影响四环素的生物合成。第三章菌种选育第一节菌种的来源一、生物物质产生菌的筛选1、微生物-生物产物的来源

要获得所需生物特性的新产物关键是：微生物的选择+采用什么样的筛选方案2、待筛选样品的性质

次级代谢产物主要以液体培养法为筛选手段3、筛选方案的设计三种不同的筛选方法：整体细胞、完整细胞、亚细胞制剂选择性分离方法大概分为五个步骤①含微生物材料的选择（来源越广泛的天然材料，含有目标微生物的可能性越大，表2-1）；②材料的预处理（加热、过滤、离心等减少干扰因素，提高分离效果；表2-2）；③所需菌种的分离（分离效果取决于分离培养基的养分、pH、加入的抑制剂；表2-3）；④菌种的培养（放线菌在分离平板上不同温度和培养时间进行培养）；⑤菌种的选择和纯化（铺菌法和复印平板法）二、微生物选择性分离的原理与发展以筛选产生抗生素的放线菌为例，介绍分离方法原理的发展第二节重要工业微生物的分离一、筛选潜在工业应用价值的微生物时，宜考虑的重要指标：①菌株的营养条件(来源广泛且廉价的培养基)②菌的生长温度应选择高于30oC(降低冷却成本)③菌对所采用的设备与生产过程的适应性（易于工业化推广）④菌的产物得率和产物在培养基中的浓度（经济效益的可行性）⑤易于从培养液中回收产物（下游提取精制的成本）投入生产前必须对其产物的毒性和菌种的性能做出评价。分离到一株优良的菌株对随后的工业化生产具有巨大的影响。二、施加选择压力的分离方法

（1）富集液体培养原理：对混合菌群采用“投其所好”“取其所抗”的策略进行筛选。在所需菌种占优势的情况下进行移种。a.分批富集法利用连续培养，通过改变限制性基质的浓度来控制两种菌的比生长速率b.连续富集法连续富集法筛选到的菌株特别适合连续培养有利于筛选到具有某种工业生产特性的菌株（耐高温、培养基简单的菌株）筛选能共生的稳定混合培养物(2)固体培养基的使用分离某些酶的产生菌时，选择培养基中加入某种酶需要的基质（3）随机分离方法有些微生物的产物对产生菌的筛选没有任何选择性优势，常采用随机的分离所需菌种。a.抗生素产生菌的筛选

如加入亚胺环己酮b.生长因子产生菌的筛选：利用被分离的微生物产物能否促进营养缺陷型实验菌生长。c.多糖产生菌的筛选:可从菌落的粘稠外观识别这类产生菌。经过自然界分离、筛选获得的具有价值的菌株，在应用于工业化生产之前必须经过人工选育已得到具有一定生产能力的菌株。第三节菌种选育菌种选育的原因：发酵工业的发展除了发酵工艺和设备的改进外，起决定作用是优良菌株的获得。菌种选育的方法1、经典育种：自然选育和诱变育种2、定向育种：转化、转导、接合、原生质体融合、代谢调控、基因工程特点：菌株筛选带有一定盲目性特点：克服了盲目性，有理性的去筛选目的菌株一、自然选育1、定义：在生产过程中，不经过人工处理，利用菌株的自然突变而进行的菌株筛选的过程。微生物碱基对自然突变的概率约为10-8-10-9，概率非常小。2、自然选育的一般流程制备单孢子（细胞）悬浮液适当稀释固体平板上分离菌株测定其生产能力选择生产能力强的菌株优点：

①自然选育操作简单易行，

②可以纯化菌种、防止菌种衰退、稳定产量缺点:

①效率低、进展慢、

②很难大幅度提高产量

☞自发突变的频率较低，因此自然选育筛选出来的菌种，不能满足育种工作的需要。因而不能仅停留在“选”种，还要进行“育”种。反复的筛选获得优良菌株二、诱变育种(1)诱变育种的原理点突变碱基置换移码突变（几个核苷酸发生插入或缺失）（一对碱基发生突变）染色体畸变缺失、重复、插入、易位、倒位（DNA分子大损伤）基因突变★诱变育种提高了菌株发生突变的频率和变异幅度！（2）常用的诱变剂及其种类出发菌株的选择工业上用来进行诱变处理的菌株，称为出发菌株。菌悬液的制备诱变4.测定菌体存活率变异菌株的分离和筛选（3）诱变选育的一般步骤(4)诱变育种中几个需要注意的问题a.选择好的出发菌株挑选出发菌株的标准是产量高、对诱变剂的敏感性大，变异幅度广。b.复合诱变剂的使用

☞物理诱变与化学诱变相结合，提高诱变效果（如乙烯亚胺+紫外线）。

c.诱变剂剂量的选择☞能增加变异幅度，又能促使变异向正变范围移动的剂量(多次实验的摸索来确)。d.变异菌株的筛选

☞尽量找出那些与产量相关的特性作为筛选的标准。

e.高产菌株的获得需要筛选条件的配合（5）物理与化学诱变剂的使用方法（紫外线和亚硝基胍诱变）紫外线诱变：特点：危险性小，对野生菌株诱变效果好，应用最为广泛机制：形成胸腺嘧啶二聚体改变DNA生物活性操作要点：260nm波长照射菌悬液或孢子悬浮液，紫外灯功率15W,距离固定在15cm左右。亚硝基胍（NTG）诱变：特点：可诱发营养缺陷型突变，有超诱变剂的称号。较难溶解于缓冲液（甲酰胺溶解）操作要点：通常浓度300μg/mL，28oC,时间60min三、抗噬菌体菌株的选育a.抗噬菌体菌体菌株选育方法：自然突变法（不经人工诱变，以噬菌体为筛子）诱变突变法噬菌斑细菌凡是有寄主细胞的地方，一般容易存在他们的噬菌体。诱变突变法基本步骤：先将敏感菌株诱变处理，将处理后的孢子液分离在含有高浓度噬菌体的平板上。根据抗性变异菌株能在此平板上生长，而将其挑选出来。b.抗噬菌体菌株的特性实验通过上述两种方法得到的抗噬菌体菌株，生产之前需要反复验证，才能使用。①抗噬菌体形状的稳定性试验②抗性菌株的产量试验不但要具有抗性，还要求生产能力不低于原菌株。

Ⅰ.抗噬菌体菌株多次传代后抗性是否稳定。

Ⅱ.待测菌株分别在孢子（种子或发酵）培养过程中采用双层琼脂法检测噬菌斑。③真正抗性与溶源性的区别实验☺真正抗性还是溶源性造成菌体对噬菌体具有抗性？用物理化学方法诱导敏感菌看能否形成噬菌斑。c.噬菌体的防治

以预防为主，同时采取筛选抗性菌株与保持环境卫生、杜绝噬菌体滋生，两者结合才是有效的防治措施。①正确判断(根据发酵异常进行客观联系判断)②普及有关噬菌体的知识(及时发现噬菌体)③选育抗噬菌体菌株④消灭噬菌体排气口、下水道、车间中噬菌体的防治（漂白粉、甲醛、石灰水）；定时检测噬菌体分布⑤收集与保存噬菌体为选育抗性菌株与研究防治提供素材四、杂交育种杂交育种：两个不同基因型的菌株通过吻合（或结合）使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选出具有新性状的菌株。微生物杂交所使用的配对菌株称为直接亲本，它们必须带有适当的遗传标记，如颜色、营养要求、抗药性等。营养标记（营养缺陷型菌株）是最常用的遗传标记之一。如细菌的杂交

A-B+Lac-SMrT1s(m)基本培养基上不生长A+B-Lac+SMsT1r(n)基本培养基上不生长A-B+Lac-SMrT1s+

A+B-Lac+SMsT1r基本培养基长出少量菌落细胞的接触是发生基因重组的必要条件。五、原生质体融合融合技术（1）原生质体融合

就是把两个亲本的细胞壁分别通过酶解作用加以瓦解，使茵体细胞在高渗环境中释放出只有原生质膜包裹着的球状体(称原生质体)。两亲本的原生质体在高渗条件下使之混合，由聚乙二醇(PEG)作为助融剂，使它们互相凝集，发生细胞融合，接着两亲本基因组由接触到交换，从而实现遗传重组。在再生成细胞的菌落中就有可能获得具有理想性状的重组子。仍属于半理性筛选(2)原生质体融合的一般步骤与特点六、DNA重组技术

指按人的意志，将某一微生物（A）的遗传物质在体外经人工与载体连接，构成重组DNA分子，然后转入另一个生物(B)体细胞中，使被引入的外源DNA片段在后者(B)内部得以表达和遗传。1、分子育种改良菌株主要的研究内容：

①增加生物合成基因量②导入强启动子和抗性基因而增加产量③把两个不同的生物合成基因在体外重组再导入受体内，产生杂交抗生素④激活沉默基因，生产新的生物活性物质⑤异源基因导入宿主中表达，彻底改变生产工艺2、3、工程菌稳定性问题

（1）工程菌不稳定性具体表现为下列三种形式：

①

②

③表达产物不稳定

如人干扰素活性随发酵时间而下降工程菌稳定性能否解决，成为基因工程技术转变为生产力的关键之一。（pBR322+pUB110）（pBR322）4、影响工程菌不稳定的因素①重组质粒的稳定区受到影响，此外重组质粒含有重复序列或与宿主染色体有部分同源。②宿主的比生长速率、宿主中重组基因的完整性。

③某些培养环境（高温、SDS,某些药物、胸腺嘧啶饥饿、紫外线辐射）都会引起质粒丢失5、降低工程菌不稳定的措施①组建合适的载体构建质粒时，插入一段特殊的DNA片段或基因②选择合适的宿主大肠杆菌相对比较稳定③施加选择压力（发酵过程中施加选择压力）抗生素添加法、抗生素依赖变异法、营养缺陷性型法、控制基因过量表达、控制培养条件、质粒上不需要的DNA部分删除、质粒不含转移因子、固定化重组菌七、菌种保藏一个优良的菌种被选育出来以后，要保持其生产性能的稳定、不污染杂菌、不死亡，这就需要对菌株进行保藏。尽量减少传代次数，防止菌种衰退。(1)原理：菌种保藏主要是根据菌种的生理、生化特性，人工创造条件使菌体的代谢活动处于休眠状态。

低温、干燥、隔绝空气或氧气、缺乏营养物质等，使菌体的代谢活性处于最低状态，同时也应考虑到经济、简便方法。

①斜面冰箱保藏法短期过渡的保藏方法（3-6个月）②砂土管保藏法产孢子或芽孢的微生物（1年）③菌丝速冻法50%的甘油与菌悬液混合-20℃保存④石蜡油封存法不能利用石蜡油（1年左右）⑤真空冷冻干燥保藏法各种微生物（5年）

⑥液氮超低温保藏法特别适合不产孢子的菌丝体（保存期长）(2)常用的菌种保藏方法第三章：微生物培养基

培养基：广义上讲培养基是指一切可供微生物细胞生长繁殖所需的一组营养物质和原料。同时培养基也为微生物培养提供除营养外的其它所必须的条件。发酵培养基的作用：

满足菌体的生长促进产物的形成微生物的营养活动，是依靠向外界分泌大量的酶，将周围环境中大分子的蛋白质、糖类、脂肪等营养物质分解成小分子化合物，再借助于细胞膜的渗透作用，吸收这些小分子营养来实现的。

第一节培养基的类型及功能培养基按其组成物质的纯度、状态、用途可分为三大类型一、按纯度合成培养基

:原料其化学成分明确、稳定适合于研究菌种基本代谢和过程的物质变化规律培养基营养单一，价格较高，不适合用于大规模工业生产

天然培养基（复合培养基）:采用天然原料原料来源丰富(大多为农副产品)、价格低廉、适于工业化生产原料质量等方面不加控制会影响生产稳定性

二、按状态固体培养基

:适合于菌种和孢子的培养和保存，也广泛应用于有子实体的真菌类，如香菇、白木耳等的生产

半固体培养基:即在配好的液体培养基中加入少量的琼脂，（0.5%～0.8%）,主要用于微生物的鉴定。液体培养基:80%～90%是水，其中配有可溶性的或不溶性的营养成分，是发酵工业大规模使用的培养基。

孢子培养基：

供菌体繁殖孢子的一种常用固体培养基（麸皮、大（小）米培养基）要求：能使菌体迅速生长，产生较多的优质孢子，且不易引起菌种发生变异注意事项：①营养不要太丰富，否则不产孢子②无机盐浓度要适量③控制培养基的pH和湿度三、按用途（从发酵生产应用考虑）

培养基按其用途可分为孢子培养基、种子培养基和发酵培养基三种

种子培养基：供孢子发芽生长和大量繁殖菌丝体，并使长得粗壮，成为活力强的“种子”。

要求：营养比较完全和丰富，注意事项：①氮源等总浓度略稀薄为好②常同时使用有机氮源和无机氮源③最后一级的种子培养基成分最好接近发酵培养基发酵培养基：

供菌体生长繁殖和合成产物之用。要求：除含有生长必须的元素之外，还要含有合成产物所必需的特定元素、前体和促进剂。第二节发酵培养基的成分及来源

一、碳源1、作用提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需的碳成分；提供合成目的产物所需的碳成分。2、来源糖类、有机酸、正烷烃、油脂3、工业上常用的糖类①葡萄糖几乎所有的微生物都能利用葡萄糖

但是一次投入过量的葡萄糖容易抑制菌体生长和产物的合成。②糖蜜糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物。

糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达50%～75%。一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜葡萄糖蜜。糖蜜来源和加工方法均影响其成分。③淀粉、糊精使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类（否则必须预处理）。缺点：☞难利用、

☞发酵液比较稠、一般浓度高于2.0%时需加入一定的α-淀粉酶优点：☞来源广泛、价格低廉

☞可以解除葡萄糖代谢过快带来的负面效应4、油和脂肪

该类化合物有比较活跃的脂肪酶，脂肪酶水解油或脂肪产生甘油和脂肪酸，进一步被氧化。5、有机酸乳酸、柠檬酸、乙酸6、烃类和醇类

①正烷烃（石油裂解得到的C14-C18直链烷烃混合物）已用于有机酸、氨基酸、维生素、抗生素、酶制剂的发酵工业中。

②“乙醇代粮发酵”生产单细胞蛋白二、氮源

氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。1、无机氮源种类：氨盐、硝酸盐和氨水特点：微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅速利用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变化如：

(NH4)2SO4

→2NH3+2H2SO4

NaNO3+4H2→NH3+2H2O+NaOH

生理酸性物质与生理碱性物质无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源称为生理酸性物质，如硫酸铵。若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠。所以，选择合适的无机氮源有两层意义：

满足菌体生长

稳定和调节发酵过程中的pH2、有机氮源来源：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、

尿素、废菌丝体和酒糟成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子。例玉米浆：①含有多种氨基酸、生长因子（生物素）、苯乙酸②较多的乳酸③硫、磷、微量元素等有机氮源选取时和使用过程中，必须考虑原料的波动对发酵的影响三、无机盐和微量元素1、作用：各种不一样2、来源：C、N源，以盐的形式补充3、用量：根据具体的产品，由实验决定其用量五、水

对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的，因为在不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大。

水源质量的主要考虑参数包括pH值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。

对于酿造行业，水的重要性不言而喻五、生长因子、前体和产物促进剂

发酵培养基中加入某些成分有助于调节产物的形成，这些添加的物质包括：生长因子、前体和产物促进剂。（1）生长因子

从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。

如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型，以生物素为生长因子。来源：有机氮源含有丰富维生素B族元素和微量元素和一些微生物生长必不可少的生长因子。玉米浆的发现

前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。（2）前体青霉素苯乙酸前体的特点：①前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利

②菌体具有将前体分解的能力用法：前体使用时普遍采用流加的方法（减小毒性和增加利用率）（3）抑制剂和产物促进剂

所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。

Tween（一种表面活性剂）是多种酶的促进剂。促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方面的。有些促进剂本身是酶的诱导物；有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用；有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。第三节发酵培养基的设计和优化1、培养基成分选择的原则

菌种的同化能力

代谢的阻遏和诱导

合适的C、N比

pH的要求

微生物必须具备分解培养基的相关酶系，否则不能直接使用该培养基。如果要使用该培养基，必须对其进行一些列处理。酵母一般仅能利用C1-C3糖，最多C4糖国内制曲酿酒工艺淀粉淀粉酶+糖化酶糖国外麦芽制酒工艺麦芽淀粉水解酶麦芽糖工业上将淀粉水解为葡萄糖的过程称为淀粉的糖化，所得到的糖液称为淀粉水解糖。葡萄糖值，简称DE值（Dextroseequivalentvalue），表示淀粉水解程度的术语。其定义为：还原糖总量（按葡萄糖计）占试样中干物质质量的分数。DE值越高，说明还原糖越多，淀粉水解越彻底。

菌种的同化能力不同的制糖工艺生产的糖液质量差别很大

代谢的阻遏和诱导

抗生素生产中种子培养基中被快速利用的碳氮源含量比发酵培养基要多酶制剂行业多数采用微生物利用缓慢的碳源（如淀粉、糊精等）代替微生物容易利用的碳源（如葡萄糖、果糖），避免分解代谢物阻遏的影响。有些产物如蛋白酶，通常受到培养基中蛋白质或多肽的诱导，而受到铵盐、硝酸盐、氨基酸的阻遏，这时在培养基中应考虑有机氮源为主。

同一微生物处于不同生长阶段，对氮源利用情况不同。初期铵盐和氨基氮，中期有机氮无机氮混合使用。

合适的C、N比一般工业发酵培养基的碳氮比为100:(0.2～2.0)N源过多菌体生长过于旺盛；pH

偏高；不利于产物形成N源过少菌体量不足；影响产量碳源过多容易造成pH偏低碳源不足容易引起菌体衰老和自溶

pH的要求除考虑培养基的营养外，也要考虑代谢后对培养体系pH的贡献补加酸碱调节发酵液的pH谷氨酸发酵中C:N=100:15~21，若碳氮比为100:0.2~2.0，则会出现只长菌体，而不产谷氨酸的现象。③当培养基成分确定后，剩下的问题就是各成分最适的浓度，由于培养基成分很多，为减少实验次数常采用一些合理的实验设计方法。

2、培养基设计的步骤①根据前人的经验和培养基成分确定时一些必须考虑的问题，初步确定可能的培养基成分；②通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分；（1）理论转化率与实际转化率

理论转化率是指理想状态下根据微生物的代谢途径进行物料衡算，所得出的转化率的大小。

实际转化率是指实际发酵过程中转化率的大小

如何使实际转化率接近于理论转化率是发酵控制的一个目标。3、成分含量的确定

在青霉素分批发酵的一个简单模型中，用于合成细胞、维持生命活力和转化成青霉素的葡萄糖，分别占总糖耗量的28％、61％和11％。Cooney(1979)以青霉素生物合成的途径为基础，通过物质和能量平衡，计算出青霉素生物合成的理论值。总的化学计算式为