本科毕业论文-三七集团选择后代群体的鉴定与评估评价

PAGE分类号：密级：UDC：编号：硕士学位论文三七集团选择后代群体的鉴定与评价IdentificationandEvaluationonthreepopulationsofPanaxnotoginsengbymassselection 独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得云南农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：年月日关于学位论文使用授权的声明本人完全了解云南农业大学有关保存、使用学位论文的管理办法及规定，即：云南农业大学有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意云南农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名： 时间：年月日导师签名： 时间：年月日课题来源西南地区中药材规范化种植及大宗中药材综合利用开发技术研究项目下课题三七规范化种植基地优化升级及系列产品综合开发研究（2011BAI13B01）。三七集团选择后代群体的鉴定与评价PAGEvi目录摘要 iiiAbstract v1前言 11.1三七概况 11.1.1三七植物形态特征及生境分布 11.1.2三七表型变异类型研究 11.1.3三七分子生物学特性研究 21.1.4三七化学成分研究进展 21.1.5三七药理学研究进展 21.2集团选择 21.3DUS测试 31.4分子标记及其应用 41.5本研究的目的意义 61.6技术路线 72材料与方法 82.1试验材料 82.1.1供试材料 82.1.2主要仪器 82.1.3主要试剂 82.2试验方法 92.2.1主要农艺性状测定 9表型性状调查 9三七改良群体产量测定 10三七改良群体有效成分的含量测定 10数据分析 132.2.2三七改良群体的ISSR和SRAP研究 13三七基因组DNA的制备及检测 13ISSR-PCR扩增体系 14ISSR引物筛选 14SRAP-PCR扩增程序 15SRAP引物筛选 17数据分析 183结果与分析 183.1三七改良群体主要农艺性状表型一致性分析 183.2三七改良群体产量分析 213.3三七改良群体品质分析 223.4ISSR和SRAP标记对3个改良群体的特异性、一致性和稳定性分析 253.4.1DNA电泳结果 253.4.2特异性分析 263.4.3一致性分析 333.4.4稳定性分析 343.4.5ISSR和SRAP相关性分析 354讨论 364.1三七集团选择群体的主要农艺性状 364.2三七集团选择群体的产量和品质 364.3三七集团选择群体的一致性和稳定性 364.4三七集团选择群体的综合评价 374.5三七DUS测试标准的指标优化 374.6三七DUS测试的分子标记方法比较 374.7三七集团选择的改良效应 385结论 386创新点 39参考文献 40附录 46在读期间的学术研究 49致谢 50

摘要三七（Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen）为五加科（Araliaceae）人参属多年生草本植物，以根及根茎入药，具有散瘀止血、消肿定痛等功效。三七已有400多年的栽培历史，但仍无选育的品种。本研究以2002年应用集团选择方法建立，并经过四代连续选择的三七紫茎群体（purplestempopulation,PSP）、绿茎群体（greenstempopulation,GSP）和紧凑型群体（compacttypepopulation,CTP）为材料，以自然群体（naturalpopulation,NP）为对照，比较了集团选择后代群体的农艺性状、产量、皂苷组分，并利用ISSR和SRAP分子标记对特异性、一致性、稳定性等进行了鉴定和评价，以期为三七育种提供种质材料，探讨集团选择对三七的遗传改良效应。研究结果如下：1.经四代的连续选择，第五代三七集团选择后代群体的目标性状纯度显著高于未经选择的自然群体。紫茎群体、绿茎群体和紧凑型群体的茎高均小于自然群体约7cm。紫茎群体的紫茎植株比例达到100.0%，较对照提高75.0%；绿茎群体的绿茎植株比例为100.0%，较对照提高70.0%；紧凑型群体的植株复叶柄与花茎夹角≤60°的比例为76.6%，较自然群体提高41.4%。2.集团选择后代群体的存苗率、单根干重和产量均显著高于自然群体。三个集团选择后代群体紫茎群体、绿茎群体和紧凑型群体的存苗率分别较自然群体提高11.6%、6.6%和13.5%；单根干重分别较自然群体提高13.4%、19.2%和34.6%；产量分别较自然群体提高2.7%、13.4%和55.2%。3.绿茎群体的人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1总皂苷含量分别为3.8%、4.9%，均显著高于自然群体，紫茎群体和紧凑型群体与自然群体无差异。4.基于ISSR和SRAP分子标记，第四代和第五代的3个改良群体和自然群体的特异性、一致性均显著大于自然群体，3个改良群体的特异性和一致性关系是紫茎群体＞紧凑型群体＞绿茎群体。第四代与第五代的3个改良群体的Nei基因多样性指数和Shannon多样性指数变化趋势差异不显著，3个改良群体的稳定性较好。5.将ISSR和SRAP的遗传相似性系数矩阵进行相关性分析，第四代和第五代的3个改良群体的相关系数为0.5437，达到显著性水平。ISSR扩增结果的遗传相似性系数分别为0.5585~0.9231和0.6579~0.9000；SRAP扩增结果的遗传相似性系数分别在0.5132~0.8441和0.6258~0.8537。ISSR标记揭示的遗传相似性系数范围比SRAP标记广，说明ISSR标记更适用于三七集团选择后代的DUS测试分析。综上所述，3个集团选择群体均表现出矮杆、高存苗率的特点，一致性、稳定性显著提高，绿茎群体优质高产特性突出，紧凑型群体产量较高，可经进一步鉴定评价后作为三七新品种推广应用。集团选择能够显著提高三七后代群体的目标性状纯度、存苗率、单根干重、产量和遗传一致性，具有良好的选择效应。关键词：三七；DUS测试；集团选择；农艺性状；ISSR；SRAP；皂苷含量

IdentificationandEvaluationonthreepopulationsofPanaxnotoginsengbymassselectionYangYun(Botany)DirectedbyProfessorShengchaoYangABSTRACTPanaxnotoginseng(Burk.)F.H.ChenbelongstoPanaxL.genusofAraliaceae,isaperennialherbs.Itsrootandrootstockwasusedasmedicalherbsforitshemostaticandrestorativeproperties.Accordingtohistoricalrecords,P.notoginsenghasbeencultivatedformorethan400years,stillhasnotstrainsnow.weusedpurplestempopulation(PSP),greenstempopulation(GSP),compacttypepopulation(CTP)asmaterialwhichwasbuildbymassselectionin2002,andselectedoverfourgeneration,thenaturalpopulation(NP)ascontrast.Comparedagronomiccharacters,yield,saponinconstituentsofthreepopulations,wealsoidentificationandevaluationdistinctness,uniformity,stabilitybyISSRandSRAPmarker,inordertoprovidethegermplasmresourcesforP.notoginsengbreeding,discussingtheeffectofmassselection.Themainresultswereasfollows:1.Thepurityofaimtraitsaresignificanthigherthannaturalpopulationbyfourgenerationselection.Theheightofpurplestempopulation,greenstempopulation,compacttypepopulationarelowerthannaturalpopulationabout7cm.Theratioofpurplestemandtransitioninpurplestempopulationreaching100.0%,increased75.0%morethannaturalpopulation.Theratioofgreenstemingreenstempopulationreaching100.0%,increased70.0%morethannaturalpopulation.Theratioofcompoundleafandpedunclewhichangle≤60°is76.6%,increased41.4%morethannaturalpopulation.2.Thedepositrate,dryrootandyieldofoffspringaresignificanthigherthannaturalpopulation.Thedepositrateofpurplestempopulation,greenstempopulation,compacttypepopulationincreased11.6%,6.6%,13.5%morethannaturalpopulation,thedryrootincreased13.4%,19.2%,34.6%morethannaturalpopulation,theyieldincreased2.7%,13.4%,55.2%morethannaturalpopulationrespectively.3.ThecontentofginsenosideRg1,ginsenosideRb1ingreenstempopulationare3.8%,4.94.Thedistinctness,uniformityandstabilityofthefourgenerationandfivegenerationaresignificanthigherthannaturalpopulationstudiedbyISSRandSRAP.Thedistinctnessanduniformityrelationshipofthreegroupsarepurplestempopulation＞compacttypepopulation＞greenstempopulation.ThevarationofNeigenediversityindexandShannondiversityindexarenosignificantdifference,thestabilityofthreepopulationsarebetter.5.Thecorrelativecoefficientis0.5437meansofanalyzingthevalueofGSofISSRandSRAP,andtheresultcameoutoutstanding.ThevalueofGSwasestimatedfrom0.5585to0.9231and0.6579to0.9000basedontheISSRanalysis,0.5132to0.8441and0.6258to0.8537basedontheSRAPanalysis.TheGSrangeofISSRiswiderthanSRAP,soISSRmakerismoresuitablefordistinctnessanduniformitystudyofthreepopulationsbymassselection.Inconclusion,thethreepopulationshowshortrodandhighdepositrate,uniformityandstabilityaresignificantimproving.Thegreenstempopulationshowsgoodqualityandhighoutput,theyieldofcompacttypepopulationishigher,thatcanbeidentifyandevaluateasthenewspeciesused.Massselectioncanimprovethepurityofaimtrait,depositrate,dryroot,yieldandgeneticuniformity,haswelleffectofselection.Keywords:PanaxnotoginsengFHChen;DUStesting;Massselection;Agronomictraits;ISSR;SRAP;Saponincontents三七集团选择后代群体的鉴定与评价PAGE491前言1.1三七概况三七（Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen）为五加科（Araliaceae）人参属多年生草本植物，以根及根茎入药，具有散瘀止血、消肿定痛等功效[1]，是我国特有的名贵中药材之一。三七作为第三纪古热带的残余植物存在于滇桂交界处，该区域被认为是三七的发源地，三七的人工驯化栽培至今已有400多年的历史[2]。三七以其独特的功效，与分布于北方的人参一起共享“北参南七”的美誉。现已开发的以三七为主要原料的药品、保健品、化妆品达300余种，如云南白药、复方丹参滴丸等。云南省文山州等地为三七的主产区，2012年云南三七产区种植面积达30万亩左右，到了有史以来的最高水平，其中2012年三七的采收面积约8万亩，成为云南省最具特色的中药资源品种之一。1.1.1三七植物形态特征及生境分布三七为多年生宿根性草本植物，株高30~60cm，根茎粗短，主根粗壮肉质，倒圆锥形或纺锤肉质根一条，块根有圆锥形（俗称团七、疙瘩七）和萝卜形（俗称萝卜七），表明棕色或暗褐色，直径1~3cm，有分枝多数支根。茎直立，绿色、紫色和过渡色，光滑无毛。叶为掌状复叶，对生或者轮生于茎顶，每个掌状复叶5~7片小叶，小叶边缘有细锯齿，叶片正反面及叶脉上有细小刚毛，掌状复叶的叶柄着生处有托叶。伞形花序，顶生，花两性，花多数，两年即可开花结果。花期7~9月，果实成熟10~12月，浆果，果实颜色有红色和黄色，肾形和扁球形，种子1-2粒，近球形三七起源于2500万年前的第三古世纪热带的中国西南山区，主要分布局限于23°30′附近的中海拔地区，分布范围狭小[3]。三七适宜于分布在气温（月平均）：最低不低于0℃，最高不高于33℃；降雨量（年）：1000~1500mm；海拔不高于1000~1600m，湿度75%~85%；土壤：红壤和棕红壤[4]1.1.2三七表型变异类型研究目前，三七的栽培群体依旧是长期栽培驯化中形成的异质杂合体，无严格意义上的现代栽培品种[7]，是一个混杂的栽培群体，存在着多种植株上的变异。三七植株存在典型的性状差异，如：茎秆颜色（紫杆、绿杆、过渡型）、块根断面颜色（绿根、紫根）、果实（红果、黄果）、叶柄弯曲程度（直立型、平展型）、复叶数（3、4、5、6）、根的性状（长、圆）、小叶形状（狭长、普通、宽叶）、茎数（1、2、3）等变异类型等[8]。三七居群间和居群内表型变异明显，其中地下茎变异较明显，变异系数达0.433~0.617，生物量性状的变异也相对较大[9]。三七栽培群体个体间主要皂苷组分含量相差3.6~10.2倍，总皂苷含量则相差2.0倍[10]。1.1.3三七分子生物学特性研究三七为二倍体植物，染色体组X=12，全部为中着丝点染色体，臂比的范围在1.68~1.17间，全部染色体的臂比值小于2。三七经过多年的人工驯化栽培，其栽培群体从遗传背景来看还是一个杂合体，具有丰富的遗传多样性[11,12]。张金渝等[7]选取了4个不同区域的17份三七选育品系，通过EST-SSR标记研究了集团选择的结果，发现三七具有丰富的遗传多样性，彼此间具有较高的基因交流，居群间遗传分化水平低，居群内遗传差异较大。肖慧等[13]通过同工酶标记研究了三七种内的遗传多样性，发现遗传变异主要存在居群间，居群内分化较小。然而，三七却是长期未经遗传改良和没有其他基因资源引入的混杂群体，至今尚无三七栽培群体内的类型筛选和品种选育方面的研究工作。引入野生种质和筛选栽培群体内优良类型，并通过鉴定和筛选这些种内变异类型，建立栽培群体种质库，成了三七栽培物种遗传改良的主要途径。1.1.4三七化学成分研究进展三七作为传统中药已有悠久的应用历史，国内外研究结果表明，三七的主要化学成分是皂苷类，此外还有糖类、氨基酸、黄酮类、甾醇类、聚炔甾醇类、有机酸、挥发油等化学成分[14-21]。1.1.5三七药理学研究进展研究结果表明，三七具有止血、抗血栓形成、保护心肌、抗冠心病、保护脑组织、扩血管和降压、镇静、镇痛、增智、抗炎、保肝、滋补、强壮、抗衰老等作用[22-26]。1.2集团选择集团选择就是在比较复杂的原始群体中（种性来源不一），选择各种类型的个体，在将入选个体归类组成几个集团，如高杆类、矮杆类、早熟类、晚熟类等。将同一类型的入选个体混合脱粒，播种在一个小区内，将各集团与原始群体进行比较鉴定，从而选出优良集团[27]。集团选择法简单易行，易为群众掌握，且后代生活力不易衰退，集团内性状一致性提高比混合选择快，比单株选择慢。杨生超等[28]应用集团选择的方法，成功选育出灯盏花（Erigeronbreviscapus（Vant.）Hand.-Mazz.）优质、高产新品种“千山1号”和“千山2号”。近年来人参育种取得了很大成效，中国农业科学院特产研究所赵亚会等人1986~1996年根据人参育种现状和特点，在人参混合群体中，以单根重、根形等经济性状选择了4个集团，现已成功育成2个人参新品种—“吉参1号”和“吉林黄果参”，表现出产量高、单根重、根形美观、植株长势强、种子千粒重和皂苷含量高等优点[29,30]。“滇重楼2号”采用了集团混合选择法，经6年而育成。茎杆为淡紫色、多茎、茎数为“滇重楼1号”的5倍多；根茎有效成分重楼皂苷Ⅰ和Ⅱ总量为(1.43±0.23)%，高于药典，多达78.8%；产量是“滇重楼1号”的2倍[31]。油菜的杂交选择育种通常采用的是集团选择和系谱有机结合的选择方法，形成了油菜系谱集团选择法，并应用于油菜品系的选育中[32,33]。“宁麦9号”就是采用集团选择法育成的品种之一，品种显示出推广面积大、高产、稳定等特点[34]。1.3DUS测试（1）DUS测试的概念和意义DUS测试是对植物新品种的特异性（Distinctness）、一致性（Uniformity）和稳定性（Stability）进行测试的过程[35]，是一个农作物新品种应具备的三个基本条件，是植物新品种保护的技术基础和授予品种权的科学依据[36]。（2）DUS测试的应用目前国外DUS测试主要有3钟形式：官方测试、育种者测试和二者结合的测试。中国于1997年3月，公布了《中华人民共和国植物新品种保护条列》，并于1999年加入了国际植物新品种保护联盟（UPOV），同年受理公布了18个植物属或种的新品种[37]。目前，菊花[38]、唐菖蒲[39]、百合[40]、红花[41]、柴胡[42]等药用植物已经制定了新品种DUS测试指南且进行了DUS测试。以农艺性状为基础的DUS测试易受周期长、测试指标多、操作复杂、季节限制和外界环境干扰等影响，寻找可靠的方法来完善现有的DUS测试技术已经成为植物新品种DUS测试的关键。综合各方面考虑，DNA指纹技术就能够补充形态学上的缺点[43]。1.4分子标记及其应用近年来，遗传标记在植物品种（品系）鉴定上被越来越多地应用。常用的遗传标记有以下几大类：形态标记、细胞标记、生化标记、分子标记。（1）形态学标记形态学标记是指在植物生长发育的过程中，用肉眼能观察到的外部形态特征或特性，如：叶形、花型、枝态、株高、粒重、穗长、果形等。张忠义等[44]在对9个主要性状建立专家打分系统及种质资源定量评估的基础上，根据方差分析结果将洛阳牡丹品种划分为优、良、一般和差4个等级。舒世珍等[45]对国外红花优异资源进行了评价、鉴定与聚类分析，初步认为高产优质、抗逆性强、油花兼用资源是优中之优。李静等[46]对40份石斛兰种质的植物学性状、农艺性状进行观察，以观赏性为指标划分出了迷你小花型、蝴蝶石斛型、羚羊角石斛型等三种类型。形态标记虽然简单直观，但是其标记数有限、多态性差、易受环境条件影。如需在短期内了解变异性而其他方法又无法开展之时，形态学手段是一种有价值的选择。（2）细胞学标记此方法是将染色体细胞学形态作为遗传标记，表现在染色体数目变异（整倍性或非整倍性）和染色体结构变异（缺失、倒位、易位、重位）等。细胞学标记主要包括核型、染色体带型、原位杂交及染色体的非整倍性和结构变异等。细胞学标记不受环境的影响，但其所需材料较多、人力投入大和花费时间长，且鉴定分析繁琐。（3）生化标记指生物的生化特征与特性，主要包括贮藏蛋白、次生代谢物和同工酶[47]。与形态性状、细胞学特征相比，生化标记表现中性，对经济性状没有显著的不良影响；可以直接反映基因产物的差异，具有数量更丰富、受环境影响较小等优点。（4）分子标记分子标记是用一定的方法在DNA水平上反映物种个体间或种群间DNA片段上的差异，是遗传多样性在DNA水平上的直接反映。依据对DNA多态性的检测手段的不同，DNA标记可以分为三大类：第一类是以PCR为基础的DNA分子标记技术（RAPD、AFLP、SSR、ISSR、STS、EST、SRAP、RP-PCR、RD-PCR）；第二类是以基因组序列为核心的分子标记技术（SNP、InDel、cSSR、ITS)；第三类是以分子杂交技术为基础的分子标记技术（RFLP、SSCP-RFLP、DGGE-RFLP）。目前最常用的有RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR、SRAP等，并且已经在一些植物上开展了与DUS相关的研究。这些研究为利用分子标记技术开展DUS测试奠定了坚实的理论基础[48,49]。①限制性酶切片段长度多态性标记（RFLP）RFLP（RestrictionFragmentlengthpolymorphicDNAmarker，限制性酶切片段长度多态性），是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定的DNA片段的大小，由Grodzicker创立于1974年[50]，也是最早发展起来和应用最广的分子标记技术。该技术被广泛应用于解释种群间关系或推断种上的系统发育，测量种内、居群间和居群间的变化，研究系统学和进化学，以及构建连锁群的遗传图谱等方面[51]。RFLP标记特点是共显性，可以区别纯合和杂合基因型，而且稳定、重复性强。但是RFLP也存在着一些缺点：费用昂贵、费时费力、周期长、所需的DNA样品量较大。②随机扩增的多态性DNA标记（RAPD）RAPD（RandomamplifiedpolymorphicDNA，随机扩增多态性DNA），由Williams和Welsh1990年领导的2个研究小组几乎同时发展起来的，建立在PCR基础上的一种新型的DNA分子标记技术[52,53]。RAPD的优点是：不需要DNA探针、使用随机引物、技术操作简单和快捷、分析所需DNA量少。局限性：为显性标记，不能在F2代区分纯合体和杂合体，须进行F3代分析；退火温度较常规PCR反应低，扩增结果易受外界因素的影响，重复性较差。目前，该技术已经应用在检测遗传多样性、基因定位，品系鉴定、医学诊断、遗传图谱构建和系统学研究等领域中[54-59]。③扩增片段长度多态性标记（AFLP）AFLP（Amplifiedfragmentlengthpolymorphism，扩增片段长度多态性），是1993年由荷兰keygene公司科学家Zabeau等人发明的一种DNA分子标记技术[60]。AFLP技术是将RFLP与PCR结合的一种方法，即继承了RFLP技术的稳定性，又具有PCR反应快速、灵敏的特点，同时克服了RFLP和RAPD的缺点，且扩增的条纹多，实验重复性高[61]，其缺点是对模板反应迟钝、成本高、对技术要求严格[62]。AFLP标记已应用于构建遗传连锁图谱、品种纯度鉴定、检测遗传多样性、种质资源鉴别、定位克隆基因等方面[63-67]。④简单重复序列标记（SSR）SSR（SimpleSequenceRepeat，微卫星DNA），是指以少数几个核苷酸（1~6个）为重复单位的简单串联重复DNA序列，通常为2~3个核苷酸[68]。优点：共显性标记、结果重复性高、比RFLP的多态性丰富和操作简单快速。缺点：需建立筛选基因组文库和克隆测序、工作量大、费时、费用高等。目前，该方法已应用于种质资源鉴定、构建品种指纹图谱、遗传多样性研究等方面[69-71]。⑤简单重复间序列标记（ISSR）ISSR(Inter-simplesequencerepeats，简单重复间序列)，是Zietkeiwitcz等[72]于1994年提出来的一种微卫星基础上的分子标记。它应用锚定的微卫星DNA为引物，即在SSR序列的3ˊ端或5ˊ端加上2~4个随机核苷酸，在PCR反应中，锚定引物可引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增。ISSR结合了简单重复序列(SSR)标记技术和随机引物扩增多态性(RAPD)标记技术的优点[73]，其引物不但能在种间通用，而且更能揭示物种间的多态性，其检测手段非常方便快捷。现已被应用于种质资源鉴定和指纹图谱构建[74,75]、遗传多样性和亲缘关系研究[76,77]、基因定位和分子标记辅助选择[78]等方面的研究。⑥相关序列扩增多态性标记(SRAP)SRAP（Sequencerelatedamplifiedpolymorphism，相关序列扩增多态性）分子标记是一种结合了RAPD、AFLP、RFLP等分子标记优点并克服其缺点的PCR标记系统的显性新型标记，是通过独特的双引物（17bp上游引物和18bp下游引物）设计对启动子或内含子区域进行特异扩增，其引物具有通用性，由美国加州大学作物系Li和Quiros博士提出的[79]。SRAP分子标记具有多态性高、重复性好、易操作、快捷方便、成本低、在基因组中分布均匀、易对特定序列进行测序与相关基因的克隆等诸多优点。SRAP标记基础自建立起来，已被广泛应用于构建遗传图谱、遗传多样性研究、比较基因组学、标定基因等方面[80-83]。1.5本研究的目的意义本研究以2002年应用集团选择方法建立，并经过四代连续选择的三七紫茎群体、绿茎群体和紧凑型群体为材料，以自然群体为对照，比较了集团选择后代群体的农艺性状、产量、皂苷组分，并利用ISSR和SRAP分子标记对特异性、一致性、稳定性等进行了鉴定和评价，以期为三七育种提供种质材料，探讨集团选择对三七的遗传改良效应。1.6技术路线三七改良群体三七改良群体农艺性状调查分子标记产量及皂苷组成测定数量性状质量性状三七集团选择后代群体的鉴定和评价，集团选择效应分析ISSR和SRAP标记表型一致性分析特异性、一致性、和稳定性分析产量和三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd测定产量和皂苷组分分析2材料与方法2.1试验材料2.1.1供试材料云南省文山州文山三七科技示范园于2002年以矮杆、茎色和复叶柄与花茎夹角这三个性状为指标，利用集团选择法成功构建了紫茎群体（purplestempopulation,PSP）、绿茎群体（greenstempopulation,GSP）和紧凑型群体（compacttypepopulation,CTP）三份材料，其中紫茎群体和绿茎群体经过了四代多的纯化，其纯度已经达到90%。2012年3个改良群体已经繁殖到了第五代。本研究的试验材料种植于云南省文山州文山三七科技示范园基地试验小区，小区采取随机区组设计，取面积相等的4个小区用于试验，小区面积为6.4m2，种子种植密度、田间管理措施等一致。试验材料主要为第四代的3个改良群和自然群体的三年生植株幼嫩叶片及块根，第五代的一年生植株幼嫩叶片2.1.2主要仪器试验所用主要仪器为游标卡尺、直尺、量角器、电子天平和卷尺、水浴锅、冰箱、灭菌锅、DYCZ-30型电泳仪及配套电泳槽(北京六一厂)、Sigma3-16PK型冷冻离心机、凝胶成像系统、BIO-RADthermalcyclePCR仪、Agilent1260Infinity液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）、SB-5200D超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）、美国丹佛电子分析天平TP-214、Mettler-ToledoAE240型电子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）、奥利邦1000A型粉碎机（上海赛耐机械有限公司）。2.1.3主要试剂TaqDNA酶、dNTPs、Buffer等均购于昆明云科生物技术有限公司，ISSR引物、SRAP引物、Maker、无水乙醇、EDTA-Na2·2H2O、Tris、琼脂糖等产品购自昆明硕阳科技有限公司；对照品人参皂苷Rg1（020101S，纯度＞98%）、人参皂苷Re(020103S，纯度＞98%)、人参皂苷Rb1(020105S，纯度＞98%)、人参皂苷Rd(020102S，纯度＞98%)购自北京百灵威科技有限公司，三七皂苷R1（11074S-200617，供含量测定用）购自中国食品生物制品检定所。甲醇、乙腈为色谱纯（天津市西华特种试剂厂），水为娃哈哈纯净水，0.45µm微孔膜，其余试剂和试药均为分析纯。2.2试验方法2.2.1主要农艺性状测定表型性状调查三七植株的性状观测参照植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南（三七）的要求，选择田间观测性状28个。将所观测性状分为质量性状和数量性状，质量性状进一步划分为二元性状和多态性状。上述28个性状分为4个二元性状、8个多态性状及16个数量性状（见表2-1）。每个改良群体按小区3、6、9行顺序依次取样20株进行观测，重复测量3次，最后取平均值。二元和多态性状参照模式图用肉眼进行观测；数量性状采用游标卡尺、直尺、量角器、电子天平和卷尺等测定[84]。对于质量性状，以各性状的众数频数的算术平均值表示；数量性状用算术平均值和变异系数来表示。表2-1三七表型一致性分析所选的28个观测性状编码Table2-1Twenty-eightcharactersandcodesofP.notoginsengfortheanalysisofmorphologicaluniformity编号性状编码数编码类型编号性状编码数编码类型T1叶缘锯齿1~2二元T15茎粗—数值T2每个复叶小叶数1~2二元T16花茎高与茎高比率—数值T3花形1~2二元T17株高—数值T4根形状1~2二元T18中叶长—数值T5茎色1~3多态T19中叶宽—数值T6茎数1~3多态T20中叶长宽比—数值T7叶形1~3多态T21叶面积—数值T8复叶着生角度1~3多态T22复叶柄长—数值T9单株复叶数1~4多态T23单株果实重—数值T10花柄颜色1~3多态T24单株果实数—数值T11果实颜色1~2多态T25主根长—数值T12果实形状1~3多态T26主根粗—数值T13茎高—数值T27主根鲜重—数值T14花茎高—数值T28主根干重—数值三七改良群体产量测定2012年12月中旬对第四代集团选择的3个改良群体和自然群体的块根进行采挖，洗净泥土，随机选取60株新鲜块根用于称重，自然晾干后称取单株干重。并依据试验小区三七块根实际采挖量计算各个群体的存苗率和产量等。三七改良群体有效成分的含量测定（1）供试样品的制备参考《中国药典》2010年版（一部）中三七含量测定项下供试溶液制备的方法，精密称取自然晾干并打粉的的三七块根样品（过40目筛）0.6g置于50mL容量瓶中，加入30mL100%甲醇溶液浸泡30min，超声提取1h，再用甲醇定容至刻度，摇匀，静置30min。用0.45（2）对照品溶液的制备精密称取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd对照品适量，用甲醇溶解并定容于10mL容量瓶中，摇匀，制得上述对照品溶液，浓度分别为0.454，0.355，0.462，0.466，0.449mg·mL-1，4℃（3）色谱条件色谱柱为AgilentZorbarSB-C18(250mm×4.6mm，5µm),流动相为乙腈（A）-水（B），流速1.5mL·min-1,检测波长203nm，柱温30℃，流动相洗脱方法见表2-2表2-2流动相梯度洗脱方法Table2-2MethodofMobilephasegradientelute时间/min流动相A/%流动相B/%02080222080474654575545625545632080692080（4）方法学考察①精密度试验选取3个改良群体中的紫茎群体，按“（1）”项下制备供试溶液，连续进样6次，测得峰面积RSD分别为三七皂苷R1:0.78%，人参皂苷Rg1:1.25%，人参皂苷Re:0.85%，人参皂苷Rb1:1.06%，人参皂苷Rd:0.73%。②重复性试验精密称取紫茎群体块根粉末（过40目筛）0.6g，平均6份，按“（1）”项下制备6份供试溶液，每次进样10µL。按“（3）”项下色谱条件测定，测得三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd的平均含量分别为1.06%，6.62%，0.75%，2.40%，0.45%；③稳定性试验按“(1)”下制备供试溶液，室温放置，分别于0、2、4、6、8、10、12、24h，按“（3）”项下的色谱条件进样10µL测定，记录峰面积值，对样品进行分析。结果表明，三七中各皂苷峰面积积分值变化不大，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd的峰面积RSD分别为0.44%、0.31%、0.35%、0.28%、0.59％，表明样品在24h内是稳定的。④加样回收率试验精密称取6份已知含量的紫茎群体块根粉末（过40目筛），每份0.3g。分别准确加入与样品含量相当的对照品溶液，按“（1）”项下制备供试溶液，依次测定五种主要皂苷成分的峰面积并计算回收率。三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd的平均回收率分别为98.92%、98.97%、98.73%、99.01%、98.86%；（5）线性关系考察设置进样程序，分别进样三七皂苷R13µL、人参皂苷Rg116µL、人参皂苷Re7µL、人参皂苷Rb113µL、人参皂苷Rd4µL得到对照品混合溶液，重复3次，记录色谱图，得到三七总皂苷对照品HPLC色谱图（图1）。分别精密吸取三七总皂苷对照品溶液1、2、5、10、15µL，用高效液相色谱仪进样分析，以进样量（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线。5种对照品的峰面积与进样量呈良好线性关系，结果见表2-3。标准曲线见图2。表2-35种对照品的线性方程Table2-3LinearequationoffiveReferencesubstance三七总皂苷回归方程r线性范围/µg三七皂苷R1Y=108.6X-43.50.99970.454～6.81人参皂苷Rg1Y=68.6X-78.50.99950.355～5.325人参皂苷ReY=80.9X-29.20.99970.462～6.93人参皂苷Rb1Y=90.0X-104.10.99960.466～6.99人参皂苷RdY=94.7X+12.20.99990.449～6.735图1三七总皂苷HPLC指纹图谱Fig.1TotalsaponinofHPLCFingerprintingofP.notoginseng图2三七总皂苷的标准曲线Fig.2ThestandardcurveoftotalsaponinsofP.notoginseng（6）样品含量测定精密称取3个改良群体的块根粉末（过40目筛）0.6g，按“（1）”项下制备供试溶液，按“（3）”项下的色谱条件进样10µL测定，记录峰面积值，采用外标法，分别计算样品中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb数据分析利用SPSS18.0统计软件和Excel对试验数据进行处理分析。2.2.2三七改良群体的ISSR和SRAP研究三七基因组DNA的制备及检测以三七幼叶为材料，利用改良CTAB法提取基因组DNA，通过紫外分光光度计和1.5%琼脂糖凝胶电泳法检测DNA质量，计算DNA的浓度，并稀释至30ng·µL-1，检测合格的样品DNA保存于-20℃冰箱备用。ISSR-PCR扩增体系试验所用引物参照加拿大温哥华哥伦比亚大学UBC公司公布的第九套ISSR引物序列，由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。ISSR-PCR扩增反应体系为（15µL）：10×PCRBuffer(Mg2+)1.5μLdNTPs1.2μL引物1μLTaq酶（5U·μL-1）0.15μLDNA模板（30ng·μL-1）1μLddH2O10.15μL扩增反应程序为：94℃预变性5min→94℃变性30s→各ISSR引物的退火温度60s→72℃延伸90s→38个循环，完成最后一个循环后→72℃延伸7min→4℃保存。所有的PCR扩增反应都在BIO-RADthermalcyclePCR基因扩增仪上进行，扩增结束后，采用l×TAE电泳缓冲液，在2%琼脂糖(含EB)凝胶中电泳，电泳条件为90V，1.5h，同时在琼脂糖凝胶的左边第一孔位置加上一个已知分子量的DNA标准样品(2000bpDNALadderMarker)，电泳结束后，凝胶成像系统下拍照，用于数据的分析。ISSR引物筛选从加拿大温哥华哥伦比亚大学开发的100个ISSR引物中随机选取60个引物，在北京六合华大基因科技股份有限公司进行合成，根据其Tm值，分别用Tm±5℃来确定每条引物合适的退火温度，共筛选出了16个特异性强和条带多的引物用于试验，见表2-4表2-416个ISSR引物序列表Table2-4SixteenISSRprimersISSRPrimerSequence(5′-3′)ISSRPrimerSequence(5′-3′)TR16(AC)8-T840(GA)8-YTTR17(AC)8-G841(GA)8-YCTR18(AC)8-C842(GA)8-YG811(GA)8-C843(CT)8-RA815(CT)8-G855(AC)8-YT834(AG)8-YT857(AC)8-YG835(AG)8-YC866(CT)8-C836(AG)8-YA873(GA)8-AY=(C,T)；R=(A,G)SRAP-PCR扩增程序SRAP-PCR扩增反应体系为（20µL）：10×PCRBuffer(Mg2+)2μLdNTPs1.6μL正反向引物各1μLTaq酶（5U·μL-1）0.2μLDNA模板（30ng·μL-1）1μLddH2O13.2μL扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，35℃退火1min，72℃延伸1min，共5个循环；随后94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min；4℃保存。所有的PCR扩增反应SRAP-PCR扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳实验步骤：（1）聚丙烯酰胺凝胶的制备①清洗玻璃板：将短板、长板、梳子、边条等用洗涤剂清洗干净，然后用蒸馏水擦拭，再用酒精横向和竖向擦拭，晾干。②涂板：将长短板水平放置，分别在长板及短板上涂上亲和硅烷和剥离硅烷，涂完板后将板放置20min以上，充分晾干备用。③聚丙烯凝胶的配制（6%）30%母液28mL5×TBE14mL10%AP467µLTEMED35µL④灌胶将封好的胶板倾斜30°放置，从边缘轻缓灌入凝胶，边灌边轻轻敲打玻璃板，使胶扩散均匀，并于室温下放置2h左右，待凝胶完全后进行电泳。（2）扩增产物的变性及凝胶电泳分析在SRAP-PCR扩增产物(20µL)中加入6µLLoadingBuffer，振荡混匀，在4℃①凝胶电泳a）预电泳将凝胶板组装到电泳仪上，在电泳槽中加入1×TBE缓冲液，接通电源准备预电泳，预电泳30min左右。吹洗胶面上的残胶，关闭电泳仪准备点样。b）加样及电泳吸取产物6µL，加入到锯齿空出，中间位置加入4µL2000bpDNAMarker，1500V，60W，60mA电泳2h左右，待Buffer跑至距离胶板底部1/5处时即停止电泳。（3）凝胶的银染①固定/脱色放去缓冲液，将胶板从电泳槽取下，将两板小心分开，取下短板，将长胶板放入固定液中，轻摇30min至胶板上示踪染料全部退去为止，回收固定液放入冰箱中。②漂洗取出长板，在蒸馏水中漂洗2~3次，每次3min。取出胶板，滤水，将胶板放于染色液中。③染色遮光，将胶板放入1.6L现配银染液（1.6gAgNO3+2.4mL37%的甲醛，加水至1.6④显影染色完毕后，将胶板放于蒸馏水中迅速漂洗5s左右，立即将胶板放入显色液（1600mL＋48gNa2CO3，使用前加入甲醛2.4mL、320µL⑤定影及漂洗停影将胶板放入10%醋酸溶液中，终止显影，定影3~5min。接着将板放入纯净水中漂洗2次，每次3min，自然晾干，扫描仪上进行图片扫描及条带统计。SRAP引物筛选利用3个DNA模板对5条正向引物和6条反向引物合成的30对随机引物进行筛选，见表2-5，选择出多态性好，带型清晰的引物组合用于分析。表2-5SRAP标记的正反向引物序列（5′–3′）Table2-5ForwardandReverseprimerofSRAPmakers.正向引物Forwardprimer反向引物ReverseprimerMe1TGAGTCCAAACCGGATAEm1GACTGCGTACGAATTAATMe2TGAGTCCAAACCGGAGCEm2GACTGCGTACGAATTTGCMe3TGAGTCCAAACCGGAATEm3GACTGCGTACGAATTGACMe4TGAGTCCAAACCGGACCEm4GACTGCGTACGAATTTGAMe5TGAGTCCAAACCGGAAGEm5GACTGCGTACGAATTAACEm6GACTGCGTACGAATTGCA数据分析按凝胶同一位点上DNA带的有无进行统计，有带的记为“1”，无带的记为“0”，建立0-1矩阵。统计每个引物组合产生的多态性条带数，利用POPGENE32软件统计扩增产物的条带总数和多态带数量，计算Nei′s基因多样性指数(H)、Shannon信息指数(I)、遗传相似系数（Gs）、Nei′s遗传距离（D），并用NTSYS-pc进行聚类分析。利用SPSS18.0对两种分子标记得到的遗传相似系数矩阵进行Pearson相关性分析，以比较两种方法所得结果的一致性。3结果与分析3.1三七改良群体主要农艺性状表型一致性分析12个质量性状的众数频数分析显示（表3-1），紫茎群体的紫茎和过渡茎色植株比例达到100.0%，较对照提高75.0%；绿茎群体的绿茎植株比例为100.0%，较对照提高70.0%；紧凑型群体的植株复叶柄与花茎夹角≤60°的比例为76.6%，较自然群体提高41.4%。16个数量性状的均值和变异系数分析显示（表3-2,3-3），3个改良群体的茎高平均小于自然群体7.0cm左右，另外绿茎群体的花茎比其他两个改良群体和自然群体高出5cm左右。16个性状的平均变异系数均大于10.0%，分布于9.9%~38.9%之间，表明3个改良群体和自然群体的各数量性状在群体间具有较大的变异。单株果实数的平均变异系数最大，为38.9%；主根鲜重、主根干重、主根长的变异系数相对较大，均超过了30.0%；中叶长宽比的变异系数最小，为10.0%。集团选择能够提高目标性状表3-1二元和多态性状频数分析(n=60)Table3-1Frequencyanalysisofqualitativebinarycharactersandqualitativepolymorphiccharacters(n=60)性状PSP（%）GSP（%）CTP（%）NP（%）茎色紫色100.0—20.025.0绿色—100.025.030.0过渡色——55.045.0茎数单茎97.690.794.283.2双茎8.2多茎8.6叶形披针形10.9卵形92.591.394.184.6倒卵状椭圆形———4.5叶缘锯齿浅裂82.685.782.562.4稍深裂17.414.317.537.6小叶数＞712.517.215.611.3≤787.582.884.488.7复叶数≤6.9440.845.442.436.6553.548.948.847.5≥9.0复叶着生角度≤60°47.353.376.635.2＞6052.746.723.464.8花形伞形花100.0100.0100.098.5复伞形花———1.5花柄颜色紫色87.5—55.223.6绿色3.497.815.440.8过渡色35.6果实形状三棱形12.85.710.830.5肾形80.590.584.460.1球形9.4果实颜色黄白色————紫红色14.9朱红色97.298.494.785.1根形状疙瘩状78.568.755.648.9萝卜状21.531.344.451.1表3-216个数量性状的均值(mean±SE,n=60)Table3-2Sixteenquantitativecharactersofmeans(mean±SE,n=60)性状PSPGSPCTPNP茎高（cm）34.7±5.835.1±5.135.3±5.742.1±5.2花茎高（cm）14.1±4.120.5±4.912.8±4.215.9±5茎粗（cm）0.5±0.10.5±0.10.5±0.10.6±0.1花茎与下轴长比率0.42±0.10.6±0.20.37±0.10.38±0.1株高（cm）48.8±7.555.6±6.148.1±758±8.2中叶长（cm）12.3±1.611.9±1.512.3±0.812.2±1.1中叶宽（cm）4.6±0.74.3±0.44.4±0.54.4±0.4中叶长宽比2.7±0.22.7±0.32.8±0.32.8±0.3叶面积（cm2）36.2±9.333.2±6.634.9±5.534.3±5.2复叶柄长（cm）10.1±1.310.6±0.910.0±1.410.8±0.9单株果实重（g）16.6±6.219.3±4.414.6±4.619.6±5.4单株果实数36.6±17.348.7±11.436.9±11.249.0±16.9主根长(cm)4.3±1.56.0±1.75.2±1.65.0±1.6主根粗（cm）2.1±0.51.9±0.32.0±0.42.0±0.3主根鲜重（g）21.0±8.424.4±7.924.1±10.622.6±6.1主根干重（g）10.2±3.010.6±3.011.3±4.410.0±2.5表3-316个数量性状的CV（%）(n=60)Table3-3SixteenquantitativecharactersofCV(%)(n=60)性状PSP（%）GSP（%）CTP（%）NP（%）Mean（%）茎高16.714.516.212.414.9花茎高29.123.932.831.529.3茎粗16.79.411.58.511.5花茎与下轴长比率23.833.327.026.327.6株高15.411.015.614.114.0中叶长13.010.3中叶宽15.29.3中叶长宽比7.411.110.710.710.0叶面积26.420.316.115.519.6复叶柄长12.98.514.08.310.9单株果实重37.623.031.727.730.0单株果实数47.323.430.534.538.9主根长34.627.631.731.731.4主根粗24.015.120.516.419.0主根鲜重39.932.543.927.035.8主根干重29.328.039.024.630.23.2三七改良群体产量分析3个改良群体和自然群体的存苗率、鲜重、单株干重和产量等见表3-4。从存苗率来看，紫茎群体和紧凑型群体与自然群体的差异异极显著，紫茎群体与绿茎群体差异不显著，绿茎群体与紧凑型群体和自然群体的差异显著。从鲜重来看，绿茎群体与紫茎群体、紧凑型群体和自然群体差异显著，紫茎群体、紧凑型群体和自然群体间差异不显著。从单株干重来看，绿茎群体和紧凑型群体与紫茎群体和自然群体差异显著，紫茎群体与自然群体、绿茎群体与紧凑型群体差异均不显著。从产量来看紧凑型群体与紫茎群体和自然群体差异极显著，绿茎群体与紫茎群体和自然群体的差异显著，绿茎群体与紧凑型群体差异显著，紫茎群体与自然群体差异不显著。集团选择的3个后代群体的存苗率和产量较自然群体有显著提高。表3-43个改良群体和自然群体的产量（mean±SE）Table3-4Theproductionofthreeimprovingpopulationsandnaturalpopulation（mean±SE）群体(Populations)存苗率（%）鲜重（g·株-1）单株干重（g·株-1）产量（kg/hm2）PSP52.021.0±1.9b5.9±0.2014.3GSP47.9b24.4±1.6.2±0.62363.2bCTP53.921.1±2.4b7.0±0.93170.5NP4020.6±1.4b5.2±0.6b1979.7注：同列数值后不同小写字母表示差异显著（P﹤0.05）3.3三七改良群体品质分析鉴于中药的有效成分含量是中药质量的内在标准，目前对于道地药材的品质评价，有效成分含量的测定最为常用，结果也精确，避免了人为主观因素的影响。而三七中其主要的有效成分是三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd等5种皂苷，因此通过准确测定这五种皂苷的含量就能对我们选育的3个群体进行评价。3个改良群体和自然群体中的三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd的含量差异不显著；绿茎群体与紫茎群体、紫茎群体和自然群体的人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1含量差异显著，紫茎群体、紧凑型群体和自然群体之间差异不显著；绿茎群体与紫茎群体、紧凑型群体和自然群体中5种皂苷总量差异显著，紫茎群体、紧凑型群体和自然群体之间差异不显著。紫茎群体、绿茎群体、紧凑型群体中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的含量分别为9.2%，10.6%，8.2%，符合药典规定标准。综合考虑，3个群体中绿茎群体的品质最好，紫茎群体次之，紧凑型群体最差。3个改良群体和自然群体的含量测定结果见表3-5，HPLC色谱图见（图3，图4，图5，图6）。表3-53个改良群体和自然群体的三七总皂苷含量Table3-5ThetotalsaponincontainsofP.notoginsengofthreepopulationsandnaturalpopulation群体(Populations)皂苷含量（%）R1ReRb1Rg1RdRb1+Rg1+R1总含量PSP1.7±0.20.5±0.13.5±0.6b4.0±0.9b0.8±0.29.2±3.4b10.5±2.9bGSP1.9±0.50.9±0.13.8±0.4.9±0.91.2±0.210.6±4.112.7±3.9CTP2.2±0.40.7±0.2.8±0.4b3.2±0.9b0.8±0.18.2±2.9b9.7±2.9bNP1.1±0.0.2±0.12.3±0.5b2.9±0.7b0.6±0.16.3±3.1b7.1±3.3b注：同列数值后不同小写字母表示差异显著（P﹤0.05）图3紫茎群体HPLC色谱图Fig.3HPLCfingerprintingofpurplestempopulation图4绿茎群体HPLC色谱图Fig.4HPLCfingerprintingofgreenstempopulation图5紧凑型群体HPLC色谱图Fig.5HPLCfingerprintingofcompacttypepopulation图6对照HPLC色谱图Fig.6HPLCfingerprintingofnaturalpopulation3.4ISSR和SRAP标记对3个改良群体的特异性、一致性和稳定性分析3.4.1DNA电泳结果三七基因组总DNA电泳检测见图7。由图可见样品DNA整齐一致，条带清晰，无拖尾弥散现象，表明DNA比较完整，可以用于下一步的PCR扩增反应。图7三七总DNA电泳检测图Fig.7Electrophoresisp