人类外周血染色体标本制备及核型分析课件

分子医学实验闫小毅电话:88208257E-Mail:人类外周血染色体标本制备G带观察及核型分析人类外周血染色体标本制备染色体G带观察染色体核型分析人类外周血染色体标本制备实验目的熟悉人类外周血淋巴细胞的培养方法。初步掌握人类染色体标本培养和制备的基本方法实验原理在细胞周期的不同阶段,染色体的结构不同,在细胞分裂间期,染色体呈现细长的丝状结构,分散于细胞核中,且交织成网状,难以识别其数目和每个染色体特有的结构;在细胞有丝分裂中期,染色体凝缩形成短的棒状结构,排列在赤道板上,此时染色体的形态、数目最清楚,所以一般选择有丝分裂中期的细胞来观察染色体的形态、数目。在人类遗传分析中,普遍采用外周血培养的方法制备染色体标本。但是在正常情况下,外周血中的淋巴细胞,几乎都处在G1期或G0期,因而外周血细胞中是没有分裂相的。在细胞培养过程中加入植物血凝素(phytohaemagglutinin,PHA),可以刺激外周血淋巴细胞转变为淋巴母细胞,进行有丝分裂,再通过秋水仙素处理,将细胞阻断在有丝分离中期。再通过离心、低渗、固定和滴片,就可以获得大量有丝分裂相。最后通过染色就可以观察染色体的结构和数目。本方法已为临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。实验步骤采血2、培养RPMI1640培养液,37℃±0.5℃恒温中培养72小时。3、秋水仙素(colchicine)处理在终止培养前2-3小时,加入秋水仙素4、离心以1000转/分离心10分钟,弃上清,留沉淀并用吸管打匀5、低渗处理加⑧毫升预温(37℃)的0.075MKC低渗液(hypotonicsolution),用吸管打匀使细胞悬浮于低渗液中,37℃水浴箱静止25-30分钟。6、预固定低渗后,加新配的固定剂(甲醇:冰醋酸,3:1)1毫升,打7、离心8、固定pm离心10分钟,弃上清以1000加入5m新配置的固定液,悬浮细胞,室温固定10-15分钟9、离心1000pm离心10分钟,弃上清10、再固定,加入5mL固定液(甲醇:冰醋酸=1:3),室温固定10-15分钟、再离心1000转/分离心10分钟,弃去上清液。12、再固定加入固定液(甲醇:冰醋酸1:1)5mL,打匀,固定10-15分钟。13、制片固定后,1000转专分离心留下0.2m沉淀物,吸取细胞悬液滴在已用冰水浸泡的洁净载玻片上,立即用嘴吹散,在洒精灯焰上通过几次,使细胞平铺于载玻片上,空气干燥(airdrying)。14、染色(Giemsastaining)Giemsa染液染色8分钟,玻片用自来水冲洗,晾干。15、镜检(microscopICeXamination)_m,CelsedimentCContriJarforstainiAnalysis}antorakaryotypeKaryotyp曰Metaphaseunderthemicroscope四、试剂和药品1、培养液的配制RPMI1640培养基(含L-谷氨酰胺和碳酸氢钠)80%小牛血清(56℃水浴灭活30分钟)20%植物血凝素PHA(主要成分是粘多糖和蛋白质4%青霉素终浓度100单位/毫升链霉素终浓度100单位/毫升用3.5%Nahco调pH到7.