实验一水质的微生物检测

水微生物检测南华大学预防医学与放射卫生实验教学中心教学对象：高等医学院校卫生检验专业学生实验课时：8学时课程类型：专业实验课课程要求：必修每组人数：2人实验目的与要求掌握水样采集规则及注意事项。熟悉常用水卫生细菌学指标。熟悉菌落总数、大肠菌群的测定方法及检测意义。学会对所检测的水样作综合分析。水微生物检测的意义水体的微生物污染问题日趋严重。在各种水体，特别是污染水体中存在有大量的有机物质，适于各种微生物的生长。水体中微生物污染的来源：土壤，以及人类、动物的排泄物污染。水体中少数致病微生物（主要来自人或动物的粪便污染）可导致某些肠道传染病传播。水微生物检测可用于评价水质情况，预报水质的污染趋势，以保证水质的卫生安全。在实际工作中，对水质卫生质量的评价和控制，是无法对水体中各种可能存在的致病微生物一一进行检测。一般选择有代表性的一种或一类微生物作为指示菌，通过对指示菌的检测，来了解水体是否受到过的微生物污染，是否有肠道病原微生物存在的可能。水微生物的检测指标菌落总数(aerobicbacterialcount)是指1ml水样在营养琼脂培养基中，于37℃经24h培养后，所生长的细菌菌落的总数。检测意义：作为一般性污染的指标，即评价被检样品的微生物污染程度和安全性。水样菌落总数越多，说明水被微生物污染程度越严重，病原微生物存在的可能性越大，但不能说明污染的来源。水质微生物的检测指标总大肠菌群(coliformbacteria)是指一群需氧及兼性厌氧的，37℃生长时能使乳糖发酵，在24h内产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。检测意义：作为粪便污染的指标。水样总大肠菌群数的含量，表明水被粪便污染的程度，而且间接地表明有肠道致病菌存在的可能。实验内容水样采集；菌落总数的测定；总大肠菌群的测定。一、水样采集采样原则所采集的样品具有代表性。采样容器：选择硼硅玻璃瓶和聚乙烯塑料瓶。不能是新的污染源；不吸收或吸附某些待测组分；不与待测组分发生反应。保证从采样到分析期间，样品各组分的浓度不发生改变。必须按一般无菌操作的基本要求采集，并保证在运送、贮存过程中不受污染。自来水水样：先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再开放水龙头使水流5min（经常用水的水龙头放水1～3min）后，采集水样于无菌锥形瓶，约占瓶容量80%，以便摇匀水样。水源水水样：选有代表性的地点及可疑地方，一般距水面下10～15cm采样。采样后，将瓶塞盖好，再从水中取出。注意事项严格无菌操作。做好标记：采得水样后应立即记录水样名称、地点、时间等项目。从速送检。水样从采集到检验不应超过2h，在0～4℃下保存不应超过24h。二、菌落总数的测定—平板菌落计数法（一）生活饮用水[器材与试剂]

无菌1ml吸管1支/组，无菌平皿3个/组，营养琼脂。[方法]水样摇匀20~25次，使细菌分散。倾注培养：无菌吸取1ml水样分别置于2个空平皿，另一个作空白对照。再倾注15ml琼脂（约45℃）于平皿中旋转，混匀待琼脂凝固后倒置37℃24h。菌落计数：用肉眼或放大镜检查，计数平皿内菌落数目。[结果分析与报告]计算平均菌落数：报告方式：菌落总数(cfu/ml)。cfu：colonyformingunits当检样的菌落数为l~100时，按实有数报告；大于100时，采用二位有效数字报告。国家标准（GB5749-2006）规定生活饮用水菌落总数每毫升不得超过100个。（二）水源水[器材与试剂]

无菌1ml吸管6支/组，无菌10ml吸管1支/组。无菌平皿9个/组，营养琼脂。90ml灭菌盐水1瓶（内置适量玻璃珠），9ml灭菌盐水管3支。[方法]

稀释水样：无菌吸10ml混匀水样注入90ml灭菌水瓶中,混匀成1:10水样。取1:10水样1ml注入9ml灭菌试管中混匀成1:100水样。同法稀释成1:1000,1:10000水样。[方法]

倾注培养：用1ml无菌吸管吸取2~3个适当浓度的稀释液1ml,分别注入无菌平皿中，每个稀释度应同时做2个平皿，另取一平皿作空白对照。再做倾注培养(方法同饮用水)。菌落计数：方法同饮用水。菌落总数测定[结果分析与报告]计算不同稀释度的平均菌落数：稀释度的选择和菌落总数报告方式：首先选择平均菌落在30～300之间者进行计算。计算方法和报告方式如表1所示。表1稀释度选择及菌落总数报告方式例次不同稀释度的平均菌落数两稀释度菌落总数之比

菌落总数(cfu／m1)

报告方式(cfu／m1)10-110-210-312345678136527602890150多不可计27多不可计01642952713046501l305020466085135120—1.62.22————164003775027100150051300027030500<1×1016000或1.6×10438000或3.8×10427000或2.7×1041500或1.5×103510000或5.1×105270或2.7×10231000或3.1×104<10由表2可判定水质被污染的程度。表2一般水源水中菌落总数与水清洁程度的关系

水的类别最清洁水清洁水不太清洁水不清洁水极不清洁水菌落总数

cfu／m110~100100~10001000~1000010000~100000＞100000[注意事项]菌落总数测定中，应选择合适的稀释度进行。（生活饮用水，国家标准规定每毫升不得超过100个，因此可以直接吸取1毫升到平板进行培养）各稀释管、相应平皿做好标记。包括：水样名称、稀释度、时间、小组。严格无菌操作。进行水样稀释时，每一稀释度均需更换吸管。倾注时，要注意营养琼脂的温度。倾入琼脂后要混匀，待琼脂凝固后倒置培养。三、总大肠菌群的测定

—多管发酵法分为三步：初发酵试验平板分离复发酵证实试验初发酵试验：采用乳糖蛋白胨培养液37℃培养24h，观察产酸产气情况。平板分离：对阳性管培养物，接种于品红亚硫酸钠培养基或伊红美蓝培养基，观察菌落特征，并进行革兰氏染色和镜检。复发酵证实试验：对典型和可疑菌落，接种于乳糖蛋白胨培养液，进行复发酵证实试验，并根据标准所附检数表报告结果。产气初发酵、复发酵试验结果大肠菌群EMB上菌落特征大肠菌群革兰染色形态（一）生活饮用水[器材与试剂]2瓶50ml三倍浓缩的乳糖蛋白胨培养液（内有导管）,10支5ml三倍浓缩的乳糖蛋白胨培养液（内有导管）,10ml吸管1支,100ml量筒1支。EMB，革兰染液等。[方法]

初步发酵试验：接种水样总量为300ml（100ml2份，10ml10份，12支发酵管）。37℃培养24h。平板分离：将产酸产气及只产酸不产气(发酵乳糖)管接种EMB,37℃培养24h，取典型菌落作革兰氏染色镜检。复发酵试验：革兰氏染色镜检为革兰阴性无芽胞杆菌，取该菌接种于普通浓度乳糖蛋白胨(每管接1~3个菌落),37℃培养24h，有产酸产气者即证明有大肠杆菌的存在。

产酸产气报告为大肠菌群阳性[结果分析与报告]根据证实有大肠菌群存在的阳性管（瓶）数，查接种水样总量为300ml检数表（表3）。报告每升水样中的大肠菌群数（MPN值，MostProbableNumber，最大可能数法）。国家标准（GB5749-2006）规定生活饮用水大肠菌数每升不得超过3个。表3大肠菌群数检数表

接种水样总量300ml（100ml2份，10ml10份）10ml水量的阳性管数100ml水量的阳性管数012每升水样中大肠菌群数每升水样中大肠菌群数每升水样中大肠菌群数0l2345678910＜33711141822273136404813182430364351606911182738527092120161230＞230（二）水源水[器材与试剂]1ml吸管3支/组，10ml吸管1支/组，10ml普通发酵管（内有导管）3支/组，5ml三倍发酵管（内有导管）1支/组。EMB，革兰染液等。[方法]稀释水样：水样做1:10及1:100稀释。方法同菌落总数测定。初发酵试验：接种水样总量11.11ml，4支发酵管。取10ml原水样注入5ml三倍乳糖发酵管（内有导管）；取1ml原水样、1ml1:10及1:100稀释水样分别注入10ml普通乳糖发酵管（内有导管），37℃培养24h。平板分离与复发酵试验：同生活饮用水。[结果分析与报告]根据证实有大肠菌群存在的阳性管（瓶）数，查接种水样总量为11.11ml检数表（表4），报告每升水样中的大肠菌群数。表4大肠菌群数检数表

接种水样总量11.11ml（10ml、1ml、0.1ml、0.01ml各1份）接种水样总量(ml)每升水样中大肠菌群数1010.10.01－－－－－－－＋－－－＋－＋＋－－＋＋－＋－－－－＋＋－－－＋＋－＋＋－－－＋＋－＋地＋－＜９０９０９０９５１８０１９０２２０２３０２８０９２０９４０[注意事项]总大肠菌群的测定方法，由于饮用水和水源水可能的污染程度不同，因些采用不同的接种量，检数表也不相同。当接种量超过1毫升时，一般采用多倍浓度培养液。如配制3倍浓缩乳糖蛋白胨培养液50mL，加入100mL水样后，总体积为150mL，培养液恢复到正常浓度。做好标记。严格无菌操作。每一稀释度均需更换吸管。实验安排当日：水样采集、倾注培养、初发酵试验。第二日：菌落计数及结果报告、平板分离。第三日：涂片，革兰氏染色，镜检、复发酵试验。第四日：报告大肠菌群数。实验报告，并对所检测的水样进行综合分析。谢谢观看/欢迎下载BYFAITHIMEANAVISIONOFGOODONECHERISHESANDTHEENTHUSIASMTHATPUSHESONETOSEEKITSFULFILLMENTREGARDLESSOFOBSTACLES.BYFAITHIBYFAITH安全阀基本知识如果压力容器(设备/管线等)压力超过设计压力…1.尽可能避免超压现象堵塞(BLOCKED)火灾(FIRE)热泄放(THERMALRELIEF)如何避免事故的发生?2.使用安全泄压设施爆破片安全阀如何避免事故的发生?01安全阀的作用就是过压保护!一切有过压可能的设施都需要安全阀的保护!这里的压力可以在200KG以上,也可以在1KG以下!设定压力(setpressure)安全阀起跳压力背压(backpressure)安全阀出口压力超压(overpressure)表示安全阀开启后至全开期间入口积聚的压力.几个压力概念弹簧式先导式重力板式先导+重力板典型应用电站锅炉典型应用长输管线典型应用罐区安全阀的主要类型02不同类型安全阀的优缺点结构简单,可靠性高适用范围广价格经济对介质不过分挑剔弹簧式安全阀的优点预漏--由于阀座密封力随介质压力的升高而降低,所以会有预漏现象--在未达到安全阀设定点前,就有少量介质泄出.100%SEATINGFORCE75502505075100%SETPRESSURE弹簧式安全阀的缺点过大的入口压力降会造成阀门的频跳,缩短阀门使用寿命.ChatterDiscGuideDiscHolderNozzle弹簧式安全阀的缺点弹簧式安全阀的缺点=10090807060500102030405010%OVERPRESSURE%BUILT-UPBACKPRESSURE%RATEDCAPACITY普通产品平衡背压能力差.在普通产品基础上加装波纹管,使其平衡背压的能力有所增强.能够使阀芯内件与高温/腐蚀性介质相隔离.平衡波纹管弹簧式安全阀的优点优异的阀座密封性能,阀座密封力随介质操作压力的升高而升高,可使系统在较高运行压力下高效能地工作.ResilientSeatP1P1P2先导式安全阀的优点平衡背压能力优秀有突开型/调节型两种动作特性可远传取压先导式安全阀的优点对介质比较挑剃,不适用于较脏/较粘稠的介质,此类介质会堵塞引压管及导阀内腔.成本较高.先导式安全阀的缺点重力板式产品的优点目前低压储罐呼吸阀/紧急泄放阀的主力产品.结构简单.价格经济.重力板式产品的缺点不可现场调节设定值.阀座密封性差,并有较严重的预漏.受背压影响大.需要很高的超压以达到全开.不适用于深冷/粘稠工况.几个常用规范ASMEsectionI-动力锅炉(FiredVessel)ASMEsectionVIII-非受火容器(UnfiredVessel)API2000-低压安全阀设计(LowpressurePRV)API520-火灾工况计算与选型(FireSizing)API526-阀门尺寸(ValveDimension)API527-阀座密封(SeatTightness)介质状态(气/液/气液双相).气态介质的分子量&Cp/Cv值.液态介质的比重/黏度.安全阀泄放量要求.设定压力.背压.泄放温度安全阀不以连接尺寸作为选型报价依据!如何提供高质量的询价?弹簧安全阀的结构弹簧安全阀起跳曲线弹簧安全阀结构弹簧安全阀结构导压管活塞密封活塞导向不平衡移动副(活塞)导管导阀弹性阀座P1P1P2先导式安全阀结构先导式安全阀的工作原理频跳安全阀的频跳是一种阀门高频反复开启关闭的现象。安全阀频跳时，一般来说密封面只打开其全启高度的几分只一或十几分之一，然后迅速回座并再次起跳。频跳时，阀瓣和喷嘴的密封面不断高频撞击会造成密封面的严重损伤。如果频跳现象进一步加剧还有可能造成阀体内部其他部分甚至系统的损伤。安全阀工作不正常的因素频跳后果1、导向平面由于反复高频磨擦造成表面划伤或局部材料疲劳实效。2、密封面由于高频碰撞造成损伤。3、由于高频振颤造成弹簧实效。4、由频跳所带来的阀门及管道振颤可能会破坏焊接材料和系统上其他设备。5、由于安全阀在频跳时无法达到需要的排放量，系统压力有可能继续升压并超过最大允许工作压力。安全阀工作不正常的因素A、系统压力在通过阀门与系统之间的连接管时压力下降超过3%。当阀门处于关闭状态时，阀门入口处的压力是相对稳定的。阀门入口压力与系统压力相同。当系统压力达到安全阀的起跳压力时，阀门迅速打开并开始泄压。但是由于阀门与系统之间的连接管设计不当，造成连接管内局部压力下降过快超过3%，是阀门入口处压力迅速下降到回座压力而导致阀门关闭。因此安全阀开启后没有达到完全排放，系统压力仍然很高，所以阀门会再次起跳并重复上述过程，既发生频跳。导致频跳的原因导致接管压降高于3%的原因1、阀门与系统间的连接管内径小于阀门入口管内径。2、存在严重的涡流现象。3、连接管过长而且没有作相应的补偿（使用内径较大的管道）。4、连接管过于复杂（拐弯过多甚至在该管上开口用作它途。在一般情况下安全阀入口处不允许安装其他阀门。）导致频跳的原因B、阀门的调节环位置设置不当。安全阀拥有喷嘴环和导向环。这两个环的位置直接影响安全阀的起跳和回座过程。如果喷嘴环的位置过低或导向环的位置过高，则阀门起跳后介质的作用力无法在阀瓣座和调节环所构成的空间内产生足够的托举力使阀门保持排放状态，从而导致阀门迅速回座。但是系统压力仍然保持较高水平，因此回座后阀门会很快再次起跳。导致频跳的原因C、安全阀的额定排量远远大于所需排量。

由于所选的安全阀的喉径面积远远大于所需，安全阀排放时过大的排量导致压力容