植物主要组织培养技术4学时

第三章植物主要组织培养技术植物细胞工程(plantcellengineering)：就是应用植物细胞生物学的理论、方法和技术，按照设计蓝图，有方案地、大规模地培育植物细胞或组织以获得植物及其产品，或改变植物细胞的遗传组成以产生新的植物或品种，为人类生活提供更新、更好的植物产品的工程学科。细胞工程—植物细胞工程植物组织培养(planttissueculture)：利用植物离体器官、组织或细胞(包括原生质体)，在适宜的人工培养基上和无菌条件下进行培养，使其生长、增殖、进而发育形成小植株的方法。狭义的组织培养往往仅指愈伤组织培养，而广义的组织培养那么是指各种类型的植物无菌培养技术。现在，一般的组织培养概念多是指广义概念上的组织培养技术。它包括胚胎培养、器官培养、组织培养(愈伤组织培养)、细胞培养、原生质体培养。细胞工程—植物细胞工程第三章植物主要组织培养技术植物组织培养的优点周期短，便于人工控制培养条件。繁殖速度快，经济效益高占用空间小，不受地区、季节限制繁殖珍稀、濒危苗木和突变体，是优良品种培育的有效途径利于保持原来品种的特性。细胞工程—植物细胞工程第三章植物主要组织培养技术植物组织培养的应用快速繁殖：例如一株兰花一年可以繁殖到400万株。种苗脱毒：可以有效地培育出大量的无病毒种苗。已经取得成功的有马铃薯、草莓、香蕉等。突变育种：可以直接诱变筛选出具抗病、抗盐以及高赖氨酸、高蛋白等优良性状的品种。基因工程育种：基因转导后通过组织培养途径实现植株再生。远缘杂交：利用离体受精技术和组织培养结合可以实现远缘杂交，培育一些罕见的新物种。例如苹果与梨的杂交种。细胞工程—植物细胞工程第三章植物主要组织培养技术外植体(explant)：取自植物体用于组织培养的活的植物细胞或组织切段、或用于继代培养的组织培养物均称之为外植体。继代培养(subculture)：对来自于外植体所增殖的培养物(包括细胞、组织或其切段)通过更换新鲜培养基及不断切割或别离，进行连续多代的培养，就称为继代培养。细胞工程—植物细胞工程第三章植物主要组织培养技术愈伤组织(callus)：愈伤组织原是指植物在受伤以后于伤口外表形成的一团薄壁细胞。在组织培养中，那么是指外植体在人工培养基上诱导产生的无序生长的薄壁细胞团。组织培养中所形成的愈伤组织与受伤时形成的愈伤组织并不完全相同，主要区别在于，在组织培养条件下，愈伤组织的形成是在外植体摆脱了母体植株的控制前提下形成的，其形成需要人工培养基为外植体提供必要的营养及生长调节物质。细胞工程—植物细胞工程第三章植物主要组织培养技术植物细胞工程中心内容是植物细胞和组织的离体培养。从技术上说它是一种从单细胞到植株的无性繁殖技术。从遗传的角度来讲它具有双重性，一是遗传的保守性，二是遗传的变异性。利用其保守性我们可以进行植物的快速繁殖，建立植物种质资源库以及生产有用化合物；利用其变异性我们可以进行体细胞诱变、体细胞杂交以及基因工程等。细胞工程—植物细胞工程第三章植物主要组织培养技术第一节植物脱毒与快繁技术第二节花药与花粉培养第三节植物胚胎培养第四节人工种子细胞工程—植物细胞工程第三章植物主要组织培养技术3.1植物脱毒与快繁技术植物脱毒(viruselimination)：利用植物组织培养技术，脱除植物细胞中侵染的病毒，生产健康的繁殖材料。离体的快速繁殖：利用细胞的再生特性，在组织培养条件下加速繁殖材料的个体生产，提高繁殖系数。细胞工程—植物细胞工程１意义２植物脱毒３离体无性繁殖细胞工程—植物细胞工程3.1植物脱毒与快繁技术能够有效地保持优良品种的特性任何一个优良品种均需要有一个忠实地保存其遗传性状的繁殖方法。离体无性繁殖由于繁殖体系是建立在体细胞系根底上，繁殖过程在人工控制的环境条件下，所以既不会造成性状别离，也不会产生退化，同时还防止了病虫害的侵染，从而可以很好的保持品种的优良特性。是异交作物和无性繁殖品种繁育的理想途径。细胞工程—植物细胞工程3.1植物脱毒与快繁技术快速繁殖新品种，使优良品种迅速应用离体繁殖因为周期短(1～3个月)，不受季节限制，繁殖系数高(几十～几百倍)，因此其繁殖速度是任何其它方法所不能比的，所以离体繁殖又称之为快繁(rapidclonalpropagation)。细胞工程—植物细胞工程3.1植物脱毒与快繁技术生产无病毒种苗，防止品种退化目前受病毒危害严重影响生产的有：大田作物：马铃薯、甘薯、甘蔗。蔬菜：白菜、大蒜、葱、番茄、萝卜。果树：柑橘、苹果、草莓、香蕉。花卉：香石竹、各种菊花、天竹葵、紫罗兰等。

细胞工程—植物细胞工程3.1植物脱毒与快繁技术节约耕地，提高农产品的商品率块根、块茎、鳞茎为繁殖器官的作物，每年产品用留作种的比例

。大蒜：留种量占产量的五到八分之一；马铃薯：留种量占产量的十分之一；贝母：留种量占产量的三分之一。细胞工程—植物细胞工程3.1植物脱毒与快繁技术便于运输常规的营养繁殖器官多是块根、块茎、鳞茎、枝条等，体积大、含水量高，包装、运输十分不便，特别是远距离调运损失很大。而离体繁殖的种苗体积小，一般自带容器，很易携带。运输十分方便。以马铃薯为例来讲，按一亩地4000株计算，常规薯4000个重200kg(每个50g)，假设用试管薯4000个那么只有1kg左右(每个100-200mg)。细胞工程—植物细胞工程3.1植物脱毒与快繁技术植物脱毒根本原理技术规程影响脱毒效果的因素细胞工程—植物细胞工程3.1植物脱毒与快繁技术根本原理：茎尖脱毒是控制植物病毒的有效途径

：药物防治病毒病效率低，抗病毒育种步履艰难，组织培养的高效隔离防治了病毒的再侵染。

脱毒—保持种性—快繁已是一个系统技术，在许多无性繁殖作物的种苗生产上均形成了自己的体系。细胞工程—植物细胞工程3.1植物脱毒与快繁技术病毒在植物体内的分布具有不均匀性1934年，White通过观察烟草根系，首先发现病毒在根系内的不同区域分布是不均匀的，越靠根尖区病毒含量越低，在根尖分生组织区(生长点)的顶端不含病毒。1949年，Limasset和Cornuet根据White的发现提出，在芽的分生组织区也应存在与根尖分生组织同样的情况。1952年，Morel和Martin首先利用茎尖分生组织培养获得了马铃薯无病毒苗，同时建立了茎尖脱毒的组织培养技术体系。细胞工程—植物细胞工程3.1植物脱毒与快繁技术能量竞争：病毒核酸和植物细胞分裂时DNA合成均需要消耗大量的能量，而分生组织细胞本身很活泼，其DNA合成是自我提供能量自我复制，而病毒核酸的合成要靠植物提供能量来自我复制，因而就得不到足够的能量，从而就抑制了病毒核酸的复制。传导抑制：病毒在植物体内的传播主要是通过维管束实现的，但在分生组织中，维管组织还不健全，从而抑制了病毒向分生组织的传导。细胞工程—植物细胞工程3.1植物脱毒与快繁技术激素抑制：在分生组织中，生长素和细胞分裂素水平均很高，因而阻滞了病毒的侵入或者抑制病毒的合成。或者高水平的激素浓度抑制了病毒活性。酶缺乏：1969年，Stace-Smith提出，可能病毒的合成需要酶的参与，但酶系统在分生组织中缺乏或还没建立，因而病毒无法在分生组织中复制。抑制因子：1976年，Martin-Tanguy等提出了抑制因子假说，认为在分生组织中存在有某种抑制因子。细胞工程—植物细胞工程3.1植物脱毒与快繁技术技术规程1被脱毒植物携带病毒的诊断2母体植株的选择和预处理3茎尖分生组织培养再生植株4脱毒效果检测5脱毒苗的保存与繁殖细胞工程—植物细胞工程3.1植物脱毒与快繁技术被脱毒植物携带病毒的诊断携带何种病毒？感染程度如何？细胞工程—植物细胞工程3.1植物脱毒与快繁技术母体植株的选择和预处理母体材料指提供脱毒用外植物体的植株或某一器官。母体材料的选择：块根、块茎、茎芽等欲脱毒材料的品种典型性；外植体健康程度选择。

细胞工程—植物细胞工程3.1植物脱毒与快繁技术应选择繁殖器官具有品种典型性的块根或块茎作为根底脱毒材料，其体积为中等大小，应发芽正常，无纤细芽或丛芽在生长旺盛季节选择生长正常的顶芽作为脱毒的外植体材料外植体预处理：无损伤脱毒区热致死区生长温度高温生长区热处理区细胞工程—植物细胞工程3.1植物脱毒与快繁技术香石竹在38～40℃下经两个月处理可除去全部病毒。菊花在35～38℃的条件下处理60天可使病毒失活。马铃薯在37℃条件下处理10～20天能除去卷叶病毒。柑橘－速衰病毒/黄化病毒40℃/30℃处理7～12周。鳞皮病毒需要在40℃/30℃条件下处理8周。青果病毒在50℃条件下处理30～40分钟。细胞工程—植物细胞工程3.1植物脱毒与快繁技术

茎尖分生组织培养再生植株根本过程：外植体消毒－茎尖剥离－茎尖培养茎尖剥离是关键。首先用于茎尖剥离的外植体必须清洁，剥离任何可能去掉的叶片，然后浸入70%的酒精溶液中除去可能附着的空气，再进行外植体灭菌。细胞工程—植物细胞工程3.1植物脱毒与快繁技术茎尖分生组织培养再生植株利用茎尖分生组织作为外植体脱毒效果好，但不带叶原基的茎尖分生组织成苗困难，因此应确定适宜的分生组织大小。分生组织培养形成植株后，经过生根就可移载。细胞工程—植物细胞工程3.1植物脱毒与快繁技术

脱毒效果检测指示植物鉴定(testplants)：所谓指示植物是指具有能够区分某种病毒的专化性病症的寄主植物。将待测汁液接种到指示植物上，如果被测植株带毒，那么指示植物上出现特定病症。常用的指示植物有千日红、曼陀罗和心叶烟等。

细胞工程—植物细胞工程3.1植物脱毒与快繁技术脱毒效果检测--血清鉴定(serologictest)试管沉淀反响：在抗原抗体最适比例条件下，观察由于沉淀产生。注意：叶绿体的自发凝聚；抗原过量会抑制沉淀形成。免疫双扩散：原理：抗原抗体在一定pH和离子存在的琼脂糖凝胶中相向扩散，一定时间后，两者相遇而形成不明显的抗原抗体聚合物并继续扩散，当扩散至两者的适当比例时便形成大的抗原抗体复合物而出现明显沉淀，形成垂直于扩散方向的免疫沉淀线即等价线。在沉淀线两侧由于不是抗原过剩，就是抗体过剩，而不出等价线。沉淀线形成的位置与抗原抗体浓度有关，抗原浓度越大。形成的沉淀线距离抗原孔越远。步骤：铺板、打孔〔中央一个，四周假设干个成梅花图形〕、封底〔在酒精灯上烘烤反面，使琼脂与玻璃板贴紧〕、加样。细胞工程—植物细胞工程3.1植物脱毒与快繁技术脱毒效果检测--酶联免疫吸附测定(ELISA)原理：基于抗原抗体反响的特异性和等比例性，以96孔的聚苯乙烯塑料微孔板〔又称酶标板〕为载体，在适当的技术条件下使抗原或抗体包被〔吸附〕在酶标板微孔的内壁上成为所谓的包被〔固相〕抗体或抗原，没有被吸附〔游离〕的抗原或抗体通过洗涤除去，然后直接参加酶标记抗体或抗原〔或先参加适当的抗体或抗原与包被抗原或抗体反响后，再参加相应的酶标记抗体或抗原〕，形成酶标记的抗原—抗体复合物固定在微孔内，没有吸附的酶标记物洗涤去除，参加底物溶液于微孔中，复合物上的酶催化底物使其水解、氧化或复原成为有色的底物。在一定的条件下，复合物上酶的量〔也反映了固定化的抗原抗体复合物的量〕和酶产物呈现的色泽成正比，因此可以用分光光度计进行测定，从而计算出参与反响的抗原和抗体的量。细胞工程—植物细胞工程3.1植物脱毒与快繁技术脱毒效果检测ELISA分为直接法、间接法和夹心法等几种。直接法：直接法是指酶标抗原或抗体直接与包被在酶标板上的抗体或抗原结合形成酶标抗原—抗体复合物，参加酶反响底物，测定产物的吸光值，计算出包被在酶标上的抗体或抗原的量。间接法：是将酶标记在二抗上，当抗体〔一抗〕和包被在酶标板的抗原结合形成复合后，再以酶标二抗和复合物结合，通过测定酶反响产物的颜色可以〔间接〕反响一抗和抗原的结合情况，进而计算出抗原或抗体的量。细胞工程—植物细胞工程3.1植物脱毒与快繁技术脱毒效果检测ELISA夹心法：是先将未标记的抗体包被在酶标板上，用于捕获抗原，在用酶标的抗体与抗原反响形成抗体-抗原-酶标抗体复合物；也可以象间接法一样应用酶标二抗和抗体-抗原-抗体复合物结合，形成抗体-抗原-抗体-酶标二抗复合物，前者称为直接夹心法，后者称为间接夹心法。细胞工程—植物细胞工程3.1植物脱毒与快繁技术细胞工程—植物细胞工程3.1植物脱毒与快繁技术脱毒苗的保存与繁殖脱毒苗的离体保存与繁殖〔试管苗〕建立脱毒种苗生产繁殖网络体系木本植物建立隔离的脱毒苗母本园

细胞工程—植物细胞工程3.1植物脱毒与快繁技术脱毒母体材料选择材料预处理以钝化病毒茎尖分生组织培养茎尖分生组织苗病毒检测脱毒苗组织培养扩繁脱毒苗保存进入种苗繁殖体系隔离扩繁大田生产马铃薯脱毒种薯生产程序细胞工程—植物细胞工程3.1植物脱毒与快繁技术影响脱毒效果的因素母体材料病毒侵染的程度：单一病毒感染的植株脱毒较容易，而复合侵染的植株脱毒困难；外植体的生理状态：顶芽的脱毒效果比侧芽好，生长旺盛季节的芽为外植体脱毒比休眠芽或快进入休眠的芽脱毒效果好；起始培养的茎尖大小：一般取不带叶原基的生长点培养脱毒效果好。细胞工程—植物细胞工程3.1植物脱毒与快繁技术脱毒植株并不具有额外的抗病性，它有可能再度感染病毒,所以要严格控制脱毒种苗的生产环境，并重视更新根底苗。草本植物的根底苗一般１～２年更换一次。木本植物那么需逐步建立健康果园，剔除感染源，适时更换根底苗。茎尖长(mm)叶原基数小植株数脱毒植株数脱毒率（％）0.1215024480.272421842.90.646400茎尖大小对马铃薯脱毒效果的影响细胞工程—植物细胞工程3.1植物脱毒与快繁技术离体无性繁殖(propagationinvitro)离体无性繁殖是在人工控制的无菌条件下，使植物在人工培养基上繁殖的技术。跟常规的繁殖方法相比它是一种微型操作过程，因此，有时就直接称之为微繁(micropropagation)。Morel在1960年首先建立了兰花离体繁殖的方法。目前已有近400种植物的离体繁殖已获得成功，其中许多具有重要经济价值的花卉(如兰花、菊花、石竹)、果树(草莓、无籽西瓜、葡萄)、经济作物(马铃薯、甘蔗)、林木(桉树、杨树)均已在种苗生产上广泛应用，取得了巨大的经济和社会效益。细胞工程—植物细胞工程3.1植物脱毒与快繁技术离体无性繁殖根本技术程序应用范围需要注意的问题细胞工程—植物细胞工程3.1植物脱毒与快繁技术外植体选择外植体培养植株再生与增殖生根培养细胞工程—植物细胞工程3.1植物脱毒与快繁技术离体无性繁殖外植体选择外植体的选择主要应考虑以下问题：繁殖对象的品种典型性。植物在自然条件下的繁殖特点：有的以枝条扦(qian)插繁殖，有的为块根块茎繁殖，有的以芽繁殖，尽可能取自然繁殖器官的适当部位作外植体；外植体的取材部位和大小、生理状态：取靠近植株顶端的幼嫩器官培养较容易，对于块茎、块根等应在这些器官形成的初期取材；大小应适宜。细胞工程—植物细胞工程3.1植物脱毒与快繁技术１腋芽增殖４愈伤组织增殖３体细胞胚增殖２不定芽增殖外植体培养细胞工程—植物细胞工程3.1植物脱毒与快繁技术外植体培养--腋芽增殖培养方法简单，能高度保持遗传稳定性，能长期继代繁殖。这一繁殖方式一般不需要添加外源激素，如果某些植物需要使用激素，一定要严格控制浓度，以防止产生愈伤组织。细胞工程—植物细胞工程3.1植物脱毒与快繁技术在适宜条件下，每一个腋芽均可以长成一个新的枝条或小植株，这是自然条件下扦插繁殖的根底。腋芽伸长或长成芽丛，经过反复的切割即得到大量的芽，再经过生根培养就可到达大量的试管苗。外植体培养--不定芽增殖从现存的芽以外的任何器官、组织上通过器官发生重新形成的芽称之为不定芽。诱导不定芽一般要同时参加外源生长素和细胞分裂素〔浓度应尽可能低〕，细胞分裂素略高于生长素，以免产生过多的愈伤组织。一般经过生根培养才能形成植株。特点：繁殖系数高，遗传稳定性较好。但继代次数有限。细胞工程—植物细胞工程3.1植物脱毒与快繁技术外植体培养--体细胞胚增殖

特点：增长率高，胚的双极性免去生根环节，但胚状体休眠的诱导和解除还难以把握，其成苗率仍不高。目前除一些特殊用途外(人工种子)，这一途径还没有用于快繁技术。在诱导胚状体形成时，一般使用胚、分生组织、或生殖器官作为外植体。培养基中含有丰富的复原态氮和适宜的生长素〔2,4-D〕浓度。胚状体形成后要及时转移到低浓度或不含生长素的培养基中让胚状体成熟。细胞工程—植物细胞工程3.1植物脱毒与快繁技术外植体培养--愈伤组织增殖所有的植物通过组织培养的方法均可以诱导愈伤组织，再进一步分化即可获得小植株。这一途径经历了组织培养技术的所有过程(愈伤组织诱导－愈伤组织增殖－芽分化－生根－完整植株)。它属于真正意义上的组织培养。一切通过其它增殖方式不能成功的植物，均可以通过此途径获得组培苗。特点：成功率高，繁殖系数大，遗传稳定性较差。对品种要求遗传稳定性高的作物一般不采用这一途径快繁。细胞工程—植物细胞工程3.1植物脱毒与快繁技术生根培养

在上述途径所获得的芽，在大多数情况下需要转移到生根培养基进行诱导，并进一步发育为完整的植株。生根培养基一般要求降低矿物营养的浓度，提高生长素浓度，具体应根据植物不同而定。生产用苗的培育

试管苗可直接用于大田生产，但对土壤、水肥、气候要求严格。需要经过一些缓冲过程以后再用于生产。炼苗－假植－定植－生产用苗，提高试管苗对自然环境条件的适应性。细胞工程—植物细胞工程3.1植物脱毒与快繁技术外植体培养--愈伤组织增殖离体繁殖的使用范围

用于加速某些难繁殖或繁殖速度很低的植物，或某些需要加速繁殖的特殊基因型，如名贵花卉、优良资源、果树芽变别离、工程植株等等。

用于自然繁殖极易感染病毒的植物，如马铃薯、甘薯、甘蔗、香蕉、石竹、百合等等。用于有性繁殖变异范围大而自然条件下又不易无性繁殖的植物，如非洲菊、花竹、紫罗兰等。细胞工程—植物细胞工程3.1植物脱毒与快繁技术离体繁殖的有关问题培养物的增殖方式：在离体繁殖中，首先选择茎芽增殖，其次是不定芽，最后是愈伤组织增殖方式。外源生长调节剂对品种典型性的影响：在离体繁殖中，外源生长调节剂容易引起变异，应防止使用，或降低浓度使用。继代次数与变异：继代次数越多，变异概率越大。细胞工程—植物细胞工程3.1植物脱毒与快繁技术１概念及意义２花药培养３花粉及小孢子培养细胞工程—植物细胞工程3.2花药及花粉培养概念及意义花粉培养：将处于一定发育阶段的花粉粒从花药中别离出来，使之成为分散的或游离的状态，通过培养使花粉粒脱分化，进而发育成完整植株的过程。有时花粉培养也称为小孢子培养。从培养方法和技术方面来讲，它属于细胞培养的范畴。花药培养：将发育到一定阶段的花药接种在人工培养基上，使其发育和分化成为植株的过程。其外植体是植物雄性生殖器官的一局部，就培养方法和技术来讲，属于器官培养的范畴。细胞工程—植物细胞工程3.2花药及花粉培养与花药培养相比，花粉培养可以防止花药壁、花丝和药隔等体细胞组织的干扰，因此能更好地调节控制雄核发育的各种因子;花粉数量大，具有单细胞、单倍性和较高同步性等特点，从而可以从较少的花药获得大量的花粉植株;能为研究细胞分化条件、胚胎发生和形态发生机理提供较为理想的实验系统;花粉培养的成功为深入开展花粉原生质体的培养、遗传操作和发育分子生物学等的研究提供了有用的材料和良好的技术根底。细胞工程—植物细胞工程3.2花药及花粉培养

花药培养与小孢子培养的目的一样，是为了获得单倍体。单倍体(haploid)指具有配子体染色体数的孢子体(植物个体)。

一倍体(monoploid)只含有1个染色体组的个体。

diploid植物其haploid即为monoploid

玉米2n=2x=20n=x=10

水稻2n=2x=24n=x=12

柑橘2n=2x=18n=x=9tetraploid植物其haploid为dihaploid

马铃薯2n=4x=48n=2x=24

陆地棉2n=4x=52n=2x=26hexaploid植物其haploid为triploid

普通小麦2n=6x=42n=3x=21细胞工程—植物细胞工程3.2花药及花粉培养概念及意义单倍体植物与它们的二倍体相比较，有三个明显的特点：体细胞染色体数减半；生长发育弱，体形小、各器官明显减小；雌雄配子严重败育，有的甚至不能进入有性世代。细胞工程—植物细胞工程3.2花药及花粉培养单倍体的应用潜力迅速获得纯合型材料，缩短育种年限。获得育种中间材料。与诱变育种相结合可以提高诱变频率。与细胞融合相结合，使这一育种途径更具有实际应用意义。作为遗传工程受体更为有效。用作根底遗传研究的各个领域

。细胞工程—植物细胞工程3.2花药及花粉培养HaploidcelllineMutationinductionandselectionofcellsCellhabridizationGeneticengineeringRegenerationofplantsUtilizationofnewformsinbreedingandcropimprovementUtilizationofhaploidcellline细胞工程—植物细胞工程3.2花药及花粉培养花药培养首先报道通过花药培养获得单倍体植株成功的是印度学者Guha和Maheshwari(1964,1966)。现已有近300种植物花药培养成功。目前，花药培养获得单倍体的技术途径已在禾本科作物、茄科作物、十字花科作物的育种中广泛应用。我国通过花药培养途径曾培育出大面积推广应用的水稻品种“寒花早〞、“中花8号〞等，小麦品种“京花1号〞。同时还获得一大批具有育种价值的单倍体系。细胞工程—植物细胞工程3.2花药及花粉培养外植体选择－外植体(花蕾)预处理—外植体消毒—接种—诱导培养—分化培养细胞工程—植物细胞工程3.2花药及花粉培养花药培养—根本程序１外植体选择２低温预处理5培养7生根和移载3消毒4接种6植株再生外植体选择--供试材料的遗传背景通过花药培养成功获得单倍体植株最多的是茄科植物，其次是十字花科、禾本科、百合科等植物。同一植物的不同类型、不同品种对花药培养的反响也是不同的。烟草花药是较易诱导的材料，但是“朗氏烟草〞那么很难诱导花药植株;水稻中粳稻比籼稻容易诱导细胞工程—植物细胞工程3.2花药及花粉培养花药培养—根本程序外植体选择--供试材料的生理状态在多年生植物中，幼年植株比老龄植株的花药诱导频率高。草本植物生长健壮、且处于生殖生长顶峰期的花药诱导频率高，徒长或营养缺乏的植株花药培养的诱导频率低。细胞工程—植物细胞工程3.2花药及花粉培养花药培养—根本程序外植体选择--花粉的发育时期四分体—小孢子—单核花粉—双核花粉最适期小孢子母细胞经减数分裂产生四个一群的单倍体细胞细胞工程—植物细胞工程3.2花药及花粉培养花药培养—根本程序Sunderland(1971)对烟草不同花粉发育时期的培养反响进行了观察：花粉发育时期胚状体诱导频率(％)减数分裂期0单核早期14单核晚期40双核早期55细胞工程—植物细胞工程3.2花药及花粉培养外植体选择--花粉的发育时期花药培养—根本程序烟草花粉在正常的活体内发育期间，单核小孢子在第一次有丝分裂之后,与r-RNA合成有关的基因会关闭约24小时。据研究，这一时期是花粉发育终端分化的临界期。涉及到具体的植物，花药培养的取材时期并不绝对相同，如番茄以减数分裂期的幼嫩花药为好，而云苔属植物的某些材料那么以成熟花粉为好。这可能是由于不同植物的花粉终端分化临界期不同的缘故。花粉发育时期与其相对直观的生长发育特点具有一定相关性。如柑橘在花冠露白时大多数花药处于单核晚期。细胞工程—植物细胞工程3.2花药及花粉培养外植体选择--花粉的发育时期花药培养—根本程序花药预处理大量试验结果说明，花药培养前给予一定的低温处理是十分必要的。烟草、茄子3～5℃72小时水稻10℃10～14天柑橘3℃5～10天马铃薯4℃48小时细胞工程—植物细胞工程3.2花药及花粉培养花药培养—根本程序草莓花药4℃处理培养反应细胞工程—植物细胞工程3.2花药及花粉培养花药预处理花药培养—根本程序花药预处理--低温处理的作用：可以激发花粉母细胞产生两个相等核，而不是一个营养核和一个生殖核；保持高比例的强生活力花粉，同时延缓体细胞组织的衰老；激发花粉产生原胚；促使细胞同步分裂。

细胞工程—植物细胞工程3.2花药及花粉培养花药培养—根本程序消毒一般先将花蕾或幼穗的外表用70%乙醇浸泡1分钟，然后在饱和漂白粉溶液中浸泡10-15min，也可用15%次氯酸钠溶液浸泡10-15min，或0.1%氯化汞溶液消毒3-5min或用1:100倍的8/4消毒液浸泡15-20min，最后用无菌水冲洗3-5次。如果花蕾包裹严密，内部一般无菌，只要用70%乙醇的棉球对叶鞘或花蕾进行外表擦拭即可。细胞工程—植物细胞工程3.2花药及花粉培养花药培养—根本程序接种将消毒过的材料置于超净工作台上，无菌剥取花药进行接种。应防止花药受到伤害，否那么会刺激花药壁形成愈伤组织。如果是花药较大的组织，可用解剖刀或镊子剥开花蕾，用镊子夹住花丝，取出花药。如果是花器很小的植物，可借助解剖镜夹取花药，或只把花被去掉，将其余局部接种到培养基上。接种时尽量减少花药在空气中的暴露时间，将花药水平地放在培养基上进行培养。花药的接种密度因培养方式而异：假设为固体培养，５０～１００ｍｌ的三角瓶一般每瓶接种１０～２０个花药，９ｃｍ的平皿一般接种２０～４０个花药；假设为液体培养，一般１０ｍｌ液体培养基中接种５０个左右的花药。细胞工程—植物细胞工程3.2花药及花粉培养花药培养—根本程序培养培养基培养条件细胞工程—植物细胞工程3.2花药及花粉培养花药培养—根本程序培养基花药培养常用的根本培养基：MS〔Murashigc&Skoog，1962〕；Nitsch(Nitsch，1969)；N6(朱至清，1974)；B5(Gamborgetal.，1976)。附加成分：蔗糖,激素。细胞工程—植物细胞工程3.2花药及花粉培养花药培养—根本程序蔗糖在花药诱导培养阶段的功能主要是：提供C源；维持适宜的渗透压；抑制花药壁的分裂而促进花粉细胞分裂。番茄花药培养对蔗糖浓度的诱导反响蔗糖浓度〔％〕2346101317诱导频率〔％〕510121825458细胞工程—植物细胞工程3.2花药及花粉培养培养基花药培养—根本程序蔗糖浓度对草莓花药培养的影响细胞工程—植物细胞工程3.2花药及花粉培养培养基花药培养—根本程序细胞分裂素类：BA—6-benzyladenin(6-苄基嘌呤)KT—kinetin(冲动素,呋喃甲基腺嘌呤)Zeatin(玉米素,异戊烯腺嘌呤)生长素类：NAA—naphthaleneaceticacid(奈乙酸)IAA—indole-3-aceticacid2,4-D—2,4-dichlorophenoxyaceticacid(2,4-二氯苯氧乙酸)细胞工程—植物细胞工程3.2花药及花粉培养培养基--花药培养常用的激素花药培养—根本程序高秀云等对茄子的研究说明：MS＋2,4-D0.5mgl-1＋KT1mgl-1n93.8%2n6.2%MS＋2,4-D2mgl-1＋KT1mgl-1n64,1%2n35.9%高浓度的2,4-D主要诱导花药形成愈伤组织，而不能形成胚状体，同时，高浓度的生长素可能启动了花药壁等二倍体组织细胞分裂，从而抑制了花粉细胞分裂，从而增加了二倍体细胞发育的时机。细胞工程—植物细胞工程3.2花药及花粉培养培养基--花药培养常用的激素花药培养—根本程序温度不同植物对温度的要求不同，如:柑橘在20℃以下，完全不能形成胚状体，且愈伤组织形成亦很少，当将温度提高到21～25℃时便会有胚状体形成，而当温度提高到26℃以上时又完全不能形成胚状体。油菜假设将接种后的花药在30℃条件下培养2～3天，可显著提高花粉胚的形成率，小麦在33℃条件下培养3～5天，可提高成愈率和绿苗率。

光照先弱后强细胞工程—植物细胞工程3.2花药及花粉培养培养条件花药培养—根本程序Sunderland〔1978〕明确提出了药壁因子作用的假设，认为花药对药壁因子的接受能力在不同发育时期也不一样，当花粉接受能力最大的时期与药壁因子作用的最大时期一致时，这种植株的花药最容易被诱导。Sharp等〔1971〕在培养番茄的花药上，加一滤纸，然后把番茄的小孢子悬浮液滴于其中，使花药壁物质透过滤纸与小孢子接触，结果证明药壁对启动小孢子的分裂是起作用的。花药壁的作用在一些移植试验中也得到了证实，如把一个烟草品种开始有丝分裂时期花药中的小孢子移植到另一品种的花药中，结果外来的花粉可形成小植株。组织学研究也证实了花药壁因子在诱导花粉胚中起着关键作用。在烟草中，只有原来贴靠着花药壁的花粉粒才能顺利发育成花粉胚。在天仙子中，也只有处在药室外围紧靠绒毡层的花粉能够发育成花粉胚。细胞工程—植物细胞工程3.2花药及花粉培养关于药壁因子花药培养—根本程序１胚状体２愈伤组织细胞工程—植物细胞工程3.2花药及花粉培养花药植株通过两种途径再生花药培养—根本程序细胞工程—植物细胞工程3.2花药及花粉培养花药植株通过两种途径再生花药培养—根本程序2当离体花药在培养基上培养一段时间后，在对培养发生反响的花药中，花药组织逐渐变褐。培养3-8周后，由于花粉愈伤组织或花粉植株不断生长所造成的压力，药壁破裂，从而形成肉眼可见的愈伤组织或花粉小植株。当愈伤组织长到直径2-3毫米时，转移到分化培养基上继续培养。对于大多数植物而言，在分化培养基上培养10-20天后，即出现芽的分化，然后在芽的基部长出不定根，有时在芽的基部不能分化出不定根。细胞工程—植物细胞工程3.2花药及花粉培养花药植株通过两种途径再生花药培养—根本程序由花药培养再生的小植株，往往茎叶细弱、根细不兴旺，很难直接移载成活。当花粉植株长到3-5cm高时，需要将其转移到生根壮苗培养基上，促进根系的发育和壮苗。将花粉植株有试管移载到土壤中时，先用水轻轻地洗掉沾在根上的琼脂培养基，然后移载到盆中或苗床上。最初的１０～１５ｄ盖上塑料杯或塑料薄膜，以保持一定的湿度。在塑料罩上可打些小孔，用于气体的交换。在保湿数天之后，可除去覆盖物，进行正常的栽培管理。细胞工程—植物细胞工程3.2花药及花粉培养生根和移载花药培养—根本程序花粉及小孢子培养取材时期确实定

四分体—单核早期—单核晚期—双核早期—双核晚期—三核期----------------------------------------------------------小孢子花粉粒----------------------------------花粉培养花药培养细胞工程—植物细胞工程3.2花药及花粉培养花粉或小孢子的别离机械挤压梯度离心法：此方法是将花药消毒后，用镊子或小玻璃棒将花粉从花药中挤压出来，然后用30％蔗糖离心收取悬浮在蔗糖溶液上层的完整花粉粒，再用培养基洗涤几次后用于培养。优点：操作简便。缺点：混杂有体细胞自然散粉法：这一方法可以和预培养结合进行，一般是将消毒后的花药接种在液体培养基中，在一定的温度条件下进行振荡培养，让花粉从花药中自行散落到培养基中，再除去花药壁等，将花粉重新培养在新鲜培养基上。缺点：别离的花粉数量相对较少。磁拌法：将花粉接种到含有液体培养基的三角瓶中，然后放入一根磁棒，置于磁力搅拌器上，低速转至花粉呈透明状。花粉别离较彻底，但对花粉有损伤。细胞工程—植物细胞工程3.2花药及花粉培养花粉及小孢子培养细胞工程—植物细胞工程3.2花药及花粉培养花粉及小孢子培养培养方法花药看护培养Sharp在1972年在番茄花粉培养中创立的。具体做法是：取适宜发育时期的蕾消毒，取出花药。按上述介绍的方法别离小孢子，将小孢子细胞密度调整到0.5ml含10个细胞的密度；在配好的半固体培养基外表横放几个(4个)完整花药，再在花药上平放上灭菌的滤纸片；取0.5ml(10个细胞)花粉悬液接种于滤纸片上，将接种的花粉悬液置于适宜条件下培养(一个月可长出绿色细胞团)。细胞工程—植物细胞工程3.2花药及花粉培养花粉及小孢子培养条件培养条件培养实质上是一种花粉细胞悬浮培养方法。与普通细胞悬浮培养方法的不同之处在于，在液体培养基中参加了一定浓度的条件培养基，条件培养基一般是花药提取液，取50个花药制备10ml条件培养基，添加比例按9:1。培养基配制好后，将花粉按需要密度接种其中，置于恒温摇床上振荡培养。细胞工程—植物细胞工程3.2花药及花粉培养培养方法花粉及小孢子培养双层培养先在培养皿中铺上固体培养基，凝固后在其上接种花粉悬浮液。固体培养基采用与花药培养相同的培养基配方，附加5ml/100ml的花药浸提掖(取50个花药在10ml花药培养基中研磨，然后用80目筛过滤或在1000r/min离心，取滤液参加到培养基中)。固体培养基灭菌后在凝固前参加到灭菌过的6cm培养皿中，每皿铺约2mm厚，等完全凝固后，在其上层接种密度为1×104的花粉悬浮液，接种量以1mm厚的液层为宜。细胞工程—植物细胞工程3.2花药及花粉培养培养方法花粉及小孢子培养微室培养：用滴管取1滴悬浮有花粉的液体培养基，滴在盖玻片上，然后翻过来放在一凹载玻片上，盖玻片四周用石蜡密封。运用这种技术可对单细胞的生长与分化、细胞分裂的全过程等进行活体连续观察。缺点是培养基太少，水分容易蒸发，使培养基中的养分和pH容易发生变化，影响花粉细胞的进一步发育。

细胞工程—植物细胞工程3.2花药及花粉培养培养方法花粉及小孢子培养其它直接培养：不经过预处理或预培养的新鲜花药中直接别离出花粉粒，接种到培养基中进行培养的方法。预培养：先将花药在液体培养基上培养，然后挤出花粉，经过离心洗涤纯化后进行悬浮培养。哺育培养：将在适宜培养基上培养裂开的花药〔诱导频率高，这种花药可以是同一种植物的，也可以是另同一种植物的〕作为一种哺育组织，将欲培养的花粉接种到这种花药里进行哺育培养。细胞工程—植物细胞工程3.2花药及花粉培养培养方法花粉及小孢子培养花粉洗涤花芽单倍体胚形成花药增殖胚的发育愈伤组织分化固体培养液体培养花药平板接种花药花药提取花粉秋水仙素加倍纯合的二倍体植株花粉直接发育为胚花药培养花粉培养花药和花粉培养细胞工程—植物细胞工程3.2花药及花粉培养培养方法花粉及小孢子培养植物的胚发育一般是从受精以后的合子开始的。根据在培养中所取的外植体的部位不同，植物胚胎培养包括胚培养、胚乳培养、胚珠培养、子房培养。细胞工程—植物细胞工程3.3植物胚胎培养1胚培养2胚乳培养细胞工程—植物细胞工程3.3植物胚胎培养植物胚培养(embryocultureofplants)胚培养在实践中的应用意义克服杂交育种中杂种胚的早期夭折，利用幼胚培养解决；

克服珠心胚干扰，提高育种效率：有些植物的种子存在多胚现象，其中只有一个胚是通过受精产生的有性胚，其余的胚多是由珠心细胞发育而成，称为珠心胚；利用幼胚培养解决；理论研究领域的应用。细胞工程—植物细胞工程3.3植物胚胎培养在远缘杂交育种中，经常发生杂种不育现象，其原因是比较复杂的，其中主要有胚的发育不良，提供营养来源的胚乳不能正常发育，以及有时胚与胚乳之间形成的障碍物质阻碍了营养物质的运输等，从而造成胚的早期败育。胚培养的类型植物胚培养指从种子或果实中剥离取出胚进行离体培养的技术。根据胚培养的取材时期不同，可以分为两类：

成熟胚(matureembryo)培养：实质上是胚的离体萌发生长，它的发育与正常的种子萌发没有本质上的不同。要求较高的培养条件和操作技术相对简单

幼胚(immatureembryo)培养：为发育成熟的胚培养，要求较高的培养条件和较复杂的操作技术。细胞工程—植物细胞工程3.3植物胚胎培养植物胚培养(embryocultureofplants)胚培养的类型--幼胚培养

Hanning早在1904年就培养了萝卜和辣根菜的胚，发现离体胚可以充分发育，并且提前萌发形成小苗，这是世界上胚培养最早获得成功的一例。

Laibach在1925～1929年间，通过培养亚麻种间杂种幼胚，成功地获得了种间杂种，首次证实了这种方法在实际应用中的价值。李继侗，1933年在银杏培养中发现了胚乳提取物能够促进银杏离体胚的生长。这一发现为后人使用植物胚乳汁液、幼嫩种子及果实提取液等天然物质促进培养物生长具有启示作用。细胞工程—植物细胞工程3.3植物胚胎培养植物胚培养(embryocultureofplants)大多数幼胚培养成功的实例证明，适宜于幼胚培养的胚发育时期多为球形胚至鱼雷形胚。在原胚阶段，剥离与培养都很困难。以幼胚抢救为目的的胚培养取材，必须在胚退化衰败之前。胚培养在取材时常是连同果实一起取下来，然后对果实或种子进行消毒，由于胚包被在种皮，因而一般不带菌。

细胞工程—植物细胞工程3.3植物胚胎培养幼胚培养的关键技术--取材时期植物胚培养(embryocultureofplants)胚剥离的成功与否是幼胚培养成功与否的关键。幼胚是一种半透明、高粘稠状组织，剥离过程中极易失水干缩，一定要注意保湿，且操作要迅速。有关胚发育的细胞学和生理生化研究说明，胚柄积极参与幼胚的发育，特别是球形期以前的幼胚培养，胚剥离时应带胚柄。对于大多数植物的幼胚剥离来讲，要借助解剖镜。细胞工程—植物细胞工程3.3植物胚胎培养幼胚培养的关键技术—幼胚剥离植物胚培养(embryocultureofplants)剥离出来的幼胚要立即接种到培养基上进行培养。在培养之前必须对所培养的对象在自然发育条件下的特性充分了解，比方胚的休眠问题、是否需要春化作用〔有些花卉需要低温条件，才能促进花芽形成和花器发育，这一过程叫做春化阶段，而使花卉通过春化阶段的这种低温刺激和处理过程那么叫做春化作用〕、胚萌发的温度等。细胞工程—植物细胞工程3.3植物胚胎培养幼胚培养的关键技术—接种培养植物胚培养(embryocultureofplants)燕麦幼胚培养过程细胞工程—植物细胞工程3.3植物胚胎培养幼胚培养的关键技术—接种培养植物胚培养(embryocultureofplants)胚性发育(embryonaldevelopment)：幼胚接种到培养基上以后，仍然按照在活体内的发育方式发育，最后形成成熟胚(有时甚至可能类似种子)，然后再按种子萌发途径出苗形成完整植株，这种途径发育的幼胚一般一个幼胚将来就是一个植株。细胞工程—植物细胞工程3.3植物胚胎培养幼胚离体培养的生长发育方式植物胚培养(embryocultureofplants)早熟萌发(earlymaturesprouting)：幼胚接种后，离体胚不继续胚性生长，而是在培养基上迅速萌发成幼苗，通常称之为早熟萌发。在大多数情况下，一个幼胚萌发成一个植株，但有时会由于细胞分裂产生大量的胚性细胞，以后形成许多胚状体，从而可以形成许多植株，这种现象就是丛生胚现象。细胞工程—植物细胞工程3.3植物胚胎培养幼胚离体培养的生长发育方式植物胚培养(embryocultureofplants)愈伤组织(callus)在许多情况下，幼胚在离体培养中首先发生细胞增殖，形成愈伤组织。一般来讲由胚形成的愈伤组织大多为胚性愈伤组织，这种胚性愈伤组织很容易分化形成植株。

细胞工程—植物细胞工程3.3植物胚胎培养幼胚离体培养的生长发育方式植物胚培养(embryocultureofplants)胚培养中胚的发育方式可以在一定程度上通过培养基和培养条件进行调节。如果试验目的是获得植株，就可以按胚性发育和早熟萌发途径发育。如果是为了获得大量的胚性细胞，就可以促使其增殖为愈伤组织。这种调节通过培养基来实现。细胞工程—植物细胞工程3.3植物胚胎培养幼胚离体培养的生长发育方式植物胚培养(embryocultureofplants)成熟胚对培养条件的要求一般不是很高，甚至在含有根本培养基成分的培养基中即可生长。未成熟幼胚对培养基的要求那么较严格，不仅必须有完全的营养成分，而且对培养基的渗透压、激素水平及附加成分均有一定的要求，其中影响较大的有蔗糖浓度、激素种类、激素配比和附加成分等。细胞工程—植物细胞工程3.3植物胚胎培养幼胚培养条件—培养基植物胚培养(embryocultureofplants)蔗糖浓度：碳源，渗透压。一般浓度为4-12%。幼胚所处的发育阶段越早，所要求的蔗糖浓度越高，如球形胚一般要求蔗糖浓度为８％～１２％，而心形胚至鱼雷形胚那么只要求蔗糖浓度为４％～６％。细胞工程—植物细胞工程3.3植物胚胎培养幼胚培养条件—培养基植物胚培养(embryocultureofplants)外源激素：低浓度的GA3和KT能促进幼胚早熟萌发。IAA和ABA具有抑制幼胚早熟萌发和促进胚正常发育的作用。一般以低浓度为宜，且因不同的植物而有所变化。生长素与其它激素的比例有时也会严重影响胚的发育方式，生长素比例高时，容易形成愈伤组织。细胞工程—植物细胞工程3.3植物胚胎培养幼胚培养条件—培养基植物胚培养(embryocultureofplants)就营养需求而言，胚的发育可以分为两个时期：异养期〔胚的发育要依赖于胚乳和周围的母体组织提供营养〕和自养期〔胚在代谢上已能通过吸收培养基中成分合成自身生长所需物质〕。胚由异养转为自养是一个关键时期，许多胚夭折发生在这一转变时期。一般来讲，球形胚以前为异养阶段，心形胚以后即转为自养阶段，但因作物不同有时会有一定的差异。除了根本培养基外，胚乳提取物对幼胚的培养一般是必不可少的，如椰乳、玉米胚乳提取物和麦芽提取物。细胞工程—植物细胞工程3.3植物胚胎培养植物胚培养(embryocultureofplants)幼胚培养条件—培养基光照：对于幼胚培养来讲，培养初期的黑暗条件是必要的；越是处于发育早期的胚，需要黑暗培养的时间就越长；大多数处于球形期至心形期的幼胚，需要在黑暗条件下培养两周后再给予光照。温度：幼胚培养的温度一般以该植物种子萌发的适宜温度为好。有些植物的幼胚培养在给予适宜温度之前要求一定的低温处理。细胞工程—植物细胞工程3.3植物胚胎培养植物胚培养(embryocultureofplants)幼胚培养条件—环境条件胚乳培养的最早研究始于1933年，Lampe和Mills首例进行了玉米胚乳培养。胚乳培养的研究主要集中在以下一些问题的探讨：胚乳细胞的全能性。在离体培养条件下，胚乳细胞是否与其它体细胞和花粉一样，具有全能性而再生植株。大多数被子植物的胚乳是三倍体，能否通过胚乳培养获得三倍体植株而得到无籽结实；通过胚乳培养技术，探索改进农、林及园艺植物三倍体育种技术的可能性。研究离体培养条件下胚和胚乳的关系。细胞工程—植物细胞工程3.3植物胚胎培养概况被子植物胚乳培养(embryocultureofplants)到目前为止，已有40多种植物的胚乳进行了培养。其中苹果、柚、橙、檀香、枸杞、猕猴桃、玉米、大麦、小黑麦、水稻、马铃薯、梨、核桃等的胚乳培养得到了再生植株。其它有的分化除芽、根、叶等或得到愈伤组织。细胞工程—植物细胞工程3.3植物胚胎培养概况被子植物胚乳培养(embryocultureofplants)植物胚乳分为两大类：被子植物胚乳和裸子植物胚乳。被子植物胚乳是双受精的产物，它由二个极核和一个雄配子融合形成，所以，在染色体倍性上它属于三倍体组织。裸子植物胚乳在受精前就已形成。裸子植物的胚乳为配子体的一局部，由大孢子直接分裂发育而成，因此它属于单倍体组织。

细胞工程—植物细胞工程3.3植物胚胎培养植物胚乳的发育特性被子植物胚乳培养(embryocultureofplants)核型胚乳：胚乳最初发育经过一段游离核阶段，绝大多数被子植物的胚乳属于核型胚乳。特点是初生胚乳核第一次分裂后，继续进行几次或者屡次核分裂而不形成细胞壁，许多核以游离的形式共存于1个细胞质中，以后才开始形成细胞壁二变成真正意义上的胚乳细胞。游离核阶段时间长短因植物不同而异。细胞型胚乳：和核型胚乳不同，细胞型胚乳的发育不经过游离核阶段而按正常的细胞分裂方式进行。胚乳初生核第一次分裂后即形成两个子细胞，以后每次分裂都形成细胞壁。某些合瓣花植物，如烟草、芝麻、以及番茄等是属于次类。

沼生目型胚乳：沼生目型胚乳是核型与细胞型之间的中间型。初生胚乳核第一次分裂为细胞型，以后两个细胞中的核进行游离核分裂，珠孔一端的分裂快，合点一端的分裂慢，以后珠孔端形成胚乳细胞，合点端的胚乳慢慢退化。细胞工程—植物细胞工程3.3植物胚胎培养按发育初期是否形成细胞壁可分为三种类型被子植物胚乳培养(embryocultureofplants)

植物类型形成细胞壁时的游离核数

咖啡属4核

还阳参属8核～16核小麦100核左右报春花、芒果、苹果、柑橘几百核左右细胞工程—植物细胞工程3.3植物胚胎培养几种植物游离核数比较被子植物胚乳培养(embryocultureofplants)胚乳是一种独特的组织，在被子植物中它是双受精的产物，在倍性上属于三倍体。培养胚乳的直接目的是为了获得三倍体。胚乳细胞属于薄壁细胞，虽处于未分化状态，但它与分生组织的细胞有着本质的不同，是一种特化了的薄壁细胞，因此培养难度远比其它器官要大。细胞工程—植物细胞工程3.3植物胚胎培养影响胚乳培养的因素被子植物胚乳培养(embryocultureofplants)游离胚乳核时期和成熟胚乳时期均不适合进行培养，只有当胚乳处于细胞形成期并仍保持旺盛的分生能力时进行培养才有可能成功。几种植物胚乳培养的最正确时间(授粉后天数〕玉米8-12天大麦10～12天黄瓜7～16天小黑麦7～14天细胞工程—植物细胞工程3.3植物胚胎培养影响胚乳培养的因素—胚乳的发育时期被子植物胚乳培养(embryocultureofplants)基因型

培养条件：White培养基和MS培养基附加有机成分〔酵母抽提物、水解酪蛋白〕和激素；诱导阶段，高浓度的生长素；分化培养，高浓度的细胞分裂素；不同植物适宜pH不同。

胚因子：胚对胚乳的影响

胚乳植株的倍性特点：胚乳培养的愈伤组织及再生植株的染色体变化很大〔倍性不稳定和多倍化〕，嵌合体的普遍性；细胞工程—植物细胞工程3.3植物胚胎培养影响胚乳培养的因素被子植物胚乳培养(embryocultureofplants)植物组织培养中，常会出现一些半透明状的畸形试管植物，这类植物体被称为“玻璃苗〞，这种现象称为玻璃化〔Vitrification〕现象，又称过度水化现象。由于玻璃苗的组织结构和生理功能异常，因此分化能力低，难以增殖成芽，也难以生根成苗，移栽大田更难成活，已成为组培的一大问题。组织培养过程中试管苗的玻璃化现象主要是适应性的生理问题，是不能很好适应培养基和培养环境的结果。细胞工程—植物细胞工程3.3植物胚胎培养植物组织培养的问题分析—玻璃化褐变〔Browning〕可分为酶促褐变和非酶促褐变，主要是酶促褐变。酶促褐变是由多酚氧化酶(Polyphenoloxidase，PPO)引起的。当外值体处于机械损伤等逆境时，细胞膜的结构遭到破坏，酚酶催化多酚类化合物，使其发生氧化形成棕褐色的醌类物质和水；醌类物质经过非酶促聚合，形成黑褐色物质(羟醌与黑色素等)，引起褐变的发生。细胞工程—植物细胞工程3.3植物胚胎培养植物组织培养的问题分析—褐变造成污染的病原菌主要包括外部污染菌和内源菌。外部污染菌：主要由外植体带菌或培养基灭菌不彻底以及操作人员操作不慎