分子杂交课件

分子杂交和印迹技术杨梅生物化学教研室

教学要求①核酸杂交的原理，印迹技术的基本原理。②杂交技术，转膜的三种方法：Southern、Northern、Western杂交。菌落杂交、原位杂交、斑点杂交、液相杂交。③探针的概念（广义、狭义），种类，作为探针的条件，探针标记物及优缺点。④探针标记的方法。

分子杂交（molecularhybridization）指不同来源的核酸单链之间或蛋白质亚基之间由于结构互补而发生的非共价键的结合。这种技术可在DNA与DNA、RNA与RNA、DNA与RNA或蛋白质分子（如抗原与抗体）之间进行，形成DNA-DNA、RNA-RNA、RNA-DNA或抗原抗体复合物等不同类型的杂交分子。分子杂交包括：核酸杂交及蛋白杂交等。本章主讲核酸分子杂交。核酸分子杂交的理论基础：DNA变性复性的现象（而复性是以碱基互补序列为基础，只要两条单链之间存在全部或部分碱基互补序列，就可以相互结合形成双链）。第一节核酸分子杂交的基本原理一、DNA变性DNA的变性（Denaturation）是指在某些理化因素作用下，DNA双链间氢键断裂、双螺旋结构解开变成单链（不涉及核苷酸间共价键的断裂），即DNA由稳定的双螺旋结构变成无规则线团的现象。

变性后核酸的理化性质会发生改变，如粘度下降、浮力密度增加等，尤其是光密度的改变最重要。

DNA变性后，其对紫外(260nm)吸收能力增强的现象称为增色效应(hyperchromiceffect)

引起DNA变性的因素有加热（90-100℃）、强酸（pH＜3）、强碱（pH＞10）、乙醇、尿素及酰胺等，实验中常用的是加热。Tm值的大小与DNA分子大小和其所含碱基中的G+C比例相关，G+C比例越高，Tm越高小于20bp的寡核苷酸片段的Tm值可用公式Tm=4（G+C）+2（A+T）计算

若以温度对OD260的关系作图，可得一S型曲线，称解链曲线。通常将50％的DNA变性时的温度称为DNA的解链温度（融解/熔解温度，meltingtemperature，Tm)。二、复性

变性的DNA在适当条件下，两条彼此分开的多核苷酸链又可以重新配对，恢复天然双螺旋结构，这一现象称为复性（renaturation）。热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性的过程也称为“退火”(annealing)。但加热变性后，如将DNA分子迅速冷却至4℃以下，则几乎不可能发生复性。

变性（增色效应）复性（减色效应）三、核酸分子杂交

在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件下就可以在不同的分子间形成杂化双链（DNA/DNA、DNA/RNA、RNA/RNA），这种现象称为核酸分子杂交(hybridization)。（复性发生在不同来源的核酸单链之间，形成杂化双链的过程）

核酸分子杂交的目的是运用特异的探针鉴定复杂的靶DNA中同源的DNA片段。可以是定性研究，也可以是定量研究。杂交的一方是待测的DNA或RNA，另一方是用于检测用的已知序列的核酸片段，称为探针(probe)，通常用放射性核素或非核素标记物标记，然后通过杂交反应就可以确定待测核酸是否含有与之相互补的序列。患者痰液想知道是否含有结核杆菌例：支持物患者痰液DNA酶切产物已变性已知结核杆菌的一段DNA序列GCTAGCCGAAT适宜的条件杂交后洗膜有没有探针第二节分子杂交探针探针(probe)是指能与特定靶分子发生特异性相互作用，并能被特殊方法所检测的分子。核酸探针是指能与特定核酸序列发生特异互补杂交，杂交后又能被特殊方法检测的，已知并被标记的核苷酸序列。（主讲）由此可见成为核酸探针需具备以下基本条件：①带有标记物而不影响其碱基配对特异性，便于分析杂交体；②为单链核酸，双链核酸探针使用前需变性；③具有高度特异性，只与待测核酸杂交；④探针序列通常是基因编码序列，因为非编码序列特异性低；⑤灵敏度应高而稳定，标记方法简便而安全。选探针选标记物、法选检测法一、核酸探针的种类及其选择根据探针的来源及核酸性质不同可分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针及寡核苷酸探针等几类。(一)基因组DNA探针

基因组DNA探针指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针（双链制备容易，单链效率和特异性强）。这类探针的DNA片段必须是特异的，多为某一基因的全部或部分序列，它们在临床微生物诊断上具有广阔的前景，例如用于细菌的分类和菌种鉴定。(二)cDNA

探针

cDNA（complementaryDNA）探针是应用最广泛的核酸探针，指互补于mRNA的DNA分子，是由逆转录酶催化而产生的。这种探针不含有内含子序列，因此尤其适用于基因表达的检测、RNA病毒的检测等。

上述两种探针都属于DNA探针，它们的共同优点是：1.这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，制备方法简便；2.不易降解（相对RNA而言）；3.标记方法较成熟，有多种方法可供选择。(三)RNA探针由于RNA是单链分子，所以它与靶序列的杂交反应效率极高。早期采用的RNA探针是细胞mRNA探针和病毒RNA探针，这些RNA是在细胞基因转录或病毒复制过程中得到标记的，标记效率往往不高，且受到多种因素的制约（稳定性差，不易标记）。这类RNA探针主要用于研究目的，而不是用于检测。

RNA探针和cDNA探针具有基因组DNA探针所不能比拟的高杂交效率，但RNA探针也存在易于降解和标记方法复杂等缺点。但这三种探针均是可克隆的，一般情况下，只要有克隆的探针，就不用寡核苷酸探针。

克隆探针的特点：1.可获得较强的杂交信号；2.特异性强（针对长片段），但是，较长的探针对于靶序列变异的识别能力又有所降低。这既是其优点，又是其缺点。优点是当用于检测病原微生物时，不会因病毒或细菌DNA的少许变异而漏诊，缺点则是不能用于点突变的检测。这种情况下，通常要采用化学合成的寡核苷酸探针。(四)寡核苷酸探针根据已知的核酸序列，采用DNA合成仪合成一定长度的寡核苷酸片段，一般长约15～50个bp，亦可作为探针使用。若不知核酸序列，可根据蛋白质的氨基酸顺序推导出核酸顺序，但要考虑到密码子的简并性。利用寡核苷酸探针可检测到靶基因上单个核苷酸的点突变，多用于克隆筛选和点突变分析。

特点：⑴短，杂交速度快，特异性高（针对短片段）；⑵可短时间大量制备；⑶可在合成中进行标记；⑷可合成单链探针(避免自我复性，提高杂交效率)；⑸可检测小DNA片段及序列中单碱基对的错配。选择寡核苷酸探针遵循的原则：⑴长18～50bp，较长探针杂交时间较长、合成量低；较短探针特异性会差些；⑵碱基成分：G+C含量为40%～60%，超出此范围则会增加非特异杂交；⑶探针分子内不应存在互补区，否则会出现抑制探针杂交的“发夹”状结构；⑷避免单一碱基的重复出现（不能多于4个），如-CCCCC-；⑸进行核酸序列比较，探针序列应与含靶序列的核酸杂交，而与非靶区域的同源性不能超过70%、也不能有连续8个或更多的碱基的同源，否则该探针不能用。二、探针标记的类型及方法（一）标记物种类

标记的目的就是让它能被识别并可用来示踪，常用的探针标记物为放射性标记物（核素/同位素标记物）和非放射性标记物（非核素/非同位素标记物）两大类，根据此分类也可将探针分为放射性探针和非放射性探针两大类。1.放射性标记物放射性同位素是目前应用最广的标记物，优点是灵敏度高，且不影响特异性和稳定性或酶促反应；缺点是易造成放射性污染以及对于半衰期短的探针需尽快使用。目前核酸探针标记常用的同位素种类有：（1）32P：应用最多，放射性强，灵敏度较高，缺点是半衰期短，放射线散射较严重，对分辨率有影响。（2）35S：放射性较低，半衰期长，灵敏度较高，低散射，分辩率高，特别适用于核酸序列分析和原位杂交等实验。（3）3H(氚)、131I

等2.非放射性标记物非放射性标记常用生物素（biotin）或地高辛（digoxigenin）以及光生物素（photobiotin）、荧光素等。其优点是无放射性污染，较稳定；缺点是灵敏度、特异性稍差。目前应用较多的非放射性标记物是生物素和地高辛，二者都是半抗原，可利用其抗体进行免疫检测。生物素抗生物素蛋白酶底物→（二）核酸探针的标记方法核酸的标记可以在体外进行，也可在体内进行，一般常用体外标记。体外标记法分为化学法和酶促标记法（酶法）。放射性同位素标记（常用酶促标记法）非放射性同位素标记（）既可用酶促标记法，又可用化学法

酶促标记法是将标记物预先标记在核苷酸（NTP或dNTP）分子上，然后利用酶促反应将标记的核苷酸分子掺入到探针分子中去，或将核苷酸分子上的标记基团交换到探针分子上。常用的酶促标记法有：缺口平移法、随机引物法、聚合酶链反应标记和末端标记法。1.缺口平移法（nicktranslation）

DNA酶I随机在探针DNA上打开缺口，然后利用大肠杆菌DNA聚合酶I5′→3′外切酶活性，在缺口处按5′→3′方向切除单核苷酸；同时DNA聚合酶I有5′→3′的聚合酶活性，在缺口处3′端加入底物中被标记的单核苷酸，填补缺口。随着反应的进行，被标记的单核苷酸随机掺入。DNA聚合酶I的这两种作用交替进行，探针即被合成。实质：用[α-32P]dNTP取代原来DNA链中不带同位素的同种核苷酸，生成的两条链均被同位素标记。5′3′3′5′DNA酶Ⅰ5′3′3′5′DNA聚合酶Ⅰ:5′→3′外切+5′→3′聚合活性5′3′3′5′变性边切边补取代标记的底物2.随机引物法（Randompriming）

随机引物是人工合成的含有各种可能的排列顺序的六核苷酸片段的混合物，因此可以与任何核酸片段杂交，并作为聚合酶链反应的引物，在大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段作用下，合成与目的DNA互补的DNA链，当在反应液中加入[α-32P]dATP时，即可形成放射性同位素标记的DNA探针，但探针DNA序列是长短不等的。特点：所得探针的放射性比活较高，适用于大多数杂交，结果稳定。AGCTTAAATGCTATCGGCATGATGAGCTGAAGTTCGACGTAGATACCGAGCCGAACGGCAACCGTGAAGCTG……….5′3′3′5′DNA聚合酶ⅠKlenow片段5′→3′聚合活性变性5′3′3′5′5′3′3′5′随机引物5′3′3′5′变性重新合成标记的底物3.聚合酶链反应标记DNA探针

在底物中加入[α-32P]dATP或其它标记的dNTP，PCR技术可在1～2h之内合成很多标记好的DNA探针，标记物的掺入率可高达70%～80%。因此，PCR标记技术特别适用于大规模检测。该法的缺点是要合成一对特异性PCR引物。

底物中掺入标记的核苷酸，借助PCR过程就可合成想要的探针4.末端标记法

只将DNA分子的一端（5′或3′端）标记，可得到模板全长DNA探针，但标记活性低，标记不均匀，通常用于测序标记，不作杂交标记。此法也常用于寡核苷酸探针的标记，末端标记常用的酶有：1)

Klenow片段：用于残缺3′-端的填充标记2)

T4

DNA聚合酶：用于残缺3′-端的填充标记。3)

T4多核苷酸激酶：用于5′-端加磷酸标记4)

末端转移酶：用于3′-端标记，不需要模板5′3′3′5′5′3′3′5′5′3′3′5′（三）标记探针的纯化

用适当的方法将未掺入的单核苷酸分子去除。可用乙醇沉淀、凝胶过滤(Sephadex

G-50)等方法纯化探针。三、杂交信号的检测

（一）放射性核素探针的检测——放射自显影利用放射线在X线片上成影作用来检测杂交信号，称为放射自显影。

（二）非放射性核素探针的检测

非放射性核素探针的检测要经过偶联反应和显色反应两步。一般是利用抗原抗体免疫反应或亲和法与显色体系（酶、荧光素）偶联，再通过显色反应检测杂交信号。酶偶联是最常用的检测方法，可通过酶促反应使底物形成发光或有色产物，常用的酶是辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶。底物→第三节

核酸分子杂交技术一、核酸分子杂交方法的分类核酸分子杂交可按作用环境大致分为液相杂交和固相杂交两种类型。（一）液相杂交液相杂交指所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。没有固相杂交应用的普遍，目前常用的液相杂交有RNA酶保护分析法、核酸酶S1保护分析法。例：RNA酶保护分析法（RNaseprotectionassay,RPA）是利用RNaseA和RNaseT1能专一性降解单链RNA而双链RNA则受到保护的特点，用体外转录合成的放射性标记的RNA探针与待检mRNA进行液相杂交，使互补序列RNA探针和待测RNA形成杂交体被保留，而未形成双链的RNA被降解。此法可用于mRNA定量、mRNA末端定位及确定内含子在相应基因中的位置等。具体过程是：制备待测RNA→制备RNA探针并标记→杂交→除去单链RNA→回收双链，电泳分析。RNase（二）固相杂交（固-液相杂交）

固相杂交是通过各种方法将待测核酸分子固定在固相支持物（如硝酸纤维素滤膜、尼龙膜和滤纸）上，然后用标记的探针（在溶液中）与被固定的分子杂交，未杂交的游离片段可容易地漂洗除去，经显影后即可检测出支持物上留下的杂交物（DNA或RNA分子）所处的位置。该法比液相杂交容易检测，并能防止靶DNA自我复性，所以最为常用。但杂交前需要进行预杂交。支持物(膜)适宜的条件杂交后洗膜探针溶液

若是将存在于凝胶中的生物大分子（核酸、蛋白质）转移(印迹)于固定介质上并加以检测分析的技术称为印迹技术(blotting)。目前这种技术已被广泛用于DNA（Southern印迹杂交）、RNA（Northern印迹杂交）和蛋白质（Western

印迹杂交）的检测。典型的印迹技术包含三项基本工艺：凝胶电泳、样品转移和杂交分析。核酸分子杂交与印迹技术相结合为DNA和RNA的分析提供了有效手段。凝胶支持物常用的固相杂交类型有：菌落原位杂交组织原位杂交斑点杂交狭缝杂交Southern印迹杂交（检测DNA）Northern印迹杂交（检测RNA）Western印迹杂交（检测蛋白质）原位杂交：将标记的探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交检测的方法1.菌落原位杂交（Colonyinsituhybridization）通常用于筛选，将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落进行原位裂解释出DNA，再烘干固定DNA于膜上，与32P标记的探针杂交，检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。与平板对应，找出阳性克隆（注意方向）2.组织原位杂交（Tissueinsituhybridization）

简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落的原位杂交不同，菌落原位杂交需裂解细菌释出DNA，然后进行杂交。而原位杂交是经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交。因此原位杂交可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置，这一点具有重要的生物学和病理学意义,能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态。常用于目的基因的筛选或检测某类细胞或组织中是否存在某一特定的DNA、RNA序列。若检测蛋白质——免疫组化A细胞B细胞)NCF3.斑点杂交（Dotblotting）斑点杂交是将DNA或RNA样品变性后直接点在硝酸纤维素滤膜上，然后与核酸探针分子杂交，以显示样品中是否存在特异的DNA或RNA。这种方法耗时短，可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。它是一种简便、快速、经济的分析DNA或RNA的方法，在基因分析和基因诊断中经常用到，是研究基因表达的有力工具。但由于目的序列未与非目的序列分离，不能了解目的序列的长度。

4.Southern印迹杂交（Southernblotting）——检测DNA

Southern杂交指DNA片段经电泳分离后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，然后与探针杂交。被检对象为DNA，探针为DNA或RNA。Southern杂交可用来检测经限制性内切酶切割后的DNA片段中是否存在与探针同源的序列，常用来进行基因组结构分析，如缺失、插入、倒位等的检测和RFLP连锁分析。过程包括：提取基因组DNA→限制性内切酶切割→DNA变性电泳→印记转移→预杂交→洗膜→探针杂交→洗膜→放射自显影或化学显色。详细步骤1)

提取DNA，选择合适的酶切，

凝胶电泳分离各酶切片段，然后使DNA原位变性（碱）；

2)

可用毛细管转移、真空转移或电转移法将DNA片段转移到固体支持物(硝酸纤维素滤膜或尼龙膜)上；3)

预杂交滤膜（鲑鱼精子的DNA），掩盖滤膜上非特异性位点；

4)

让探针与同源DNA片段杂交，然后漂洗除去非特异性结合的探针；

5)

通过显影检查目的DNA所在的位置。

将DNA从凝胶中转移到固体支持物上主要有3种方法:1)毛细管转移：本方法由Southern发明，故又称为Southern转移(或印迹)。毛细管转移方法的优点是简单，不需要用其他仪器。缺点是转移时间较长，转移后杂交信号较弱。2)

真空转移：一般是将硝酸纤维素膜或尼龙膜放在真空室上面的多孔屏上，再将凝胶置于滤膜上，借助真空抽吸使缓冲液从上面的一个贮液槽中流下，洗脱出凝胶中的DNA，使其沉积在滤膜上。该法的优点是快速，转移后得到的杂交信号比前者强2-3倍。缺点是如不小心，会使凝胶碎裂，并且在洗膜不严格时，其背景比毛细管转移要高。缓冲液凝胶多孔屏膜真空抽吸3)电转移：将DNA变性后，可电转移至带电荷的尼龙膜上。该法的优点是可直接转移较大的DNA片段。缺点是转移中电流较大，温度难以控制。通常只有当毛细管转移和真空转移无效时，才采用电泳转移。（此法常用于转移蛋白质）缓冲液(提供合适的pH，使样品带负电)凝胶滤纸膜+5.Northern印迹杂交（Northernblotting）

Northern杂交是将RNA片段经变性电泳后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然后用探针杂交的方法。被检对象为RNA，探针为DNA或RNA。常用于检测mRNA长度分子量大小、mRNA的含量，即基因表达高低。

具体过程与Southern基本相似，在操作时需注意以下几点：1）RNA分子较小，不需进行限制性内切酶切割；2）在进样前用甲基氧化汞、乙二醛或甲醛使RNA变性，而不用NaOH，因为它会水解RNA的2’-羟基基团；3）在转印后不能用低盐缓冲液洗膜，否则RNA会被洗脱；4）在胶中不能加EB，因为它影响RNA与硝酸纤维素膜的结合；5）操作均应避免RNase的污染。

二、核酸分子杂交实验因素的优化（一）探针的选择（二）探针的标记方法（三）探针的浓度（四）杂交率（五）杂交最适温度（六）杂交的严格性（七）杂交反应时间（八）杂交促进剂第四节其他杂交技术一、蛋白印迹技术——Westernblotting

Westernblotting的总体过程也与Southern杂交相似，只不过在Blotting过程中蛋白质样品进行的是SDS凝胶电泳，转移的是蛋白质而不是DNA，使用的转移方式是电转移，其后的杂交过程不是真实意义的分子杂交，而是通过抗体以免疫反应形式检测滤膜上是否存在被抗体识别的蛋白质，并判断其分子量。所用的探针不是DNA或RNA，而是针对某一蛋白质制备的特异性抗体，“显色”借助标记的二抗。该技术广泛应用于蛋白的定性或定量分析。与二抗杂交洗膜电转移印迹到尼龙膜上（看不见条带）放射自显影荧光酶催化显色目的条带标记marker

待检蛋白样品SDS变性电泳封闭（预杂交）与一抗杂交洗膜比较Southern、Northern、Western印迹杂交的异同点

不同点SouthernNorthernWestern靶分子DNARNA蛋白质转膜方式毛细管虹吸、真空转移、电转移真空转移、电转移电转移探针DNADNA或RNA抗体主要应用（1）基因组结构分析，如缺失、插入、倒位等，（2）RFLP分析检测mRNA长度分子量大小，mRNA含量，即基因表达情况对蛋白质进行鉴定及定量变性剂碱变性甲醛SDS相同点均是指将存在于凝胶中的生物大分子转移（印迹）于固定介质上并利用核酸探针或抗体及相应技术加以检测分析二、酶联免疫吸附测定法(ELISA)三、基因芯片（genechip）固相分子杂交技术一、名词解释：1.分子杂交（molecularhybridization）2.原位杂交（insituhybridization）3.