第十部分核酸生物合成

第十部分核酸的生物合成BIOSYNTHESIS

OF

NUCLEIC

ACIDDNA半保留复制证据：（1）1958年，Meselson和Stahl用15N标记E.coliDNA，用密度梯度离心试验证明了DNA的复制是半保留复制。（2）

1963年，Cairns用放射自显影法，在显微镜下首次观察到完整的正在复制的E.coli染色体DNA。环状DNA的复制¤¤¤¤¤¤¤¤¤¤¤¤¤¤¤¤¤¤¤¤A¤BCAutoradiogram

of

areplicating

E.colichromosomal

DNAlabeled

by

[3H]thymidine.A3H3HB1H3HC3H1H复制的起点和方向1.

复制起点（origin）①富含A

T。②含有一系列对称的反向重复和某些短的成簇的保守序列。③E.coli的复制起点：ori

C245bp，保守顺序GATC和TATCCACA2.

复制单位复制子(replicon)：基因组（genome）能独立进行复制的单位，每个复制子就是一个复制单位，都含有一个复制起点。复制叉（replication

fork）：复制时由于

DNA双链解开，在两股单链上进行复制，形成在显微镜下可看到的叉状结构。复制终点(terminus)

终止复制的

DNA区域。3.

复制方向大多数是双向的（等速进行或异速进行），形成两个复制叉，少数是单向复制，形成一个复制叉。Nondenatured

DNA(double-stranded)Denatured

loops(single-stranded)Denaturation

mapping:the

denatured

loops

arereproducible

and

thus

can

beused

as

points

of

reference(DNA

replication

starts

atspecific

origins).E.coli中DNA聚合酶Arthur

Kornberg

won

the1959

Nobel

Prize

in

Medicinefor

his

discovery

of

themechanism

in

the

biologicalsynthesis

of

deoxyribonucleicacid

(before

Watson

and

Crickwon

theirs!)（1）DNA聚合酶Ⅰ1956年由Kornberg首次在E.coli中发现，也称

Kornberg酶。①polⅠ的性质单体酶，分子量109kD，含一个Zn2+，每个细胞中含400个DNA

polⅠ②功能5¢→3¢聚合

1个酶分子：1000nt聚合/min。3¢→5¢外切酶活性（校对功能。但在正常聚合条件下，此活性不能作用于生长链）5¢→3¢外切酶活性（主要是对DNA损伤的修复，以及在DNA复制时RNA引物切除）。用蛋白水解酶将DNA

polⅠ部分水解可得：

大片段（Klenow

fragment）

75kD，5′→3′聚合活性和3′→5′外切活性。DNA

polymerase

I

has

three

enzymatic

activitiesina

single

polypeptide

chain,

which

can

be

cleavedinto

two

functional

parts

bymild（温和）

proteasetreatment.小片段

36kD，5′→

3′外切活性。Protease

cleavage在大片段（Klenowfragment）中，含有2个结构域：5′→3′聚合活性结构域和3′→5′外切活性结构域。The

polymerasedomainThe

3`

to

5`exonucleasedomainStructure

of

theKlenow

fragment

of

DNA

polymease

I（2）DNA聚合酶Ⅱ多亚基酶，分子量：120kD，每个细胞100个酶分子。催化活性：5′→3′聚合，活力比I高，2400nt/min。3′→5′外切酶活性。可能在DNA的修复中起某些作用。（3）DNA聚合酶Ⅲ（DNA复制酶）1972年发现，是原核生物DNA复制的主要聚合酶（10-20copy/cell），该酶是由10种亚基组成不对称二聚体（异二聚体）结构。其中：a、e、q形成核心酶。主要功能：5′fi

3′聚合活性（

a亚基，速率：15000-60000nt/min）。3′fi

5′外切活性（e亚基），起校对作用，提高DNA复制的准确性。Sliding

clampsubunitsCatalyticsubunitCatalyticsubunitClamploaderProposedarchitecture

of

DNApolymeraseⅢholoenzyme:an

asymmetricdimer3’ 5’

exonucleasesubunitsNo

5`

to

3`

exonucleaseactivityDNA聚合酶Ⅲ异二聚体滑动夹子聚合活性3′→5′外切活性组建核心酶夹子装置器使核心酶二聚化The

two

b

subunits

ofE.

coli

polymerase

Ⅲform

a

circular

clampthat

may

surroundDNA

to

increase

itsprocessivity.A

clampingb

dimerDNA

duplex（4）DNA聚合酶Ⅳ和Ⅴ1999年发现，涉及DNA的错误倾向修复，当DNA严重损伤时，可诱导产生这两个酶，是修复缺乏准确性，提高的DNA的高突变

率。高突变率虽可杀死许多个细胞，但至少

可以克服复制障碍，使少数细胞得以存活。DNA连接酶（ligase）1967年发现，催化双链DNA缺口处5′-磷酸基和3′-OH生成磷酸二酯键。但不能将两条游离的DNA单链连接起来。DNA连接酶的能量需要：E.coli等细菌

NAD高等生物和噬菌体

ATPDNA

ligase在DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用作用。HOPDNA

ligase5′3′3′5′5

′3′3′5′NAD+

NMNATP

AMP+PPiPOH55+′3′′3′5′

P3′DNAligaseOHOO

P

OO-OHO

P

OOP

PO-

-

αγ

βPPi母本DNA双链分离的酶及蛋白质因子（1）DNA解螺旋酶（helicase）又叫DNA解链酶，通过水解ATP将DNA两条链解开。每解开一对碱基需要水解2个ATP分子。（2）DNA旋转酶（gyrase）又称DNA拓扑异构酶Ⅱ(topoisomeraseⅡ）,可引入负超螺旋，消除复制叉前进时带来的扭曲张力。一条肽链，top拓扑异构酶分两类：①拓扑异构酶I（ω蛋白）基因编码，相对分子量：97kD该酶能使DNA的一条链发生断裂和再连接，不需能量，只能消除负超螺旋，每次改变L值为+1，但不能作用正超螺旋。主要集中在活性转录区，与转录有关②

拓扑异构酶

Ⅱ

使DNA两条链发生断裂和再连接。当引入负超螺旋时需要由ATP提供能量，约100个负超/min，同复制有关。拓扑异构酶Ⅱ通过引入负超螺旋，每次改变的L为–2，可消除复制叉前进时带来的扭曲张力，从而促进双链的解开。（3）单链结合蛋白E.coli

的单链结合蛋白（single

strandbinding

protein SSB）由4个相同亚基组成，分子量：75.6kD。SSB与复制叉上的单链DNA结合，稳定单链、阻止复性和保护单链DNA不被核酸酶降解。SSB与DNA的结合有协同效应，当第一个

SSB结合后，其后的SSB结合力提高103倍，直至全部DNA被SSB所覆盖。4.

引发酶（引物合成酶）细胞内，DNA的复制需要引物，引发酶（primase）以DNA为模板合成一段RNA（6-10nt）引物（primer)。引发酶实质是以DNA为模板的RNA聚合酶。DNA的半不连续复制DNA复制中一条链是连续合成的，称为前导链（leadingstrand），另一条链是不连续的，称为滞后链（laggingstrand），为DNA的半不连续复制（semidiscontinuous

replication）。冈崎片段冈崎片段（Okazaki

fragment）DNA复制时滞后链上按5′→3′方向合成的若干短的片段。原核生物中1000-2000个nt（相当于一个顺反子）；真核生物中100-200个nt（相当于一个核小体的DNA单位）。Schematic

diagram

of

DNA

replication

at

a

growing

fork维持DNA复制准确性的因素：E.coli的错配率是：5·10-9①DNA聚合酶的高度专一性（严格遵循碱基配对原则，错配率为7

·10-6

）。②DNA聚合酶的自我校对（错配碱基被3′→5′外切酶切除）。③使用RNA为引物，但最终被切除。④复制的方向只能以5′→3′进行。复制体（replisome）在DNA合成的复制叉上，分布有各种与复制有关的酶和蛋白质因子，它们构成的复合物即复制体。E.coli染色体DNA的复制（1）起始E.coli

DNA复制起点为：ori

C，由245bp组成，三组13bp重复序列，四组9

bp重复序列，它们都十分保守。成串排列的三个13

bp序列共有序列GATCTNTTNTTTT共有序列TTATCCACADnaA蛋白结合位点四个9

bp序列①20-40个Dna

A各带1个ATP结合在4组9bp重复序列，形成DNA环绕的起始复合物。②三组13bp重复区依次变性成开链复合物。③在Dna

C协助下，DnaB（六聚体）与开链复合物结合，借水解ATP，沿

DNA5′→3′方向移动，为前引发复合体。④DNA解旋酶（拓扑异构酶II）可消除Dna

B（解螺旋酶）产生的张力；SSB保护单链，防止恢复双链。Dna

ADnaB(解螺旋酶)SSBDna

C（2）延长前导链只需要一个RNA引物，后随链的每一个冈崎片段都需要一个RNA引物，链的延长反应由DNA

pol

III催化。①前导链的延长DNA聚合酶III全酶二聚体的一个β亚基与前导链的模板结合，由α亚基催化子链的延长，方向与复制叉解链方方向相同。②滞后链的延长DNApolⅢ全酶二聚体的另一半与形成一个环的滞后链的模板结合。由于模板形成环，酶向前移动时，滞后链合成的冈崎片段也沿5′→3′方向生长，与酶催化方向一致。滞后链冈崎片段合成接近前方冈崎片段5′末端时，模板被释放，环消失。继续重复，连续进行。聚合酶III核心酶大肠杆菌复制体结构示意图聚合酶I聚合酶III核心酶滞后链解螺旋酶

引物合成酶

RNA引物引发体拓扑异构酶IIb-夹子前导链g-复合物i-聚体

b-夹子RNA引物

单链结合蛋白（SSB）③切除引物，填补缺口，连接相邻DNA片段DNA聚合酶Ⅰ5′→3′外切活性切除引物，

5′→3′聚合酶活性填补缺口。连接酶连接两段冈崎片段。（3）终止终止区含有6个约22bp的终止子，即ter

A-terF。与终止子结合的蛋白质叫Tus（terminusutilization

substrance）。Tus-Ter复合物阻止对侧复制叉超过中点后的过量复制。两个复制叉在终止区相遇而停止复制，其间约有50-100bp未被复制，其后两条亲代链解开，以修复方式填补空缺。复制完成后的两环状染色体缠绕成连锁体，由拓扑异构酶IV解开。大肠杆菌染色体复制的终止ori

C复制叉2复制叉1终止复制叉2终止复制叉1复制叉1复制叉2DNA拓扑异构酶IV连锁染色体完成复制染色体分开真核生物的复制特点（1）复制起点和复制子多个复制起点，是多复制子。复制子较小，约15-30μm微米（45-900kb）。原核真核真核DNA全部复制完才进行第2轮复制。原核在第一轮复制未完成就进行第2轮复制。复制速度原核：50kbp/min，20-30min/代。真核：1-3kbp/min，但复制眼多，总速度比原核快。果蝇3min完成复制。（4）组蛋白的复制全保留方式。前导链是原有组蛋白；滞后链是新合成的组蛋白。（5）冈崎片段原核：长，1000-2000bp

；真核：短，100-200bp。端粒的复制（1）端粒（telomere）是真核生物染色体线性DNA分子两个末端

特有的结构，它是由许多短的重复序列组成。一条链富含G，另一条链富含C。四膜虫一条链的重复单位：(TTGGGG)n人端粒一条链的重复单位：(TTAGGG)n端粒的作用：①稳定染色体的末端结构，防止染色体间末端连接；②补偿滞后链5′端在消除引物后留下空缺。（2）端粒酶(telomerase)含有RNA和蛋白质两种组分，RNA分子约

159nt，含有多个重复序列，RNA分子用作端粒链合成的模板。端粒酶是一种逆转录酶，它只合成与酶自身的RNA模板互补的DNA片段。酶以内部RNA为模板催化合成端区DNA链形成发夹结构，产生3′-OH为填补缺口的引物，保证染色体完整性。反转录酶(reverse

transcriptase)由一个α亚基和一个β亚基组成，含有Zn2+，有三种酶活力。有三种活性：RNA指导的DNA聚合酶活力（以RNA为模板，合成一条互补的DNA，形成RNA-DNA杂种分子）。RNaseH活力，水解RNA-DNA杂种分子中的RNA，有3′→5′和5′→3′

外切酶作用。DNA指导的DNA聚合酶活力。依赖RNA的DNA聚合酶核糖核酸酶H活力依赖DNA的DNA聚合酶3.

反转录病毒的基因组通常由两条相同的（+）RNA链组成。

5′

端附近区域以氢键结合在一起，全长7-10kb。每一条RNA链的两端具有相同的序列，形成正向重复序列。（3）5′端有帽子结构，3′端有polyA。（4）5′端带有1分子的宿主tRNA，作为反转录时的引物。某些鸟类反转录病毒携带tRNATrp

，鼠类tRNAPro，人AIDS病毒是tRNALys。RNA转录特点：①转录单位：RNA的转录从DNA模板的特定位点开始，并在一定的位点终止。此转录区域为一个转录单位。②模板链(template

strand)：指导RNA合成的DNA单股链，又称反义链(antisensestrand)、负链（-链）、Watson链。③编码链(coding

strand)：与模板链互补，不作为转录的另一条DNA单链，又称有义链

(sense

strand)、正链（+链）、Crick链。编码链与转录的mRNA链碱基序列基本相同，只是T

换成U

。④合成原料：4种NTP⑤配对原则：C--G、A--U⑥合成酶：RNA聚合酶，不需要引物，5′→3′合成方向。⑦不对称转录：双链DNA中只有一条链作为转录的模板，另一条链不转录。但模板链并非永远在同一单链上。原核生物的启动子启动子（promoter）

RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列。利用足迹法和DNA测序法可确定启动子的序列结构。足迹法（footprint）：将DNA起始转录的限制片段分离出来，加入RNA聚合酶与之结合，再用DNA酶部分水解，由于与酶结合的部位被保护而不水解，其余部分被水解成长短不同的片段，经凝胶电泳即可测出酶所结合的部位。（randomly）The

footprintingtechniqueThe

footprint（randomly）足迹法测定可被RNA聚合酶保护的区域为：﹣50至﹢203′3′5′5′含s70RNA多聚酶全酶识别的E.coli

启动子Promoter

structure

in

prokaryotes5’PuPuPuPuPuPuPuPuAUG+

1+

205’mRNAmRNA-

35

region-

10

regionconsensus

sequencestranscription

start

siteTATAATATATTA-

12 -

7Pribnow

boxT

A

T

A

A

T79

95

44

59

51

96%-30

-10

+1Promoter[]TTGACAAACTGT-

36 -

31Sextama

boxT

T

G

A

C

A82

84

79

64

53

45%CATGTA①-10区：在-6

~-13bp之间，共同序列为

TATAAT，又称pribnow框，酶在此处与DNA结合成稳定的复合物(开放起始复合物)，并解开富含AT的双链形成开放型起始结构。②-35区：共同序列为TTGACA，又叫

Sextama框，是RNA聚合酶起始识别区(封闭型起始复合物)，与s因子有关。③起始点（+1）：90%为嘌呤碱，常见的为

CAT，A为+1，所以，RNA合成中第一个掺入的碱基为A或G。原核生物的终止子几个概念：①终止子（terminator）提供转录终止信号的DNA序列。②终止因子（termination

factor）:协助RNA聚合酶识别终止信号的辅助因子(蛋白质)。③抗终止因子（antiterminationfactor

）:有些终止子的作用可被特异的因子所阻止，使酶得以超过终止子继续转录，称通读

(readthrough)，这类引起抗终止作用的蛋白质成为抗终止因子。终止子在终止点之前都有一个回文结构，转录出来的RNA形成一个茎环式的发荚结构。

E.coli中有两类终止子：①不依赖于rho(ρ)终止子（简单终止子）回文结构富含G-C，之后是一连串的dA碱基序列，它们转录的RNA链的末端为多聚U（连续6个）。②依赖ρ的终止子终止点前无一连串的dA碱基序列，回文对称区不富含GC。必须在ρ因子存在时，才发生终止作用。ρ因子是55kD的蛋白质，可水解三磷酸核苷。转录的终止：E.coli有两种终止方式：a.

不依赖ρ

因子的终止（强终止子）终止子DNA序列中富含GC的回文结构使转录的RNA产物产生一个颈环（发夹结构），这时RNA聚合酶延伸速度减慢，RNA

3′端的多聚U（约6个）与模板DNA组成的RNA-DNA杂交区（A=U）结合较弱，使的RNA易脱落。不依赖ρ

因子的转录终止b.依赖ρ

因子的转录终止终止子回文结构短，不富含GC，其后也无连续的dA。单凭终止子不能使转录终止。转录时，ρ因子结合在新生的RNA链上，借水解NTP获能沿RNA链移动。当RNA聚合酶遇到终止子时，

速度减慢，ρ

因子追上酶，

与酶相互作用，释放RNA。依赖Rho因子的转录终止真核细胞的RNA聚合酶转录产物对α-鹅膏蕈碱敏感性酶类分布IⅡⅢ核仁核质核质45SrRNA前体、加工后成为5.8SrRNA、18SrRNA、28SrRNA成熟rRNA所有编码蛋白质的mRNA前体、多数snRNA分子量小的RNA，如：tRNA、5S

rRNA、snRNA、scRNA不敏感敏感中度敏感原核tRNA前体的加工E.coli中tRNA前体的加工步骤：内切酶(RNaseP、RNaseF)在两端切断。外切酶(RNaseD)

从3′端切去附加序列。tRNA核苷酰转移酶在3′端加上-CCA。核苷的修饰（修饰酶）：甲基化酶/S-腺苷蛋氨酸（SAM），假尿苷合成酶。RNase

P特异剪切tRNA前体的5′-端，生成成熟的5′-末端，为内切酶，又称为：5′-成熟酶。该酶由两部分组成：蛋白质（C5）RNA

(M1RNA)23%

17.5kD77

%

375nt

130kDM1RNA在某些情况下也能单独切断5′-附加序列。RNase

F内切酶，从靠近3′-端切断前体分子。RNase

D外切酶，从3′-端逐个切去附加顺序，以暴露出3′-端。E.coli有两类tRNA基因，一类有CCA序列；另一类无CCA序列，需外加上去。tRNA核苷酰转移酶

以ATP、CTP为原料，催化tRNA的3′-

端生成CCA结构。tRNA修饰酶高度专一，由于tRNA中修饰成分繁多，因而修饰酶种类很多。如：tRNA甲基转移酶 甲基供体—SAM碱基移位酶

U→ψ脱氨酶

A→I还原酶

U→D修饰可发生在加工前，也可以在加工后进行。mRNA前体的加工mRNA原初转录物是分子量很大的前体，在核内加工过程中形成了分子大小不等的中间产物，称为核内不均一RNA

（

heterogeneousnuclear

RNA，hn

RNA）。其中，约有25%可转变成成熟的mRNA。hnRNA转变成mRNA的加工过程：5′末端形成帽子结构3′末端加上polyA的尾巴剪接除去内含子对应的序列某