植物原生质体分离和活性鉴定

植物原生质体分离和活性鉴定实验目的1.学习植物细胞原生质体分离纯化的方法。2.了解原生质体活性鉴定的原理。实验原理植物原生质体(protoplast)是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”,是开展基础研究的理想材料。其中,酶解法分离原生质体是一个常用的技术,其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成,因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分,除去细胞壁,即可得到原生质体。由于原生质体内部与外界环境之间仅隔一层薄薄的细胞膜,必须保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性。其次,还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响。测定原生质体的活性有多种方法。荧光素双醋酸酯(FDA)染色是常用的一种方法,FAD本身无荧光,无极性，可透过完整的原生质膜。一旦进入原生质体后,由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。它不能自由出入原生质膜,因此有活力的细胞能产生荧光,无活力的原生质体不能分解FAD无荧光产生。实验材料、用品材料：绿豆,烟草幼苗叶片等。绿豆烟草幼苗试剂：酶解液(绿豆)：1%(W/V)纤维素酶,1%(W/V)果胶酶,0.7mol/L甘露醇;10mmol/LCaCI2.2H2O,0.7mmol/LKH2PO4,pH6.8〜7.0。13%CPW洗涤液(绿豆)：27.2mg/LKH2PO4,101.0mg/LKNO3,1480.0mg/LCaCl2.2H2O,246.0mg/LMgSO4,0.16mg/LKI,0.025mg/LCuSO4.5H2O,13%(W/V)甘露醇,pH6.0。酶解液(烟草)：用01%2-N-吗啡啉乙磺酸钠配制2%(W/V)纤维素酶,1%(W/V)果胶酶,005mmol/L氯化钙,0.6mol/L甘露醇,pH6.0。⑷洗涤液(烟草)：0.2mol/L氯化钙，加有01%2-N-吗啡啉乙磺酸钠,pH6.0。(5)0.1%2-N-吗啡啉乙磺酸钠或三羟甲基氨基甲烷溶液：内含20%蔗糖,pH6.0。0.02%二乙基荧光素(FDA):5mgFDA溶于1ml丙酮中，避光4°C下贮存，使用时取0.22mlFDA贮存液加入5ml0.65mol/L甘露醇中•使用时,使最终浓度为0.01%。20%蔗糖溶液无菌蒸馏水。仪器：摇床,离心机,倒置显微镜,普通显微镜,超净工作台,培养皿,离心管,载玻片,刀片,镊子,过滤漏斗,200目筛网,吸管,高压蒸汽消毒锅,镊子,解剖刀。实验步骤绿豆幼苗下胚轴：(1)绿豆种子用70%乙醇消毒，自来水流水浸泡4h左右，于湿滤纸上萌发。25C黑暗中培养约60h。取幼苗下胚轴或根为材料进行分离原生质体。⑵取黄化幼苗下胚轴2〜3g,从弯钩下3mm处向下切取约5mm的切段，切成0.5mm的薄片置于10ml酶解液中(也可以取1cm左右的绿豆幼苗的根尖作为实验材料,直接置于酶解液中)。置于摇床上,25〜28C,60〜70r/min,酶解6〜7h。(3)用200目筛网过滤酶解液(制一张装片,观察),滤液经1000rpm离心5min,弃去上清液。用3〜4ml13%CPW液洗涤并溶解沉淀,悬液经lOOOrpm离心5min,留1ml上清液，其余弃之。取10ml离心管1支，注入3ml20%〜25%蔗糖，将沉淀的原生质体悬浮，用滴管吸出悬液小心地铺于蔗糖溶液上,1000rpm离心5〜8min,将位于中间一层的原生质体用吸管小心吸出至另一离心管中，沉淀制一张装片,观察。用13%CPW液洗涤1〜2次，每次lOOOrpm离心5min,得到较为纯净的原生质体。用13%CPW液悬浮至一定密度并制一张装片，观察。取1滴原生质体提取液在载玻片上,加入相同体积的O.O2%FDA稀释液,静置2min后,于荧光显微镜下观察,发绿色荧光的为有活力的原生质体,没有产生荧光的原生质体无活力。烟草幼苗叶片：(1)取充分展开的叶片,用自来水冲洗干净。⑵在超静工作台上,叶片用0.1%升汞溶液中浸泡灭菌10min(中间摇动几次)。取出叶片,无菌蒸馏水漂洗5次。将叶片放入大培养皿中,吸去水分,叶背面朝上,用无菌镊子小心撕去下表皮，或用解剖刀将叶片切成0.5mm宽的小条。另取1个培养皿或带盖的三角瓶，加入酶解液10mL,放叶片约2g,浸泡。(5)在28C保温3〜6h,中间轻轻摇动2—3次。⑹用200目筛网过滤酶解液,滤液经600Xg离心5min,使原生质体沉淀下来。(7)用移液管吸去上清液,将沉淀的原生质体悬浮在0.2mol／LCaCl22H202mL中。(8)用注射器(装上长针头)向离心管底部缓缓注入20％蔗糖6mL,在600Xg离心5min。这时,在两相溶液的界面之间出现一层纯净的完整原生质体,杂质和碎片都沉到管底。(9)取原生质体提取液1滴于载玻片上,加入相同体积的0.02％FDA稀释液,静置5min后,于荧光显微镜下观察,发绿色荧光的为有活力的原生质体,没有产生荧光的原生质体无活力。作业分别述说你观察