2015年生物技术引论与实践教材

生物技术引论与实践

新疆农业大学农学院生物技术系

2011年8月

_xz__

刖5

现代生物技术是以生命科学为基础，利用生物（或生物组织、细胞及其他组成部分）的

特性和功能，设计、构建具有预期性能的新物质或新品系，以及与工程原理相结合，加工生

产产品或提供服务的综合性技术。包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术、发酵工

程等。这门技术内涵十分丰富它涉及到：对生物的遗传基因进行改造或重组，并使重组基因

在细胞内表达，产生人类需要的新物质的基因操作技术（如“克隆技术”）；从简单普通的原料

出发，设计最佳路线，选择适当的酶，合成所需功能产品的生物分子工程技术：利用生物细

胞大量加工、制造产品的生物生产技术等等。

从生物技术的发展来看现在已经深入到我们社会生产和生活的很多领域里，这是生物学

发展的必然趋势。现代生物技术日益应用到社会生产的各行业中，农业生产中的繁殖控制技

术、动、植物育种、农作物病虫害的综合防治、动物疫病的控制、绿色食品的生产；工业生

产中生物催化制造、生物技术药物和疫苗生产等都广泛的采用了现代生物技术。所以，现代

生物技术的范围已经覆盖了生物类专业的各个领域，对于生命科学类专业的学生，掌握现代

生物技术的原理和实践，具有现代生物技术应用必备的专业理论知识和较熟练的综合技能，

才能成为适应生物技术生产、技术服务及相关专业第一线需要的高技能人才。

本教材正是在上述背景下编写的，旨在提高生命科学类专业学生的生物技术理论知识和

实践技能。本教材以现代生物技术的核心“基因工程技术”为主要内容；以试验设计的整体性,

连贯性为主要出发点；各试验之间即独立又相互联系，前一个实验的结果又是后一个实验的

材料，使学生在掌握基础理论和技术的同时，树立全面、整体的试验观念。其中实验一到实

验十二是核心实验内容，包括了以大肠杆菌为代表的微生物实验技术、基因克隆技术、基因

表达技术和蛋白质研究技术，且各实验相互连续，构成一个整体。后续的实验是现代生物技

术的相关技术，包括动、植物转基因技术，分子标记技术、分子检测技术以及生物信息学研

究方法，可根据专业不同选择开设。

本教材是由新疆农业大学多年从事植物生物技术、动物生物技术的教师共同编写而成，

所有参与教材编写的老师都认真负责的编写各自的章节，为教材保质保量的完成做出了重要

贡献，在此深表感谢。由于现代生物技术的发展十分迅速，编者虽尽力吸收各方面的研究材

料，但限于作者水平，纸漏之处在所难免，希望读者不吝惠予指正。

目录

（实验教材编写分工）

实验一：大肠杆菌液体培养基和固体筛选培养基制备顾爱星

实验二：大肠杆菌工程菌平板培养顾爱星

实验三：PCR扩增目的基因片段葛杰

实验四：回收目的基因片段与载体连接张桦

实验五：大肠杆菌液体培养罗明

实验六：大肠杆菌感受态细胞制备及转化罗明

实验七：筛选重组转化菌落张桦

实验八：菌液PCR分析葛杰

实验九：提取大肠杆菌重组质粒DNA和酶切分析张桦

实验十：培养工程菌诱导外源基因表达王希东

实验十一：蛋白质分离纯化技术王希东

实验十二：SDS检测外源基因的表达王希东

实验一大肠杆菌液体培养基和固体筛选培养基制备

一、实验目的

1.了解培养基制备的基本原理，掌握培养基制备的方法和步骤。

2.了解灭菌的基本原理，学习并掌握实验室常用的灭菌方法。

二、实验原理

1.培养基按物理状态分为：液体、固体、半固体三种。

（1）液体培养基：不含任何凝固剂。

（2）固体培养基：在液体培养基中加入凝固剂，通常L5〜2.0%琼脂，从海藻（石花菜）

中提取得到的多糖，融化温度95℃,凝固温度45℃。

（3）半固体培养基：0.2〜0.7%琼脂，一般观察细菌运动。

2.培养基按成分分为：

（1）复合（天然）培养基：以天然有机物质为主要成分的培养基。采用动植物组织或微

生物细胞或它们的提取物或粗消化产物配制而成。如牛肉膏蛋白月东培养基、LB培养基。

（2）合成培养基：用化学纯的营养物质配制而成。确切知道其中所含营养成分的化学性

质和数量。如高氏1号培养基、察氏培养基。

（3）半合成培养基：用纯化学试剂和天然有机物质配制而成。如马铃薯蔗糖培养基，马

丁氏培养基。

3.灭菌（sterilization）：采用强烈的理化因素使任何物体内外所有的微生物永远丧失其

生长繁殖能力的措施称之为灭菌。

4.高压蒸汽灭菌：在密闭的高压蒸汽灭菌器（锅）中进行。其原理是将待灭菌的物体放

置在盛有适量水的高压蒸汽灭菌锅内。把锅内的水加热煮沸，并把其中原有的冷空气驱尽后

将锅密闭，再继续加热就会使锅内的蒸汽压逐渐上升•，从而温度也随之上升到100C以上。

为达到良好的灭菌效果，一般要求温度应达到121℃（压力为O.IMPa）,时间维持在15~30mino

此法适合于一切微生物学实验室、医疗保健机构和发酵工厂中对培养基及多种器材、物品的

灭菌。

5.火焰灭菌：微生物接种工具如接种环、接种针或其他金属用具等，可直接在酒精灯火

焰上灼烧灭菌。此外，接种过程中，试管或三角瓶口等，也可通过火焰灼烧灭菌。

6.干热灭菌：用干燥热空气杀死微生物的方法。通常将灭菌物品置于鼓风干燥箱内，在

160〜170℃加热1〜2h。玻璃器皿(如吸管、培养皿等)、金属用具等凡不适合用其他方法灭菌

而又能耐高温的物品都可用此法灭菌。但是，培养基、橡胶制品、塑料制品等不能使用干热

灭菌。

三、实验内容

1.配制LB液体培养基、LB固体培养基、氨茉青霉素(ampicillin)溶液。

2.准备无菌培养皿、注射器、针头。

3.培养基及器皿的高压蒸汽灭菌;

四、实验试剂、耗材和用具

双蒸饵水、胰蛋白豚、NaCl、酵母提取物(bacto-yeastextract)、琼脂粉、氨茉青霉素钠

.士rm卜0

试管、三角瓶、培养皿、刻度搪瓷杯、量筒、pH试纸、天平、记号笔、牛皮纸、硅胶塞、

注射器、针头、不锈钢饭盒、纱布、线绳等。

托盘天平、不锈钢锅、电磁炉、煤气灶、铁架、分液漏斗、高压蒸汽灭菌锅。

五、操作步骤

(~)培养基配制

培养基配制的大体流程如下：

药品称量一加水溶解一定容一＞调pH值—分装—塞棉塞―包扎一■灭菌

LB(Luria-Bertani)培养基的配方：

双蒸储水1000mL,胰蛋白月东10g,NaCl10g,酵母提取物(bacto-yeastextract)5g,调

pH值7.0。固体培养基需加入琼脂粉15〜20g。

原料称量根据培养基配方，按实际用量计算后，称取各种试剂放入容器(常用烧杯或不

锈钢锅)中。

1.加热溶解：在容器中加入所需要的水量，然后加热，同时用玻璃棒搅拌至沸腾，将火

调小，至药品完全溶解。在加热过程中应不断搅拌，以防琼脂粉沉淀糊底烧焦，并应控制火

力，以免培养基起泡而溢出容器。待琼脂粉完全融化后，再用热水补足因蒸发而损失的水分。

2.调节pH：检测培养基的pH,若pH偏酸，可滴加Imol/LNaCl(约1mL),边加边搅

拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。

3.过滤：液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布过滤。

4.分装：将配制的固体培养基分装入三角瓶中，每瓶100mL,将液体培养基分装入试管

（液体培养基）中，每管5mL。分装时用三角漏斗连接软橡皮管和玻璃管，以免培养基沾在

瓶口或管口上而造成污染。

5.加棉塞：三角瓶口塞上用普通棉花（非）脱脂棉制作的棉塞，试管口塞上硅胶塞，起

到防止杂菌侵入和有利通气的作用。

6.包扎：加塞后，管装培养基可若干支扎成一捆，将管口或三角瓶的棉塞外包一层牛皮

纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。

在制备培养基的过程中，应注意以下事项：

1.注意培养基分装时避免其沾污三角瓶口、试管口。

2.严格按照高压蒸汽灭菌的灭菌指标（温度、压力、时间）对培养基、器皿灭菌，确保

灭菌彻底。

（二）准备无菌培养皿、注射器、针头

将每6个培养皿同一方向，摞成一叠，用报纸包扎。灭菌后即成无菌培养皿。

用不锈钢饭盒装注射器和针头。

（三）灭菌：将上述培养基和培养皿、注射器、针头于121℃高压蒸汽灭菌20min。如延

误时间，则可能因杂菌繁殖孳生，导致培养基变质而不能使用。若确实不能立即灭菌，可将

培养基暂放在4c冰箱或冰柜中，但时间也不宜过久。

（四）氨苇青霉素溶液制备

溶1g的氨节青霉素钠盐于足量的双蒸储水中，最后定容至10mL。分装成小份于-20C贮

存。常以25gg/mL~50gg/mL的终浓度添加于生长培养基。

灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，使斜面的长

度不超过试管总长l/2o

无菌检查：将灭菌的培养基放入37℃温箱培养24〜48h,无菌生长即可使用。保存时放在

低温、低湿、阴暗而洁净的地方。

六、思考题

1.培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？

2.在配置培养基的操作过程中应注意些什么问题？为什么？

实验二大肠杆菌工程菌平板培养

一、实验目的

1.学习掌握微生物培养的原理和方法。

2.建立纯培养技术中的“无菌概念，学习掌握无菌接种技术。

二、实验原理

消毒（disinfection）：是用较温和的物理或化学方法杀死物体上绝大多数微生物，主要是

病原微生物和有害微生物的营养细胞。

微生物接种技术：是进行微生物实验和相关研究的基本操作技能。包括斜面接种、液体

接种、固体接种和穿刺接种等操作，目的是获得生长良好的纯种微生物。

无菌操作：是微生物接种技术的关键。常使用超净工作台（紫外线杀菌、过滤除菌）、酒

精灯（火焰灼烧灭菌）、75%酒精（化学药剂消毒）。

三、实验内容

L观察、比较、识别大肠杆菌在液体培养基中的特征。

2.每小组制备LB琼脂培养基平板1个（无抗生素）、LB琼脂培养基平板（含氨节青霉素）

2个、LB液体培养基5mL/支试管（无抗生素）、LB液体培养基5mL/支试管（含氨节青霉素）。

3.每人采用平板划线法，培养大肠杆菌单菌落。

四、实验材料和用具

大肠杆菌液体培养物DH5a菌种、LB固体培养基、无菌培养皿、超净工作台、75%消毒

酒精、无菌注射器、无菌针头、0.2Rm微孔滤膜、冰箱、接种环、记号笔、打火机、酒精灯、

恒温培养箱

五、操作步骤

（-）大肠杆菌液体培养物观察

观察大肠杆菌液体培养物的颜色、液体表面、透明度、是否沉淀等。

（-）大肠杆菌平板培养

1.制备平板：蘸取75%酒精的棉球仔细擦手，待干后，将已灭菌、熔化的瓶装LB固体培

养基冷却至55c左右，右手握瓶，在靠近火焰处用左手拔下瓶塞，瓶口通过火焰2〜3次（以

烧去可能附着于瓶口的微生物）后稍微离开火焰，但保持在火焰上方的无菌区域内。左手将

瓶塞夹在右手小指与无名指间（塞进瓶口的一端朝外）。然后左手取平皿，无名指和小指托住

皿底，大拇指和中指夹住皿盖，在火焰上方无菌区内启开皿盖，迅速注入培养基15mL左右,

立即合上皿盖并使皿底均匀铺满培养基。平皿静置于桌上，冷凝即成平板。室温下放置，使

平板表面干燥无水膜，以利于形成单菌落。

2.制备含氨茉青霉素的培养基：使用无菌注射器吸取氨节青霉素溶液，将一张0.2pm微

孔滤膜装入无菌注射器，加上无菌针头，火焰旁打开无菌培养皿盖，加入皿底中央（使终浓

度50pig/mL）,迅速注入培养基15mL左右，立即合上皿盖并慢速转动使氨苇青霉素溶液和培

养基混合均匀。平皿静置于桌上，冷凝即成平板。

将氨苇青霉素溶液加入LB液体培养基试管，使终浓度50gg/mLo

3.画线：画线的方式很多，其目的都是使平板上菌体逐渐变稀，最终能形成单菌落。常

见的有下列两种：

（1）连续画线法：接种环或针头稍弯的接种针火焰灭菌并冷却后，取大肠杆菌菌液，在

平板上作连续画线。

（2）分区画线法：接种环（或针）取样品后，在靠近平皿边缘处的平板上，用接种环前

缘或针尖的弯曲部位接触平板，接种棒与平板成30。〜40。角，画3〜4条平行线。然后转动平皿

约50。角，灼烧接种环（针），冷却后，通过前一区划2〜3条平行线，并继续画2〜3条不通过

前一区的平行线。再转动平皿，如此画4〜5区。

4.培养：室温放置1〜2h,待接种菌液被培养基吸收后，倒置于37c恒温培养箱培养

16~20ho

5.检验：观察微生物菌落，注意选择孤立的菌落，仔细观察菌落的形状、大小、颜色、

光泽、湿润度、隆起度、透明度、边沿形状等特征，抓住微生物的主要特征进行识别。

划线分离时，挑菌量要小，严格无菌操作，避免环境中的杂菌污染。

六、思考题

1.比较各种灭菌、消毒方法的原理及适用范围。

2.使用分区画线法时，为何每次画线后要烧接种环（针）？

实验三PCR扩增目的基因片段

一、实验目的

1.掌握PCR扩增DNA的技术及原理。

2.学习PCR扩增仪的使用。

二、实验原理

聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)是一种体外DNA扩增技术，1985年由

Mullis等人创立。该技术能在儿小时的实验操作中，将人为选定的•段DNA扩增儿百万倍，

具有灵敏度高、特异性强、操作简便和应用广泛等优点，目前已成为分子生物学及基因工程

中极为有用的研究手段，另外在医学研究和医疗诊断中亦体现出极大的应用价值。

PCR的工作原理类似于DNA的体内复制过程，是将待扩增的DNA片断和与其两侧互补

的寡核甘酸链引物经变性、退火及延伸三步反应的多次循环，使特定的DNA片断在数量上

呈指数增加。PCR扩增首先需要一对引物，根据待扩增区域两侧的已知序列合成两个与模板

DNA互补的寡核甘酸作为引物，引物序列将决定扩增片段的特异性和片段长度。反应体系由

模板DNA、一对引物、dNTP、耐高温的DNA聚合酶、酶反应缓冲体系及必须的离子等所组

成。PCR反应循环的第一步为加热变性，使双链模板DNA变性为单链；第二步为复性，每

个引物将与互补的DNA序列杂交；第三步为延伸，在耐高温的DNA聚合酶作用下，以变性

的单链DNA为模板，从引物3'端开始按5'-3'方向合成DNA链。这样经过一个周期的

变性——复性——延伸等三步反应就可以产生倍增的DNA,假设PCR的效率为100%,反复n

周期后，理论上就能扩增2n倍。PCR反应一•般30-40次循环，DNA片段可放大数百万倍。

三、实验内容

常规PCR反应用于已知DNA序列的扩增，变性温度为95℃,复性温度为37c〜55C,

延伸合成温度为72℃,DNA聚合酶为Taq酶(可耐受95℃左右的高温而不失活)，反应循环

数为30o

四、实验材料

1.实验器材

PCR扩增仪，台式高速离心机，移液器，经高压灭菌后的Eppendorf管，电泳仪。

2.实验试剂

(1)模板DNA(0.1gg/|iil)：用牙签挑取单菌落悬浮到50^1的裂解液中(裂解液

1%TritonX-100,20mmol/lTris-HClPH8.2,2mmol/lEDTA),95℃温浴10分钟，lOOOOrpm离

心5分钟，取2位上清液用于总体积50gl的PCR反应。

(2)TaqDNA聚合酶(5U/pl),10、扩增缓冲液,dNTP(lmmol/L)：购买

(3)引物(100pmol/L)：设计并合成与目的DNA两侧互补的引物内。

五、操作步骤

1.准备PCR反应溶液

(1)按以下次序，将下列成分在0.2ml灭菌Eppendorf管内混合：

10x扩增缓冲液5川

4xdNTPs(包括四种dNTP)4川

引物11可

引物21位

模板DNAIgl(lOng)

TaqDNA聚合酶1pl(2.5U)

加水至终体积50^1

(2)用手指轻弹Eppendorf管底部，使溶液混匀。在台式离心机中离心2秒以集中溶液

于管底。

2.PCR扩增反应

将加好样品的Eppendorf管置于PCR扩增仪内，94℃5分钟，使模板DNA完全变性。然

后按94c变性30秒，59℃退火30秒，72c延伸45秒，重复循环35次，循环结束后72℃延

伸10分钟。反应完毕，将样品取出置-4℃待用。

3.实验结果观察

取出样品，进行琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺电泳，溪化乙锭(EB)染色，观察DNA条带。

注意事项：

LPCR体系所加成分的实际用量，应根据实验者选用的该成分的终浓度及所拥有的贮备液

浓度进行核算。

2.加样时要认真，吸头垂直进入试剂管，每加完一样要换一个吸头，同时在已加的样品前做

个记号以防止错加或漏加，避免污染。

3.Taq聚合酶(置于冰盒上)应最后加入，尽量减少室温接触机会。加酶时吸头深入不可

过深，酶量不能过多。

六、讨论与作业

1.PCR结果若出现非特异性的扩增条带，有必要进一步优化反应条件，包括改变退火温

度和时间，调整Mg2+浓度等。

2.PCR反应特异性强，引物浓度、TaqDNA聚合酶和dNTP的量不宜过多。

3.引物设计要合理。一般引物长度为18个~30个核甘酸；引物间的G+C含量应为40%〜

60%,而且避免引物内部产生二级结构；引物3'端不应该互补，避免在PCR反应过程中产

生引物二聚体；避免引物3'端出现3个连续的G或C；理想的情况下，成对引物的G、C

含量应相似以便以相近的退火温度与互补的模板链相结合，止匕外，引物5'端序列对于后续

操作也是十分有用的，例如，对PCR产物进行克隆时，可以考虑在引物5'端引入限制性酶

切位点。

思考题：

影响PCR的因素有哪些？

实验四回收目的基因与载体连接

第一部分目的基因片段的回收

一、实验目的

1.了解回收DNA片段的几种方法及其优缺点

2.掌握胶回收和柱回收法回收目的基因片段

二、实验原理

DNA片段的分离和回收是一项重要的技术，可收集特定PCR产物片段或酶切片段用于

克隆、制备探针等工作。在DNA片段回收实验中有两个最重要的技术指标：一是产物的纯

度，未达标则严重影响以后的酶切、连接、标记等酶参与的反应；二是产物的回收率，回收

率低增大前期的工作量。回收DNA片段的方法很多，理想回收方法应满足以下要求：（1）

回收片段的纯度高，不可带有凝胶；回收过程中加入的物质也要除净；无DNA酶污染等。（2）

可用于大小不同的DNA片段回收。（3）较高的回收效率。（4）操作技术方便、快捷，不需

昂贵的试剂和特殊的仪器设备。目前已有20余种原始或衍生的方法可供选择，纤维素膜电泳

回收法、透析袋电洗脱法、冻融法、玻璃粉法、琼脂糖凝胶法等方法，但还是缺乏高效回收

不同大小DNA的普遍实用方法。实验室一般根据回收片段的大小、现有的试剂与器材、以

及后处理的难易等选择合适的回收方法。很多生物公司开发了不用DNA片段的回收试剂盒,

现在大部分的实验室都采用试剂盒来进行回收。在这些试剂盒中多利用特殊硅基质材料•，在

一定高盐缓冲系统下高效、专一地吸附DNA的原理，配备设计独特的离心吸附柱式结构，

快速高效回收DNA片段。

三、材料与方法

（-）材料

1、实验材料

PCR产物或酶切DNA片段

2、实验试剂

试剂盒，TAE电泳缓冲液，琼脂糖，

3、仪器设备

电泳仪，电泳槽，高速离心机，紫外分析仪，凝胶成像分析系统，微量移液器

（-）方法

1、凝胶回收法

凝胶回收的产率在40%-80%之间，如果目的片段较少，则可能导致回收产物很少。(基本

过程见图示)

溶解股块

I

L

■转移至■»时柱

■潦洗

图：柱回收过程示意图

PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，按TIANGEN普通琼脂糖凝胶DNA回收试

剂盒说明书进行凝胶回收。使用前请仔细阅读说明书，以产品说明书为准。

(1)向吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)加入500卜iL平衡液BL,12000rpm离心

Imino倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(2)紫外灯下仔细切下含待回收DNA的胶条，放入干净的离心管中，称取重量。向胶

块中加入3倍体积的溶胶液PN,50c水浴放置10mine

(3)将所得溶液加入吸附柱CA2中，室温放置2min,12000rpm离心45s,倒掉废液。

(4)向吸附柱CA2中加入700HL漂洗液PW(加入无水乙醇)，12000rpm离心45s,

倒掉废液。

(5)向吸附柱CA2中加入500匹漂洗液PW,12000rpm离心45s,倒掉废液。12000rpm

离心2min,除尽漂洗液PW。

(6)室温放置2min,晾干。

(7)将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空加入适量洗脱缓冲

液EB或无菌水，室温放置2min,12000rpm离心2min收集DNA溶液。可重复一次。

(8)回收得到的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度和纯度。

注意事项：

(1)点样后最好等待1分钟，让样品在加样孔中均匀分散。

(2)紫外灯下切下目的带。胶块要尽可能小，尽量控制在lOOuL,否则影响回收率！

(3)将回收的凝胶切成尽可能小的块，放入EP管中，做好标记。

(4)50℃水浴溶胶，其间偶尔摇动，至胶完全溶解，熔胶要充分。

(5)洗脱时如用水洗脱，要保证其pH值在7.5-8.0之间。

2、PCR产物直接回收法

如果PCR产物只有一条带，可以不用凝胶回收，还直接从PCR反应液回收，这样可以

避免跑胶过程中损失部分PCR产物。

按TIANGEN普通型PCR产物回收试剂盒说明书进行凝胶回收。使用前请仔细阅读说明

书，以产品说明书为准。

(1)柱平衡：向吸附柱(吸附柱放入收集管中)CB2中加入5OOgL平衡液BL,12000rpm

离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2重新放回收集管中。

(2)按PCR反应液的体积，向其中加入5倍体积的结合液PB,充分混匀。

(3)所有溶液加入平衡好的吸附柱CB2中，室温放置2分钟，12000rpm离心30-60秒。

弃废液。

(4)向吸附柱CB2中加入600|.iL漂洗液PW(已加无水乙醇)，12000rpm离心30-60秒,

弃废液。

(5)重复上述步骤一次。

(6)将吸附柱CB2放回收集管中，12000rpm离心2分钟后，将吸附柱CB2置于室温放

置数分钟后，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。

(7)将吸附柱CB2放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置滴加30-50RL洗脱液

EB,室温放置2分钟，12000rpm离心2分钟收集DNA溶液。可重复此步骤一次，每次体积

不少于30gLo

(8)回收得到的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度和纯度。

3、冻融法胶回收DNA片段

此法是利用冻融这一过程破坏凝胶结构，使DNA被释放出来。再用无水乙醇沉淀DNA。

(1)紫外灯下仔细切下含待回收DNA的胶条，将切下的胶条(小于0.6g)捣碎，置于

1.5ml离心管中；

(2)加入等体积的Tris-HCl饱和酚(pH7.6),振荡混匀；

(3)-20℃放置5-10min；

(4)12000rpm离心5min,上层液转移置另一离心管中；

(5)加入1/4体积H20于含胶的离心管中，振荡混匀；

(6)-20℃,放置5-10min；

(7)12000rpm离心5min,合并上清液；

(8)用等体积酚/氯仿、氯仿分别抽提一次，取上清；

(9)加入1/10体积3MNaAc(pH5.2)、2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀；

(10)-20℃,静置30min；

(11)12000rpm,离心lOmin,弃上清，75%乙醇洗沉淀1-2次，晾干；

(12)加适量H20或TE溶解沉淀。

(13)回收得到的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度和纯度。

第二部分目的基因片段与载体连接

一、实验目的:

1.学习T载体的特点和PCR产物的克隆方法。

2.掌握利用T载体克隆PCR产物的方法；复习连接实验流程。

二、实验原理：

普通Taq酶会在3'末端加一个A,这样所有PCR产物都会在双链DNA的3'端均有一个

单链状态的A；T载体是线状DNA片段，在DNA双链的3'端均有一个单链状态的T；二者

在连接酶的作用下连接为一个重组的环状分子，从而达到克隆的目的。如图所示。

HindIII

Sphl

S$d6387l

Pstl

Hinell

Accl

Sall

Ecenv-T-CloningShe

Xb»l

SamH1

S/mil

XmaI

KpnI

SacI

EcoR1

ScaBEST™SequendngPnmerRV-M

GAGCGGATAACAATTTCACACAGG'1一xm*IHine11

SmalAccl.

lacZEcoRI严1叶］匚产IEcoRV"I|/Ml］财1p/nd、

5'GAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATATCGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT

GGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCG3

DigestedbyEcoRV

CAGCACTGACCCTTTTGGGACCGC

BcaBEST™SequencingPrimerM1347

-tctagagatTatcgtcgaccn-.rinninn

•galctctaTlagcagctggVUlOfling

图：pMD18-T载体的结构

此种连接方法是根据普通Taq酶会在3'末端加一个A的原理发明的；注意不同的酶的性

能不同，保真性强的Taq酶会自动切除末端的A,所以，这种酶的扩增产物需要补加A后再

连接。生物公司的T载体试剂盒里附有全套T载体连接转化的说明，基本上按说明书要求进

行即可。

三、材料与方法

（-）材料

1、实验材料

PCR产物或酶切DNA片段

2、实验试剂

T-VectorKIT试剂盒(TAKARA公司),无菌水

3、仪器设备

低温水浴或连接仪，离心机，

(-)方法

(1)在0.5mlEppendorf管加入以下试剂：

目的片段（01ug/ul）3n1

T载体DNA（O.lug/ul）1u1

水1U1

SolutionI（含连接酶和缓冲液）5Hl

总体积10U1

(2)瞬时离心，混合均匀。16℃连接4—16小时，-20储存或直接用于转化。

实验五大肠杆菌液体培养

一、实验目的

1、学习细菌液体培养的方法，了解大肠杆菌的生长特性。

2、为制备大肠杆菌感受态细胞作准备。

二、实验内容

1、掌握无菌操作、接种技术的基本环节。

2、培养获得处于对数生长期的大肠杆菌菌液。

三、实验材料及用具

1、仪器、用品

高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、恒温摇床、恒温培养箱、分光光度计、-70℃冰箱、制

冰机接种环、移液器及吸头、接种环、酒精灯、试管、培养皿、硅胶塞、封口膜等。

2、菌种、试剂

经活化的大肠杆菌（E.coil）DH5a单菌落（实验二）、已灭菌的LB液体培养基5mL/支

试管（无抗生素）和LB液体培养基100mL（无抗生素）、75%酒精等。

四、实验步骤

L操作前，先用75%酒精擦手，待酒精挥发后点燃酒精灯。

2.将长有活化的大肠杆菌（E.coil）DH5a单菌落的培养皿平板握在左手，使有菌种的一

面向上，并处于水平位置。

3.左手拿接种环（如握钢笔一样），在火焰上先将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管

其余部位也过火焰灭菌，此过程重复2次。

4.将灼烧过的接种环伸入培养皿内，接种环在内壁或未长菌落的培养基上接触一下，让

其充分冷却，然后轻轻挑取一个单菌落，再从培养皿内抽出接种环。

5.迅速将沾有菌种的接种环伸入LB液体培养基（5mL/支试管）中，使接种环和管内壁

磨擦儿下以利洗下环上菌体。接种完毕后抽出接种环灼烧管口，塞上棉塞。将试管在手掌中

轻轻敲打，使菌体充分分散。

6.将接种环烧红灭菌。放下接种环，再将棉花塞旋紧。

7.将接种后的液体培养基试管置于恒温摇床上，120r/min震荡培养过夜。

8.取1mL培养液加到100mLLB液体培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养（250r/min）

至OD600=0.5〜0.6（约2.5-3小时）；立即取出冰浴10-15min。

注意事项

1、接种环节应严格进行无菌操作。

2、实验中要注意细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞。一般通过检测

OD600来控制。DH5a菌株OD600为0.5时细胞密度是5X107/ml。OD600值与细胞数之间

的关系随菌株的不同而不同。密度过高或不足均会使转化率下降。菌体密度与震荡培养的转

速密切相关，根据测定的菌液OD值调整培养时间。

3、接种的试管、三角瓶等应做好标记，注明菌种、日期、组别、姓名等。

实验六大肠杆菌感受态细胞制备及转化

一、实验目的

1.学习感受态细胞的基本原理和技术方法。

2.了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。

3.学习将外源质粒DNA转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。

二、实验内容

1.氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞。

2.将外源目的基因导入到大肠杆菌受体菌中。

三、实验材料及用具

L仪器、用品

超净工作台、低温离心机、恒温摇床、恒温培养箱、恒温水浴锅、分光光度计、-70°C冰

箱、制冰机等。

移液器及吸头（50uL、200uL、lOOOuL）、接种环、Ep离心管、涂布器、试管、培养

皿、硅胶塞、封口膜等。

2.菌种、试剂

大肠杆菌（E.coil）DH5a对数期菌液（实验五）、外源基因（实验四）、氨革青霉素溶液、

0.1mol/LCaC12溶液、甘油、LB液体培养基5mL/支试管（加氨苇青霉素）等。

四、实验步骤

1.将大肠杆菌（E.coil）DH5a对数期菌液迅速置于冰上。以下步骤务必在超净工作台和

冰上操作。

2.吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却15min。

3.4C下3000g冷冻离心5分钟。

4.弃去上清，加入100可预冷的0.1mol/LCaCb溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细

胞重新悬浮，在冰上放置20min。

5.4C下3000g冷冻离心5分钟；弃去上清,加入100川预冷mol/L的预冷CaCk溶液,

用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮。

6.将细胞悬液2OO|1L分装到Ep管中，可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15%-20%

甘油）后超低温冷冻贮存备用（-70℃）。

7.取目的DNAlOpL加入以上感受态细胞中，轻轻混匀，置于冰上放置30min。

对照组设置：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，其它操作相同。

8.将感受态细胞于42℃水浴中热休克90S后迅速在冰上放置2min。

9.加入800WLB液体培养基（含氨羊青霉素），37℃,100-150r/min摇

菌培养40~60min.

五、注意事项

1.所有操作均应在无菌条件和冰上进行。

2.所使用的器皿必须经过灭菌。并且要防止迹量的去污剂或其它化学物质、杂菌、DNA

酶或杂DNA所污染，否则会大大降低细菌的转化效率。

3.注意转化的质粒DNA的质量和浓度。转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正

比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，则会使转化率下降。一般DNA溶液的体

积不应超过感受态细胞体积的5%,Ing的cccDNA即可使50ul的感受态细胞达到饱和。以质

粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低，大于30kb的重组质粒将很难进行转化。

此外，重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同

的线性重组质粒高10〜100倍。

4.实验所用的溶液最好用3次蒸储水配制。

六、实验报告

1.试述制备感受态细胞的原理和方法。

2.本实验成功的关键是什么？

实验七筛选重组转化菌落

一、实验目的：

掌握蓝白斑筛选重组转化菌落的原理和方法。

二、实验原理：

阳性克隆的筛选和鉴定可以从DNA、RNA和蛋白质三个不同的层次水平进行。可以利

用载体本身的一些特性，如抗生素抗性基因、插入失活，插入表达、显色法等对重组子进行

初筛。显色法中常用的显色剂是x-gal(5-浪4-氯-3』引躲-B-D-半乳糖昔)。具有完整的乳糖操纵

子的菌体能转译P-半乳糖甘酶、透过酶和乙酰基转移酶，当培养基中存在诱导物IPTG(异丙

基-B-D-半乳糖甘)和x-gal时，可产生蓝色沉淀物，使菌体成为蓝色，如果在载体DNA上组

入lacZ部分缺失的片段lacZS则重组DNA分子转化lacZ，互补型菌株，则非重组质粒在含

有x-gal和IPTG的培养基中得到的转化子是蓝色菌落，而重组质粒得到的转化子是白色菌落。

如图所示：

也就是说质粒载体编码B-半乳糖甘酶N端序列，细菌宿主编码快半乳糖甘酶C端序列。

当将些质粒转化此细菌里，可发生a-互补，在IPTG存在下，表达出完整0-半乳糖甘酶活性,

从而使5-滤4-氯-3』引蛛(X-gal)形成蓝色菌落，而当质粒载体的多克隆位点上插入外源基

因片段，则不能表达B-半乳糖普酶N端序列，从而在转向细菌后不具有快半乳糖苗酶活性，

就不能生成蓝色菌落，表现为大肠杆菌本身的菌落，称为白色菌落。

三、材料与方法

(-)材料

1、实验材料

转化重组质粒的宿主菌:E.coliDH5a,或JM系列等具有a-互补能力的菌株。

2、实验试剂

X-gal储液(20mg/ml):用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mgzm1的储液，包以铝箔或黑

纸以防止受光照被破坏，储存于-20C。

IPTG储液(200mg/ml):在800g1蒸储水中溶解200mgIPTG后，用蒸储水定容至1ml,用

0.22pm滤膜过滤除菌，分装于eppendorf管并储于-20℃。

含X-gal和IPTG的筛选培养基:在事先制备好的含50gg/mlAmp的LB平板表面加40ml

X-gal储液和4M1IPTG储液，用无菌玻棒将溶液涂匀，置于37℃下放置3-4小时，使培养基表面的

液体完全被吸收。

LB培养基或SOB培养基

3、设备和仪器

恒温培养箱、恒温摇床，低温冰箱，超净工作台

(―)方法

(1)每组连接反应转化原液取100可用无菌玻棒均匀涂布于筛选培养基上,37℃下培养半

小时以上，直至液体被完全吸收。

(2)倒置平板于37℃继续培养12-16小时，待出现明显而又未相互重叠的单菌落时拿出

平板。

(3)放于4℃数小时，使显色完全。

(4)用无菌牙签挑取白色单菌落接种于含Amp50解/ml的5mlLB液体培养基中,37℃

下振荡培养12小时。

注意事项：

(1)在含有X-gal和IPTG的筛选培养基上，携带载体DNA的转化子为蓝色菌落，而

携带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落，平板如在37c培养后放于冰箱3-4小时可使显

色反应充分，蓝色菌落明显。不是一开始就4℃,是等菌长出来之后。一般菌长出来就会有

蓝色的了，4℃之后会进一步显色。

(2)当出现蓝斑较大，白斑很小附在周围，还有蓝白镶嵌的斑即卫星菌落的时候，大都

是因为中间菌落的生长可能消耗了培养基周围的Amp,导致了卫星菌落的出现，可以小心挑

取中间的那个菌落，有可能是阳性克隆。要注意培养时间不宜过长，出现阳性菌落就及时处

理，以12-16小时为宜。培养基中加抗生素的时候，温度不能高了，不烫手为宜，防止抗生

素失效。

实验八菌液PCR分析

一、实验目的

掌握菌液PCR分析的技术及原理

二、实验原理

聚合酶链式反应（PCR）是一种体外核酸扩增系统，原理类似DNA分子的天然复制过程,

是将在待扩增的DNA片段和与其两侧互补的两个寡聚核甘酸引物，经变性、退火和延伸若

干个循环后，DNA扩增2n倍。

三、实验材料

1.仪器：摇床、PCR仪、台式离心机、移液器及吸头、PCR薄壁管、电泳仪等

2.试剂：10XPCR缓冲液配制（部分随Taq酶提供）：

250~500mmol/LKC1；100~500mmol/LTris-Cl（pH8.4）；15~20mmol/LMgC12；0.5%

Tween-20；1mg/LBSA

其它试剂：模板DNA、dNTP混合液、Taq聚合酶、上游和下游寡核甘酸引物、琼脂糖

凝胶等。

四、实验操作

1.PCR引物的选择。

选择一个载体上的特异性序列和一个目的基因上的特异性序列作为引物。

2.菌落的处理。

挑取新鲜菌落于含抗性的（LB）培养基中，37c200rpm摇床摇2-4小时以上。用15ml

离心管摇菌，通常加5ml培养基；

3.菌液的处理。

用经灭菌的101H枪头（不用牙签）挑去白色菌落，取l-2ul菌液稀释为100倍体积，沸

水浴10-15min。

4.PCR体系：无特殊要求一般使用25ul或50ul体系。

按以下次序，将下列成分在0.5ml灭菌Eppendorf管内混合：

10义扩增缓冲液5禺

4XdNTPs（包括四种dNTP）4闺

引物11国

引物21国

模板DNAmi(10ng)

TaqDNA聚合酶0.5囚(2.5U)

加水至终体积50国

PCR反应程序

(1)94℃变性5min,(2)94℃变性Imin,(3)55℃退火Imin,(4)72℃延伸Imino(5)重

复(2)-(4)30次。(6)72℃延伸90s。反应完毕，将样品取出置-4C待用。

五、实验结果

取出样品5U1PCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测，观察DNA条带。

说明：

影响PCR的主要因素

1.模板DNA

单链、双链DNA均可作为PCR的模板，DNA样品尽量纯净，不能有核酸酶、蛋白水解

酶等的污染。模板用量依具体实验而定，一般为100ul反应液有105-106个目标分子。PCR

反应时模板变性要充分。

2.PCR引物

PCR引物设计是否成功是能否获得高质量PCR产物最关键的因素之一。在设计和应用时，

需注意以下重要环节：

(1)PCR引物的长度约为15〜30个核甘酸，并且成对引物间的G+C含量应相似。以

使它们在相近的温度下与其互补序列结合。G+C