遗传标记的表征

色素、生理特性、生殖特性、抗病虫性等有关的标记。一、形态标记形态标记能够显示遗传多态性的外部形态。如株高、叶形、育性等。广义形态标记水稻已鉴定出300多个标记基因棉花中已鉴定出160多个突变基因。染色体结构(如缺失、易位、倒位、重复等)二、细胞学标记细胞遗传学标记能够显示遗传多态性的细胞学特征。染色体数量（如单体、缺体、三体、四体）缺一对5A染色体，发育成斯卑尔脱小麦的穗型。普通小麦21对染色体都有其缺体，活力较差和育性较低。5A染色体有抑制斯卑尔脱小麦穗型的基因发现突变型比正常的直果曼陀罗（2n=24=12Ⅱ）多一个染色体（12Ⅱ+l），即11Ⅱ+lⅢ。直果曼陀罗(Daturastramonium)中发现球形蒴果19101920染色体长度、随体和着丝粒，反映染色体的缺失、易位、倒位、重复染色体结构C带、N带、G带等，反映染色体上常染色质与异染色质的分布染色体核型染色体带型

三、生化标记生化标记贮藏蛋白、同工酶等标记种子贮藏蛋白白蛋白球蛋白醇溶蛋白谷蛋白不同植物，4种蛋白含量不同，如水稻、小麦中含有高水平的谷蛋白，玉米中主要是醇溶蛋白豆科作物主要是球蛋白种子贮藏蛋白的电泳分析已广泛用于作物品种鉴别和种子纯度鉴定。聚丙烯酰胺凝胶电泳同工酶（isozyme）具有功能相同而结构和理化性质不同的一类酶等位酶（allozymes）同一基因座上的不同等位基因编码的同工酶共显性四、分子标记（molecularmarker）分子标记以DNA多态性为基础的遗传标记7、检测手段简单快捷；开发和使用成本低。（一）分子标记的特点1、遗传多态性高；2、多数为共显性，信息完整3、在基因组中大量存在且均匀分布4、选择中性5、稳定性、重现性好6、信息量大，分析效率高简称RFLP标记（二）分子标记的类型及原理分子标记技术大体分为四大类1、以DNA-DNA杂交为基础的DNA标记技术（insituhybridization）限制性片段长度多态性标记（Restrictionfragmentlengthpolymorphisms）可变数目串联重复序列标记（Variablenumberoftandemrepeats）简称VNTR标记原位杂交简称ISH2、基于PCR的DNA标记1）单引物PCR标记2）双引物选择性扩增的PCR标记3）通过克隆、测序来构建特殊双引物的PCR标记。

限制性酶切片段的选择性扩增3、基于PCR与限制性内切酶技术相结合的DNA标记分为两类PCR扩增片段的限制性酶切如AFLP如CAPsSinglenucleotidepolymorphism，4、基于单核苷多态性的DNA标记单核苷酸多态性简称SNP用限制性内切酶酶切不同个体的基因组DNA后，含有与探针序列同源的酶切片段在长度上的差异。（三）主要分子标记1、RFLP（RestrictionFragmentLengthpo1ymorpams）限制性片段长度多态性1980，Bostein碱基替换、插入、缺失或重复造成某种限制性内切酶（restrictionenzymes）酶切位点的增加或丧失以及内切酶酶切位点间DNA片段变化基因组DNA序列上的变化（1）RFLP标记的原理（1）RFLP标记的分析步骤单拷贝或寡拷贝RFLP分析探针探针来源cDNA克隆基因组克隆（RandomGenome）PCR克隆

（3）RFLP标记的特点优点①数目几乎无限②共显性③可以利用现有探针，具有种族特异性④RFLP标记遍及全基因组⑥重复性好缺点成本较高;需要许多克隆探针；一个探针只能产生一个多态位点；所需DNA量大(5～15μg)；易造成环境污染随机排列的寡聚脱氧核苷酸单链引物（10个核苷酸）。通过PCR扩增染色体组DNA所获得的长度不同的多态性DNA片段。2、RAPD（RandomAmplificationPolymorphismDNA）RAPD，随机扩增多态性DNA1990,Williams特异性取决于引物与模板DNA结合的特异性。PCR，聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）Mullis等(1985)PCR反应：变性、复性、延伸。RAPD与经典的PCR反应的区别①引物②反应条件③扩增产物AP-PCR（Arbitrarilyprimedpolymerasechainreaction)任意引物PCR引物长度与一般PCR反应中的引物相当开始阶段退火温度较低DAF（DNAamplificationfingerprinting）DNA扩增指纹引物长度比RAPD更短，为5～8个核苷酸DAF复性和延伸常用同一种温度（2）RAPD标记的特点优点1）可检测未知序列的基因组DNA2）引物无种族特异性3）RAPD技术简单4）单个引物可产生几个多态位点5）通过克隆测序可转化成SCARSCAR（SequenceCharacterizedAmplificationRegion）特异序列扩增区域标记缺点1）再现性差2）显性遗传3）存在共迁移问题3、AFLP（AmplifiedFragmentLengthPolymorphisms）扩增片段长度多态性1993，Zabeaumarc和Vospieter是对限制性酶切片段的选择性扩增（1）AFLP标记的原理基因组的DNA进行双酶切人工接头连接PCR反应的引物凝胶电泳AFLP扩增数量由酶切频率较低的限制酶在基因组中的酶切位点数量决定。限制性酶酶切频率较高的限制性酶（frequentcutter），酶切频率较低的限制性酶（rarecutter）产生易于扩增基因组DNA限制扩增模板DNA片段的数量3）选择扩增AFLP分析的基本步骤1）限制性核酸酶双酶切基因组DNA2）DNA片段两端连接上特定的接头(oligonucleotideadapters)6）自显影4）聚丙烯酰胺凝胶电泳5）凝胶转移，干胶处理荧光标记、银染（2）AFLP标记的特点优点

1）数目和种类很多

2）一次PCR反应可检测多个遗传位点3）AFLP分析模板用量少4）分辨率高5）假阳性低，可靠性高6）AFLP标记多数为显性缺点分析成本高DNA的纯度及内切酶质量要求也比较高甲基化敏感酶易产生假假阳性(Variablenumbertandemrepeat)4、SSR（SimpleSequenceRepeat）1987，Nakamura生物基因组内有一种短的重复次数不同的核心序列可变数目串联重复序列简称VNTR小卫星（minisatellites）微卫星（microsatellites）简单重复序列，又称微卫星DNA一类由1—6个碱基组成的基序（motif）串联重复而成的DNA序列如（CA）n、（AT）n、（CC）n、（GATA）nn代表重复次数，其大小在10～60之间DNA复制或修复过程中的分子滑动（slippagereplication）或不等交换所致。微卫星DNA两端的序列是相对保守的单拷贝序列（1）SSR标记的原理根据微卫星DNA两端的单拷贝序列设计一对特异引物，利用PCR技术，扩增每个位点的微卫星DNA序列，通过电泳分析核心序列的长度多态性。⑥凝胶电泳检测建立SSR标记的一般程序①建立基因组DNA的质粒文库②设计并合成探针，筛选重组克隆③阳性克隆DNA插入序列测序④根据SSR两侧序列设计并合成引物⑤PCR扩增2）检测一个单一的多等位基因位点。（2）SSR标记的特点1）数量几乎无限，检测出多态性的频率极高3）多数为共显性标记使用SSR技术的前提是需要知道重复序列两翼的DNA序列。4）重复性高，稳定可靠5）需DNA样品量少，对DNA质量要求亦不苛刻引物设计采用2－4个核苷酸序列为基序（motifs），以其不同重复次数再加上几个非重复的锚定碱基Inter-simplesequencerepeatpolymorphicDNAISSR标记相邻SSR区域内的引物去扩增中间的单拷贝序列用小卫星做探针，与限制性内切酶酶切的基因组DNA杂交，检测其多态性。小卫星（minisatellites）标记核心序列长度为10-60bp常用Southern杂交方法检测共显性遗传5、SCAR（SequenceCharacterizedAmplificationRegion）特异序列扩增区域标记一般步骤RAPD分析克隆片段两端测序设计长为18～24bp的引物PCR扩增检测高的重复性优点6、CAPS（CleavedAmplificationPolymorphismSequence-taggedSite）切割扩增多态序列标签位点技术又称PCR-RFLP基本步骤特定引物PCR扩增PCR扩增产物限制性内切酶酶切酶切产物凝胶电泳检测CAPs标记的优点①引物与限制酶组合非常多②

CAPS标记呈共显性③所需DNA量极少④结果稳定可靠⑤操作简便、快捷指基因组中长度为200—500bp，且核苷酸顺序已知的单拷贝序列，可采用PCR技术将其专一扩增出来。7、STS（Sequence-taggedSites）序列标签位点简称序标位YAC或cosmid插入末端序列引物来源RFLP单拷贝的探针序列微卫星序列表达基因序列很容易在不同组合的遗传图谱间进行标记的转移，且是沟通植物遗传图谱和物理图谱的中介。

8、ESTs（Expressedsequencetags）表达序列标签直接与一个表达基因相关，很易于转变成STS共显性遗传突出优点扩增基因开发阅读框（openreadingframes,ORFs）。引物17-18个碱基，包括13-14个碱基的核心区域（5’的10-11个碱基为填充区，随后正向为CCGG，反向为AATT），核心区域后为3个选择碱基。9、SRAP（Sequence-relatedamplifiedpolymorphism）相关序列扩增多态性SRAP的特点优点1）每一反应可得大量多态位点2）不需克隆任何序列，引物可用于不同生物；3）便利、简单；4）重复性好；5）PCR产物可直接测序。基因组中每隔1000个碱基就存在一单碱基差异。一般通过对PCR产物、基因组文库、表达序列标签（EST）文库测序而获得10、SNP（simplenucleotidepolymorphisms）单核苷酸多态性等位基因遗传密码的单碱基差异。特点：数量大第二节分子标记的应用一、遗传多样性分析AChromosomeMapofTomato二、遗传图谱的构建（一）作图群体的建立1、亲本的选配亲本选择的原则：1）亲本间的DNA多态性丰富；2）亲本纯度高；3）杂交后代可育；2、群体的类型1）F2群体×F1P1P2F22）BC1群体3）RIL群体

RIL（recombinantinbredlines，重组近交系）群体是杂交后代经过多代自交而产生的一种作图群体，通常从F2代开始，采用单粒的方法建立。常自交6-7代。4）DH群体高等植物的单倍体是含有配子染色体的个体。单倍体经过染色体加倍形成的二倍体称为加倍单倍体或双单倍体。5）NIL（near-isogenicline）群体一组遗传背景相同或相近，只在个别区段存在差异的株系，称为近等基因系（Near-isogeneiclinesNIL）。多代回交后自交一次即得回交自交品系。6）F1群体两个杂合亲本杂交产生的复合杂交群体（CP群体），拟测交（Pseudo-testcross）群体。3、群体的大小构建分子标记骨架连锁图可用小群体150单株或家系。1903年，Sutton&Boveri分别提出遗传因子位于染色体上（二）图谱构建的理论基础1、染色体遗传理论染色体理论的基本要点①体细胞的染色体成对存在②每条染色体能保持结构恒定性和遗传连续性；③减数分裂同源染色体相互配对，随后发生分离。连锁图谱构建的理论是染色体的交换和重组。AABB×abababABABabABba重组率可用来表示遗传图距，2、基因重组和连锁理论重组型配子的最大比例为50%，变化0-50%。图距单位用厘摩（centi-Mergan,cM）表示，1cM的大小大致符合1%的重组率。两位点存在连锁(r＜0.5)的概率与不连锁的概率(r=0.5)比

为确定两位点之间存在连锁，一般要求似然比大于1000，即LOD＞3；而否定连锁的存在，则要求似然比小于100，即LOD＜2。2、图谱制作的统计学原理①两点测验L(r)/L(0.5)概率之比可用似然比统计量来表示似然函数L()②多点测验一个位置上所发生的交换会减少其周围另一个单交换的发生。图距x与重组率间的关系当r=0.2时，x=21.2cM。3、交换干涉与作图函数交换干涉干扰的程度可用符合函数C表示。作图函数Kosambi作图含数：（三）DNA标记分离数据的数学处理1、标记基因型数据的获得利用分子对作图群体的个体（株系）进行标记基因型检测。P1P2F112345678910111213141516171819202122BHAAHHAHBAAHHHABHABAHH123456789101112••••••2、分子标记连锁图的构建利用DNA标记数据，通过作图软件构建连锁图谱。

MAPMKER/EXE3.0

MapmangerQTX20

Joinmap（渝棉1号×T586）F2:7群体3、连锁图谱构建实例（四）DNA标记连锁图谱的完善1、DNA标记的染色体定位形态标记

非整倍体、染色体结构变异原位杂交

2、饱和DNA标记连锁图谱的制作遗传图谱的饱和度指单位长度染色体上已定位的标记数染色体连锁框架图的标记间的平均间隔在不大于20cM；主基因定位标记间的平均间隔在10-20cM；一般QTL定位标记间的平均间隔在10cM以下；基因克隆标记间的平均间隔在1cM以下。一种物种的DNA标记对另一物种进行遗传和物理作图三、比较作图（comparativemapping）比较作图比较作图可揭示不同物种基因组或基因组区域同线性或共线性。比较作图的分子基础物种间DNA序列尤其编码序列的保守性四、基因定位（一）质量性状的基因定位1、近等基因系分析2、分离群体分组混合分析

控制数量性状的基因（二）数量性状的基因定位数量性状的基因座（quantitativetraitloci,QTL）检验同一标记不同基因型间数量性状均值的差异1、QTL定位的统计方法（1）基于标记的分析方法1）均值差检测法若差异显著，则表明标记与QTL连锁。将个体的数量性状表型值对单个标记或多个标记的基因型进行回归分析2）性状标记回归法用被检QTL两侧相邻的连锁标记来推测个体QTL的取值概率。3）性状-QTL回归法将个体的数量性状表型值对假设存在的某个或某些QTL的基因型进行回归分析。区间作图法（intervalmapping）Lander&Bostein(1989)提出用被检区间以外的部分或全部标记作为回归模型中的余因子来消除其他QTL或遗传背景的影响。4）性状-QTL-标记回归法复合区间作图（compositeintervalmapping）多区间作图（multipleintervalmapping）（2）基于性状的分析方法1）分离群体分群分析法

1

11170

12135

131480

14215

15710

CMS育性恢复基因的分子标记2）选择性基因型分析法2、QTL定位软件

Mapmaker/QTL1.0

MapManagerQTX

QTLCartographer

WindowsCartographer

MapQTL3、QTL定位实例1）近等基因系QTLsassociate