版中国药典卫生学检验培训 版《中国药典》微生物检查法

2021年版?中国药典?微生物

检查法别小琳四川省食品药品检验所2021年4月主要内容一、中国药典2021年版微生物限度检查法增修订内容简介二、培养基适用性实验的实施与操作三、白色念珠菌的检查四、微生物限度检查方法验证试验五、微生物限度检查面临的问题(一)中国药典2021年版微生物限度检查法增修订内容简介

中国药典20

10年版框架(卫)中国药典2021年版框架(卫)无菌检查法微生物限度检查法灭菌法抑菌效力检查法指导原那么药品微生物检验替代方法验证指导原那么微生物限度检查法应用指导原那么药品微生物实验室标准指导原那么2021年版微生物限度检查法修订

2021年版?中国药典?微生物限度检查法附录XIIIC〔一部〕附录XIJ〔二部〕引入培养基适用性实验增加白色念珠菌检查法贴膏剂检查方法的改进限度标准表示方法改变2021年版微生物限度检查法修订1、附录107页，微生物限度检查法供试品检查时，如果使用了外表活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物〔的生长和存活无影响〕无毒性。除另有规定外，本检查法中细菌及控制菌培养温度为30～35℃；霉菌、酵母菌培养温度为23～28℃〔；控制菌培养温度为35～37℃〕。检验结果以1g、1ml、10g、10ml、10cm2为单位报告，特殊品种可以最小包装单位报告。2021年版微生物限度检查法修订2、附录107页，检验量除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml；〔中药〕膜剂为〔50〕100cm2；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加20g或20ml〔其中10g或10ml用于阳性对照试验〕。2021年版微生物限度检查法修订3、附录107页，膜剂供试品取供试品〔50〕100cm2，剪碎，加〔50ml或〕100ml的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液〔必要时可增加稀释液〕，浸泡，振摇，作为1∶10〔或1∶20〕的供试液。2021年版微生物限度检查法修订4、附录108页，新增：贴膏剂供试品取规定量供试品，去掉贴剂的保护层，放置在无菌玻璃或塑料片上，粘贴面朝上。用适宜的无菌多孔材料〔如无菌纱布〕覆盖贴剂的粘贴面以防止贴剂粘贴在一起。然后将其置于适宜体积并含有灭活剂〔如聚山梨酯80或卵磷脂〕的稀释剂中，用力振荡至少30分钟，或以其他方法制备成供试液。5、附录108页，修订：离心沉淀法取一定量供试液，500转/别离心3分钟，取全部上清液混合。用于细菌检查。6、附录108页，增加：计数培养基的适用性检查2021年版微生物限度检查法修订7、附录109页，增加：表1常见干扰物的中和剂或灭活方法干扰物可选用的中和剂或灭活方法戊二醛亚硫酸氢纳酚类、乙醇、吸附物稀释剂醛类稀释剂、甘氨酸、硫代硫酸盐季铵类化合物（QACs）、对羟基苯甲酸酯、卵磷脂、聚山梨醇酯汞类制剂亚硫酸氢纳、巯基乙酸盐、硫代硫酸盐双胍类化合物卵磷脂碘酒、洗必泰类聚山梨醇酯卤化物硫代硫酸盐乙二胺四乙酸（EDTA）镁或钙离子磺胺类对氨基苯甲酸ß-内酰胺类抗生素ß-内酰胺酶2021年版微生物限度检查法修订8、附录109页，增加：假设没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用，那么验证试验中微生物回收的失败可看成是因供试品的抗菌活性引起的，同时说明该供试品不能被试验菌污染。然而，供试品也可能仅对试验用菌株具有抑制作用，而对其他菌株没有抑制作用。因此，根据供试品须符合的微生物限度标准和菌数报告规那么，在不影响检验结果判断的前提下，应采用能使微生物生长的更高稀释级的供试液进行方法验证试验。假设验证试验符合要求，应以该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液进行供试品检验。计数方法验证时，假设采用上述计数方法总存在一株或多株试验菌的回收率达不到要求，那么选择回收情况最接近要求的方法和试验条件进行供试品的检测。2021年版微生物限度检查法修订9、附录109页，修订：供试品检查〔法〕〔取按验证的方法制备的均匀供试液，〕按计数方法的验证试验确认的程序进行供试液制备。用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释成1∶10、1∶102、1∶103等稀释级。1.平皿法〔采用平皿法进行菌数测定时，应取适宜的连续2～3个稀释级的供试液。〕2021年版微生物限度检查法修订10、附录109页，修订：培养和计数除另有规定外，细菌培养〔48小时〕3天，逐日点计菌落数，一般以〔48小时〕3天的菌落数报告；霉菌、酵母菌培养〔72小时〕5天，逐日点计菌落数，一般以〔72小时〕5天的菌落数报告；必要时，可适当延长培养时间至〔5～〕7天进行菌落计数并报告。2021年版微生物限度检查法修订11、附录109页，修订：菌数报告规那么细菌、酵母菌宜选取〔细菌、酵母菌平均菌落数在30～300之间〕小于300cfu、霉菌宜选取平均菌落数〔在30～100之间〕小于100cfu的稀释级，作为菌数报告〔取两位有效数字〕的依据。以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告1g、1mL或10cm2供试品中所含的菌数。2021年版微生物限度检查法修订12、附录109页，修订：薄膜过滤法采用薄膜过滤法，滤膜孔径应不大于0.45μm，直径〔约〕一般为50mm，假设采用其它直径的滤膜，冲洗量应进行相应的调整。……总冲洗量不得超过1000ml(每片滤膜的总过滤量不宜过大)，以防止滤膜上的微生物受损伤。13、附录110页，增加：控制菌检查用培养基适用性检查2021年版微生物限度检查法修订14、附录111页，修订：控制菌检查方法的验证删除阴性菌对照组15、附录113页，修订：梭菌上述2份供试液直接或处理后分别接种至100ml的〔0.1%新鲜庖肉〕梭菌增菌培养基中，〔各培养基管在〕置厌氧条件下培养〔72～96〕48小时。〔如试验管不出现浑浊、产气、消化碎肉、臭气等现象，判供试品未检出梭菌；否那么，应取上述每一培养物0.2ml，分别涂抹接种于含庆大霉素的哥伦比亚琼脂培养基平板上，在置厌氧条件下培养48～72小时。16、附录111页，增加：白色念珠菌的检查二、培养基适用性实验的实施与操作1.计数培养基的适用性检查〔一〕应用范围;细菌、霉菌及酵母菌计数用的培养基应进行培养基的适用性检查，包括成品培养基、由脱水培养基或按培养基处方配制的培养基均应检查。〔二〕菌种及菌液制备验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代〔从菌种保存中心获得的冷冻枯燥菌种为第0代〕，并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。大肠埃希菌〔Escherichiacoli〕〔CMCC〔B〕44102〕金黄色葡萄球菌〔Staphylococcusaureus〕〔CMCC〔B〕26003〕枯草芽孢杆菌〔Bacillussubtilis〕〔CMCC〔B〕63501〕白色念珠菌〔Candidaalbicans〕〔CMCC〔F〕98001〕黑曲霉〔Aspergillusniger〕〔CMCC〔F〕98003〕菌液制备同微生物限度检查方法学验证二、培养基适用性实验的实施与操作〔三〕操作营养琼脂培养基玫瑰红钠琼脂培养基酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用相应的对照培养基同法操作对照培养基：由中检所研制并分发〔四)结果判定被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落平均数的70%，且菌落大小形态一致二、培养基适用性实验的实施与操作2、控制菌检查用培养基适用性检查控制菌检查用的培养基应进行培养基的适用性检查，成品培养基、由脱水培养基或按培养基处方配制的培养基均应检查。检查工程包括培养基的促生长、指示和抑制特性能力。菌种对试验菌种的要求同计数培养基的适用性检查。大肠埃希菌〔Escherichiacoli〕〔CMCC〔B〕44102〕金黄色葡萄球菌〔Staphylococcusaureus〕〔CMCC〔B〕26003〕乙型副伤寒沙门菌〔SalmonellaparatyphiB〕〔CMCC〔B〕50094〕铜绿假单胞菌〔Pseudomonasaeruginosa〕〔CMCC〔B〕10104〕生孢梭菌〔Clostridiumsporogenes〕〔CMCC〔B〕64941〕白色念珠菌〔Candidaalbicans〕〔CMCC〔F〕98001〕二、培养基适用性实验的实施与操作增菌培养基促生长能力检查：分别接种不大于100cfu的试验菌〔见表2〕于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好。固体培养基促生长能力检查：取试验菌各0.1ml〔50～100cfu〕分别涂布于被检培养基和对照培养基平板中，每种培养基平行制备2个平皿，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养，计数。被检培养基的菌落数与对照培养基菌落数相比应不小于70%，且生长的菌落形态应一致。培养基抑制能力检查：划线接种试验菌〔见表2〕于被检培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度和时间下培养，试验菌应不得生长。培养基指示能力检查：分别接种少量试验菌〔见表2〕于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度和时间下培养。被检培养基中试验菌生长的菌落形态、大小、指示剂反响情况等应与对照培养基一致。控制菌检查培养基特性试验菌株大肠埃希菌胆盐乳糖培养基促生长能力大肠埃希菌抑制能力金黄色葡萄球菌MUG培养基促生长能力+指示能力大肠埃希菌曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂促生长能力+指示能力大肠埃希菌大肠菌群乳糖胆盐发酵培养基促生长能力大肠埃希菌抑制能力金黄色葡萄球菌乳糖发酵培养基促生长能力+指示能力大肠埃希菌曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂促生长能力+指示能力大肠埃希菌沙门菌营养肉汤促生长能力乙型付伤寒沙门菌四硫磺酸钠亮绿培养基促生长能力乙型付伤寒沙门菌抑制能力金黄色葡萄球菌胆盐硫乳琼脂或沙门、志贺氏属琼脂促生长能力+指示能力乙型付伤寒沙门菌曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂促生长能力+指示能力乙型付伤寒沙门菌铜绿假单胞菌胆盐乳糖培养基促生长能力铜绿假单胞菌抑制能力金黄色葡萄球菌溴化十六烷基三甲铵琼脂促生长能力铜绿假单胞菌抑制能力大肠埃希菌绿脓菌素测定用培养基促生长能力+指示能力铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌亚碲酸盐肉汤培养基促生长能力金黄色葡萄球菌抑制能力大肠埃希菌卵黄氯化钠琼脂培养基或甘露醇盐琼脂促生长能力+指示能力金黄色葡萄球菌抑制能力大肠埃希菌梭菌梭菌增菌培养基促生长能力生孢梭菌哥伦比亚琼脂促生长能力生孢梭菌白色念珠菌沙氏葡萄糖肉汤促生长能力白色念珠菌沙氏葡萄糖琼脂促生长能力+指示能力白色念珠菌念珠菌显色培养基促生长能力+指示能力白色念珠菌抑制能力大肠埃希菌吐温80玉米琼脂培养物促生长能力+指示能力白色念珠菌21三、白色念珠菌的检查

取供试液10ml〔相当于供试品1g、1ml、10cm2〕直接或处理后接种至适量〔不少于100ml〕的沙氏葡萄糖肉汤培养基中，培养24～48小时。取上述培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，培养24～48小时〔必要时延长至72小时〕。白色念珠菌在沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的菌落呈乳白色偶见淡黄色，外表光滑有浓酵母气味，培养时间稍久那么菌落增大，颜色变深、质地变硬或有皱摺。假设平板上无菌落生长或生长的菌落与上述菌落形态特征不符，判供试品未检出白色念珠菌。如平板上生长的菌落与上述菌落形态特征相符或疑似，应挑选2～3个菌落分别接种至念珠菌显色培养基平板上，培养24～48小时〔必要时延长至72小时〕。假设平板上无绿色或翠绿色的菌落生长，判供试品未检出白色念珠菌。假设平板上生长的菌落为绿色或翠绿色，挑取相符或疑似的菌落接种于1%吐温80玉米琼脂培养基上，培养24～48小时。取培养物进行染色，镜检及芽管试验。芽管试验挑取1%吐温80玉米琼脂培养基上的培养物，接种于加有一滴血清的载玻片上，盖上盖玻片，置湿润的平皿内，置35～37℃、1～3h，置显微镜下观察，可见到由孢子长出短小芽管。假设上述疑似菌为非革兰阳性菌，显微镜未见厚膜孢子、假菌丝、芽管，判供试品未检出白色念珠菌。四、微生物限度检查方法验证试验关于方法验证?中国药典?2005版首次引入方法验证要求；?中国药典?2021版无菌检查法和微生物限度检查法延续了2005版方法验证要求；?中国药典?2021版?微生物限度检查法应用指导原那么?〔一部附录XVIIIF、二部附录XIXP〕第五条。关于方法验证为什么验证?验证什么?怎么验证?何时验证？什么时候验证？当建立药品的……方法时，应进行……方法的验证；假设药品的组分或原检验条件发生改变时，检查方法应重新验证。怎么验证1.验证思路〔1〕选择敏感菌株间接方法——文献、技术资料〔可靠〕直接方法——预实验及体外抑菌实验参考选择：一般中药选择枯草和金葡；一般抗生素根据抗菌谱选择。选择敏感菌株药物名称生产企业大肠金葡枯草白念黑曲抗栓再造丸辽宁华鑫药业有限公司100454610095更年安胶囊福州金象中药药业有限公司87954110091清热安宫丸江西国药药业有限公司88141510092通宣理肺丸广东阳江制药厂10059100

100100肝德志胶囊四川省通阳制药厂936441100100宁心安神胶囊广西南宁万士达制药厂100<70<70100100防癌胶囊北京北卫药业有限公司3552<7010081肠胃舒胶囊北京北卫药业有限公司73224710086骨络通酒北京北卫药业有限公司10076110092消渴丸北京北卫药业有限公司9316710088鼻渊丸武汉中联药业集团公司80051100100陀螺银屑胶囊烟台中洲制药厂100<70<70100100冠心丹参胶囊内蒙古自治区包头制药厂8900100100龟龄集山西广誉远园药业有限公司100<70<70100100肚痛健胃整肠丸香港康恩堂制药厂83<70<70100100冠心丹参胶囊长春海王生物制药有限公司100<70<70100100糖尿乐胶囊哈尔滨中药六厂有限公司100<70<70100100降糖宁胶囊通化茂祥制药有限公司100<70<70100100温胃舒胶囊江苏聚荣制药有限公司<70<70<70100100

怎么验证〔2〕验证方法的选择由简到繁、由易到难根据药品的理化性质选择适宜的方法怎么验证〔3〕验证尽可能做到标准化操作，使操作简便、结果重现性好。菌液制备及放置时间常规法和培养基稀释法操作本卷须知薄膜过滤法操作本卷须知验证以后怎么办？无菌检查：进行供试品无菌检查时，所采用的检查方法和检验条件应与验证的方法相同。微生物限度：检查时，按已验证的计数方法进行供试品的细菌、霉菌酵母菌菌数的测定；供试品的控制菌检查应按已验证的方法进行，增菌培养基的实际用量同控制菌检查方法的验证。检验方法的各论化！方法验证实验工作的完善和开展一方面以验证实验为手段和契机，充分完善和细化我国无菌和微生物限度检查方法，建立起完备的SOP体系。另一方面集中力量尽快完成我国数以千计的品种的检验方法的初步验证实验，并收集、整理、分析已有验证资料，指出各品种验证实验的开展方向。通过方法验证促进我国药品微生物检验工作全面开展。五、微生物限度检查面临的问题

1、技术现状与标准化1〕培养基培养基质量标准。固体培养基的灵敏度、专属性玫瑰红钠琼脂培养基的专属性当染菌较多时，玫瑰红钠琼脂培养基生长大量的细菌，给结果判断带来困难。玫瑰红钠琼脂培养基的专属性以中检所玫瑰红钠琼脂培养基〔批号：050428〕与营养琼脂培养基〔批号：050523〕比较，参加50～100cfu阳性菌在相同条件培养观察，见下表9：

大肠铜绿金葡枯草营养琼脂培养基35℃培养48hrs75819179玫瑰红钠琼脂培养基35℃培养48hrs574700玫瑰红钠琼脂培养基25℃培养72hrs454100玫瑰红钠琼脂培养基专属性实验结果1、技术现状与标准化2〕、自动化程度低，仍然依赖大量的人工以方法验证为根底，引入更为便捷的供试品前处理技术，标准供试品前处理有条件的地方可以考虑引入自动稀释、自动接种、仪器判读结果等设备和技术3〕、75mm薄膜过滤器的研制征对我国中成药品种多、情况复杂,已开发研制的75mm薄膜过滤器在目前的验证工作中发挥了重要作用。3、微生物限度检查的几个问题原料药的微生物标准问题；药材原粉的界定问题；含豆豉、神曲等发酵成分的中成药制剂标准问题；纯化水微生物限度检查问题；原料药的微生物标准问题原料药是药品生产过程中引入微生物污染的重要来源之一，虽然一些药品在生产过程或终产品阶段可以采取一些灭菌措施杀灭污染微生物，但可能因为由此引入的死菌体、毒素等无法消除而危害患者，而原料药过高的微生物荷载可能直接挑战一些灭菌措施的有效性，造成灭菌失败，使药品存在更大的平安隐患。所以世界各国药典均规定应对原料药进行微生物检查，以消除或控制其对药品引入的微生物污染。在严格执行药品GMP的前提下，国外药典更为重视原料药的微生物检查，尤其是对一些非灭菌制剂，甚至仅仅对原料药有微生物限度控制要求，而对制剂没有强制要求。中国药典2005版参考了国外药典的这一开展趋势，对于化学药品的片剂、胶囊剂、颗粒剂等6个主要口服制剂在各论和制剂通那么中均未做微生物限度检查的强制要求，仅在附录中做出通用性要求，但很多企业不清楚这一变化的背景和两个必要前提，即严格的原料药微生物控制和严格的GMP管理，从而放松了对这些产品的微生物控制，可能会存在潜在风险。中国药典规定，对药品原辅料药的微生物检查参照相应用途的药品进行，即用于非灭菌制剂生产的原料药应按相应